劉　杰，向燕茹，丁嘉瑜，梁僑麗

（南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇南京210023）

青錢柳抑制α-葡萄糖苷酶有效成分篩選及其對Ⅱ型糖尿病小鼠血糖的影響

劉杰，向燕茹，丁嘉瑜，梁僑麗*

（南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇南京210023）

研究青錢柳（Cyclocaryapaliurus（Batal.）Ijinskaja）抑制α-葡萄糖苷酶有效成分及其對正常小鼠糖耐量的改善和對Ⅱ型糖尿病小鼠的空腹血糖（FBG）、血清總膽固醇（TC）和總甘油三酯（TG）的影響。用聚酰胺柱富集青錢柳醇提取物中總黃酮和總三萜，用水提醇沉法和sevag法制備青錢柳總多糖；以阿卡波糖為對照體外檢測各組分對α-葡萄糖苷酶的抑制作用；通過STZ聯(lián)合高糖高脂飼料誘導Ⅱ型糖尿病小鼠模型，分不同劑量組給青錢柳總黃酮（CPF），四周后檢測各生化指標。結果表明：富集后CPF中黃酮含量達到55.66%，對α-葡萄糖苷酶有很好的抑制作用，其IC50值60.477mg/L接近阿卡波糖的IC50值58.608mg/L；能明顯改善正常小鼠糖耐量，降低餐后血糖；能降低糖尿病小鼠的FBG、TC、TG。CPF能抑制α-葡萄糖苷酶活性，降低糖尿病小鼠的血糖。

總黃酮，α-葡萄糖苷酶，Ⅱ型糖尿病，空腹血糖

糖尿?。―M）是全球范圍內(nèi)主要的、嚴重的疾病之一，是一種以高血糖為主要特征的多因子代謝紊亂疾病，其中Ⅱ型糖尿病占糖尿病總人數(shù)的90%以上，是由于胰島素分泌不足、胰島素抵抗或兩者兼而有之引起的代謝綜合征［1］。餐后高血糖的控制被認為是一種主要的Ⅱ型糖尿病的治療策略，通過抑制碳水化合物水解酶α-葡萄糖苷酶的活性能夠推遲葡萄糖的釋放而實現(xiàn)這一目標。α-葡萄糖苷酶是能水解存在非還原末端的α-葡萄糖苷鍵的酶的總稱，又叫α-D-葡萄糖苷水解酶，其是水解食物中多糖及二糖的常見酶，主要分布在小腸上皮絨毛膜刷狀沿上。α-葡萄糖苷酶抑制劑能通過競爭性抑制α-葡萄糖苷酶的作用來減少糖類的水解，延緩糖類的吸收，從而有效地降低糖尿病人餐后血糖濃度峰值，達到控制血糖的目的［2］。

青錢柳（Cyclocaryapaliurus（Batal.）Ijinskaja）又名青錢李（江西）、一串錢（湖北）等，系雙子葉植物綱（Dicotyledoneae）胡桃科（Juglandaceae）青錢柳屬（CyclocaryaIljinsk.）植物［3］。《中國中藥志要》記載，其樹皮、樹葉具有清熱解毒、止痛功能，可用于治療頑癬。長期以來民間用其葉片做茶，其味甜兼有清熱解暑、降壓、降糖等保健功效［4］。青錢柳的現(xiàn)代研究表明青錢柳葉富含大量黃酮、三萜和多糖，其醇提物或水提物具有顯著的降血糖、降血壓和降血脂作用；并且證實青錢柳多糖具有確切的降血糖作用，而三萜類和黃酮類是否具有降血糖作用有待研究［5］。本文主要研究青錢柳中具有抑制α-葡萄糖苷酶活性的部位及其降血糖功效。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

青錢柳江西九龍山青錢柳開發(fā)有限公司；阿卡波糖德國拜耳公司；α-葡萄糖苷酶試劑盒上海源葉生物科技有限公司；ICR雄性SPF級小鼠（18～22g） 揚州大學比較醫(yī)學中心；鏈脲佐菌素（STZ）美國Sigma公司；TC、TG試劑盒北京北化康泰臨床試劑有限公司；高糖高脂飼料（豬油10%、蔗糖20%、膽固醇2.5%、膽酸鈉1%、基礎飼料66.5%）、普通飼料揚州大學比較醫(yī)學中心；其余試劑均為分析純。

血糖儀強生（上海）醫(yī)療器材有限公司；752紫外分光光度計上海光譜儀器有限公司制造。

1.2實驗方法

1.2.1青錢柳總黃酮（CPF）、總三萜和總多糖的制備

稱取青錢柳干燥粗葉（帶莖）0.8kg，12倍體積75%乙醇90℃回流提取3次，第1次2h，第2、3次均1h，趁熱過濾，回收乙醇得乙醇提取物干浸膏90g。稱取醇提物干浸膏10.0g，用20g聚酰胺拌樣裝入140g聚酰胺柱（30～60目）中（柱體積750mL）。在前期預實驗基礎上，依次用水、40%乙醇、50%乙醇、80%乙醇洗脫各10個柱體積，合并40%乙醇洗脫部分和50%乙醇洗脫部分前5個柱體積得總三萜部分，合并50%乙醇部分后5個柱體積和80%乙醇部分得總黃酮部分。以蘆丁為對照采用硝酸鋁法［6］測定總黃酮含量，以羊毛甾醇為對照采用高氯酸-香草醛比色法［7］測定總三萜的含量。將醇提后所剩葉渣晾干，加10倍體積水同法回流提取3次，濃縮至醇含量為75%，靜置2d，過濾，濾渣揮干，稱重得粗多糖20.5g。稱取14.5g粗多糖，采用Sevag法［8］制得多糖8.3g。以葡萄糖為對照采用苯酚-硫酸法［9］測定總多糖含量。

1.2.2體外α-葡萄糖苷酶抑制實驗實驗分為空白組，阿卡波糖、總黃酮、總三萜、總多糖不同濃度組（各不同濃度組濃度分別為250、125、62.50、31.25、 15.63、7.81、0mg/L）。按文獻［10］方法在405nm處測定吸光度。酶活性抑制率公式如下：

其中，A陰性對照即各組分含量為0mg/L時的吸光度。

1.2.3正常小鼠糖耐量實驗ICR雄性小鼠適應性飼養(yǎng)2～3d，隨機分為蔗糖組、蔗糖+CPF、蔗糖+阿卡波糖組、淀粉組、淀粉+CPF組、淀粉+阿卡波糖組，每組6只。實驗前小鼠空腹20h，按實驗分組灌胃，以0.9%生理鹽水做空白，淀粉、蔗糖劑量均為3g/kg，CPF劑量為600mg/kg，阿卡波糖劑量為20mg/kg。各組動物灌胃后0、30、60、90、120min尾部取血，用強生血糖儀測量各時間點的血糖值［11］。

1.2.4CPF對STZ誘導的糖尿病小鼠的降糖作用

1.2.4.1Ⅱ型糖尿病小鼠模型的建立及實驗分組70只ICR雄性小鼠分籠適應性喂養(yǎng)1周，室溫（22±3）℃，相對濕度50%±20%。隨機抽取10只ICR小鼠作為空白組給予普通飼料喂養(yǎng)，剩余小鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)。4周后，禁食8h，空白組小鼠給予pH4.4檸檬酸緩沖液150mg/kg腹腔注射一次，高糖高脂飲食組小鼠給予STZ溶液（pH4.4檸檬酸緩沖液配制）150mg/kg腹腔注射一次，繼續(xù)用同樣的飼料喂養(yǎng)各組。STZ注射1周后小鼠尾靜脈取血，測定血糖值，選取血糖水平＞11.1mmol/L的小鼠40只，隨機分為模型組（0.5% CMC-Na溶液，灌胃劑量為0.2mL/10g）、陽性對照組（二甲雙胍150mg/kg）、CPF高劑量組（1g/kg）、CPF中劑量組（500mg/kg）、CPF低劑量組（250mg/kg）。各組每天灌胃給藥一次，連續(xù)給藥四周［12］。

1.2.4.2測定方法空腹血糖（FBG）測定：給藥0、2、4周末對小鼠禁食不禁水8h后尾部取血，采用強生血糖儀測定空腹血糖。

血脂指標的測定：給藥四周后小鼠眼眶取血，4℃、4000r/min離心10min，分離血清，參照試劑盒測定血清中總膽固醇（TC）和總甘油三酯（TG）的含量。

1.2.5統(tǒng)計分析采用GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以mean±SEM表示，兩兩均數(shù)比較使用t檢驗，p＜0.05認為具有顯著性差異。

2　結果與分析

2.1α-葡萄糖苷酶抑制實驗

采用聚酰胺柱富集得到的總黃酮和總三萜含量分別為55.66%和24.44%；水提醇沉聯(lián)合sevag法得到的總多糖的含量為32.43%。體外實驗分別檢測了總黃酮、總三萜和總多糖對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用。從表1可知，總三萜和總多糖對α-葡萄糖苷酶抑制率很小，且不隨其含量變化發(fā)生明顯改變，說明總三萜和總多糖對α-葡萄糖苷酶沒有抑制作用或抑制作用很弱?？傸S酮對α-葡萄糖苷酶有很好的抑制作用，并且根據(jù)回歸分析求得CPF的IC50值為60.477mg/L，阿卡波糖的IC50值為58.608mg/L，兩者IC50值接近，說明CPF對α-葡萄糖苷酶的抑制強度與阿卡波糖相當。

2.2CPF對正常小鼠糖耐量影響

從表2可知，在糖耐量實驗中，單獨灌胃蔗糖或淀粉后，小鼠餐后血糖濃度均升高，并在灌胃后的60min時達到最大值，分別為5.8830mmol/L和4.3630mmol/L，在同時灌胃阿卡波糖或CPF后，小鼠血糖都明顯降低；與蔗糖組比較，蔗糖+CPF組在灌胃后30、60、90、120min的降糖作用顯著增強（p＜0.01）；與淀粉組比較，淀粉+CPF組在灌胃后30、60、90min的降糖作用同樣明顯更強（p＜0.05），但在灌胃后的120min時，兩者的降糖作用沒有顯著性差異。該實驗說明了CPF能顯著降低多糖和寡糖引起的小鼠餐后血糖。

表1　青錢柳總黃酮、總三萜和總多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Table 1　α-glucosidase inhibition of CPF，total triterpenes and total polysaccharides

圖1　CPF對糖尿病小鼠血糖的影響（n=8）Fig.1　The effect of CPF on FBG of diabetic mice（n=8）

圖2　CPF對糖尿病小鼠TC和TG的影響（n=8）Fig.2　The effect of CPF on TC and TG of diabetic mice（n=8）

表2　CPF對正常小鼠糖耐量的影響（n=6）Table 2　The effect of CPF on OGTT in normal mice（n=6）

2.3CPF對STZ誘導的糖尿病小鼠的降糖作用

2.3.1CPF對STZ誘導的糖尿病小鼠FBG的影響從圖1可知，未給藥前（即給藥0周），小鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)四周后再注射STZ一周，檢測各組的小鼠血糖值，都達到了實驗要求（＞11.1mmol/L）。從給藥2、4周數(shù)據(jù)可以看出，CPF不同劑量組對糖尿病小鼠的血糖有明顯的降低作用（p＜0.05）；并且不同的劑量降血糖幅度不一樣，順序依次為高劑量組＞中劑量組＞低劑量組；而且給藥4周后高劑量組與中劑量組或低劑量組比較，降糖作用明顯更強（p＜0.01），表現(xiàn)了一定的劑量依賴性。

2.3.2CPF對STZ誘導的糖尿病小鼠TC和TG的影響為了進一步評價CPF對Ⅱ型糖尿病小鼠的降糖作用，檢測了小鼠血清中與Ⅱ型糖尿病相關的脂代謝指標。圖2結果顯示，高劑量組能顯著（p＜0.05）降低糖尿病小鼠血清中TG和TC的含量，中劑量組能降低糖尿病小鼠血清中的TC含量（p＜0.05）；但是，以上兩組降TG和TC的程度很小，高劑量組分別降低了3.16%的TG和3.28%的TC，而中劑量組僅降低了2.73%的TC。

3　結論

目前已從青錢柳中分離得到70多種化合物，其結構類型主要為黃酮、三萜、多糖和有機酸等。本實驗通過聚酰胺柱色譜從青錢柳中篩選出了α-葡萄糖苷酶的抑制組分CPF，CPF中黃酮含量達到55.66%，能明顯抑制α-葡萄糖苷酶，其IC50值60.477mg/L幾乎等同阿卡波糖的IC50值58.608mg/L；能顯著（p＜0.05）降低正常小鼠的餐后血糖；顯著下調（p＜0.05）Ⅱ糖尿病小鼠的血糖濃度；能降低糖尿病小鼠的脂代謝指標TC和TG。青錢柳既做為藥物又作為食物在我國已有悠久的歷史，本實驗研究表明，將CPF開發(fā)成藥品或保健品具有廣闊的市場前景，其相對于磺酰脲類降糖藥物，雙胍類降糖藥物及其他α-葡萄糖苷酶抑制劑如阿卡波糖等具有毒副作用小、作用溫和、資源豐富的優(yōu)點，正符合現(xiàn)代人們追求的天然無毒副作用理念。

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Screening the active fraction from Cyclocaryapaliurus（Batal.）Ijinskaja which inhibits α-glucosidase and study its effects on hyperglycemia in mice with typeⅡdiabetes mellitus

LIU Jie，XIANG Yan-ru，DING Jia-yu，LIANG Qiao-li*
（School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China）

The active fraction of Cyclocaryapaliurus（Batal.）Ijinskaja which inhibited α-glucosidase were screened，and studied its effects on hyperglycemiainmice with typeⅡdiabetes mellitus.Column chromatography techniques were applied to isolate the total flavonoids and the total triterpenes.The preparation of total polysaccharides employed water extracting-alcohol precipitating and sevag method.The activity of inhibiting α-glucosidase was evaluated compared with acarbose in vitro.The oral glucose tolerance test（OGTT）in normal mice was applied to estimate the affection on postprandial blood sugar of total flavonoids from Cyclocaryapaliurus（CPF）. The model of typeⅡ diabetes mellitus was established by treating the mice with high-fat diet（HFD）and streptozotocin（STZ）.CPF was administered orally at different doses to the diabetic mice.Fasting blood glucose（FBG），total glycerin（TG），total cholesterol（TC）were evaluated in normal and diabetic mice after four weeks.The concentration of total flavonoids from Cyclocaryapaliurus was 55.66%，it significantly inhibited glycosidic enzyme activityand its IC50value of 60.477mg/L approached acarbose’s IC50value of 58.608mg/L. CPF markedly improved OGTT of normal mice and reduced FBG，TC and TG in mice with typeⅡ diabetes mellitus.Hypoglycemic effect of Cyclocaryapaliurus associated with glycosidic enzyme inhibitory activity of flavonoids.

CPF；hypoglycemic；α-glucosidase；FBG

TS252.1

A

1002-0306（2015）14-0363-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.066

2014－12－03

劉杰（1989-），男，碩士研究生，研究方向：中藥化學。

梁僑麗（1970-），女，副教授，研究方向：中藥活性成分研究。

國家自然科學基金資助項目（81173515）。