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大鼠冷藏保存供肝時間對肝移植后炎癥因子的影響

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目的是考察大鼠冷藏保存供肝時間對肝移植后炎癥因子的影響。方法是將大鼠隨機分為2組，3小時保存組和6小時保存組，觀察不同冷藏保存時間對大鼠肝移植后的炎癥因子水平。結果是兩個組別移植后30分鐘的NF～α和IL～8均明顯增高（P＜0.05），與3小時保存組相比，6小時保存組移植后10～30分鐘的NF～α和IL～8水平較低（P＜0.05），3小時保存組的生存中位數(shù)為93.1小時（42.1小時～5天），6小時保存組的生存中位數(shù)為32.5小時（1.0～49.4小時），與3小時保存組相比，6小時保存組大鼠的生存時間明顯縮短（P＜0.05）。結論：冷凍保存供肝時間越長，炎癥因子水平越高，提示冷凍供肝后應及時進行肝移植。

肝移植；冷藏保存；炎癥因子

冷凍保存供肝是肝移植臨床采用的主要保存方法，但手術對保存時間有較大爭議，因此考察冷凍保存供肝對于肝移植具有重要意義［1～3］。本課題以大鼠為研究對象，考察冷凍保存時間對肝移植的炎性反應及對大鼠生存時間的影響。

1　材料和方法

（1）實驗動物。SPF級雄性大鼠50只，180～220g，清潔環(huán)境飼養(yǎng)，根據(jù)供體肝在體外低溫保存時間隨機分為2個組別：3小時保存組和6小時保存組。

（2）實驗步驟。所有動物術前過夜禁食，不禁水，在無菌操作臺下，乙醚吸入麻醉，腹部橫切，游離肝周圍韌帶，結扎左隔靜脈、右腎上腺靜脈叢、右腎靜脈幽門靜脈與肝動脈。將支架插入膽總管，手術線固定，肝下下腔靜脈注入肝素平衡液1.0mL和0℃的UW液3mL，從肝門靜脈灌洗肝臟，剪斷肝上下腔靜脈，游離肝并切除左葉和尾葉，將肝置于0℃的UW液，修剪肝下下腔靜脈，安置門靜脈與肝下下腔靜脈袖套5～0線固定。再將供肝保存在50mL0～4℃UW液，受體肝切除，在供肝門靜脈注入15mL乳酸鈉平衡液，排出供肝內(nèi)UW液，肝上下腔靜脈置8～0無損傷縫線結扎受體肝下下腔和門靜脈，從門靜脈入肝方向注入0.9％氯化鈉注射液3mL，血管夾阻斷肝上下腔靜脈，切去肝臟，放入供肝，采用袖套法吻合門靜脈和肝下下腔，松開血管鉗，大鼠的空肝期10分鐘，移植術后尾靜脈注射青霉素，保溫毯飼養(yǎng)。

（3）觀察指標。檢測移植后30分鐘內(nèi)大鼠外周血的腫瘤壞死因子～（TNF～）和白細胞介素～8（IL～8）水平，并進行組間和組內(nèi)比較。

（4）統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)輸入SPSS18.0軟件統(tǒng)計報，計量資料采用x±s表示，并用方差分析，P＜0.05差異有顯著性意義。

2　結果

（1）兩個組別移植后的炎癥因子比較。兩個組別移植后30分鐘的NF～α和IL～8均明顯增高（P＜0.05），與3小時保存組比，6小時保存組移植后10～30分鐘的NF～α和IL～8水平較低（P＜0.05）。可參見表1。

表1　兩個組別移植后炎癥因子比較（pg/mg）

（2）兩個組別的生存中位數(shù)比較。3小時保存組的生存中位數(shù)為93.1小時（42.1小時～5天），6小時保存組的生存中位數(shù)為32.5小時（1.0～49.4小時），與3小時保存組比，6小時保存組大鼠的生存時間明顯縮短（P＜0.05）。

3　討論

肝臟是移植免疫較為特殊的器官，與其他器官移植比，肝移植排斥的發(fā)生率最低，原因在于肝臟的免疫耐受，但缺血再灌注損傷是造成移植失敗的主要原因，缺血再灌注期時的氧自由基可激活核轉(zhuǎn)錄因子，激活的核轉(zhuǎn)錄因子可促進TNF～α和IL～8等炎癥因子大量增加，引起肝組織中損傷，損傷的肝又可產(chǎn)生自由基，上述炎癥因子水平增高而加重炎癥，導致肝損害，進而影響肝移植效果。

研究顯示，再灌注損傷會隨著冷保存時間的延長而加重，本課題結果顯示，短時間（3小時）保存再移植后，30分鐘內(nèi)的炎癥因子TNF～α和IL～8水平與長時間（6小時）組相比明顯降低，但兩個組別移植后30分鐘內(nèi)均存在炎癥因子水平增高的過程，也提示了再灌注的炎性反應。另外一方面，大鼠的生存時間也與冷凍保存時間相關，保存時間短的組別生存時間也明顯延長，本課題結果與文獻結果相似，Miyagawa等人研究顯示，體外低溫保存16小時的存活率是體外保存24小時的7倍，Yu等人研究，體外低溫保存8小時大鼠的存活率是9小時組的2倍以上，可見，體外保存時間對肝移植的效果影響較大，建議為了提高肝移植成功率，供體肝應盡早進行移植術。

本課題的不足為，大鼠的肝移植后生存時間較短，一定程度影響了系統(tǒng)評估冷凍保存供肝對肝移植效果，因此有必要選擇耐受性較好的犬或豬進行，增加炎癥因子或免疫蛋白表達的檢測，進一步分析和推算冷凍保存的時間窗。

［1］胡振華.肝切除與補救性肝移植治療肝細胞肝癌的研究與進展［D］.浙江大學，2012.

［2］譚凱.成人首次肝移植術后早期死亡的相關因素分析［D］.南方醫(yī)科大學，2012.

［3］熊日暉.不同熱缺血時間對大鼠心臟死亡中度脂肪肝肝移植影響的實驗研究［D］.福建醫(yī)科大學，2014.

［4］冉江華，李鑄，劉靜，等.二袖套法建立恒河猴原位肝移植的穩(wěn)定模型［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（05）：762～768.［5］葉明.肝移植受體預后多因素分析臨床研究［D］.浙江大學，2004.

［6］陳瀅.再次肝移植患者術后生存率及預后影響因素分析［D］.浙江大學，2013.

［7］易慧敏，安玉玲，張彤，等.內(nèi)毒素血癥及炎癥因子在肝肺綜合征中的作用及其在肝移植術后的變化［J］.器官移植，2013，4（06）：350～353+376.