姜　　寧，劉曉鵬，，*，張俊霞，江亞?wèn)|，丁振國(guó)，李　　力

（1.湖北民族學(xué)院生科院，湖北恩施445000；2.南京醫(yī)藥股份股份有限公司，博士后工作站，江蘇南京210012；3.南京同仁堂洪澤中藥材科技有限公司，江蘇洪澤223200）

Box-Behnken設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化連錢(qián)草多糖提取工藝

姜寧1，劉曉鵬1，2，*，張俊霞1，江亞?wèn)|3，丁振國(guó)3，李力2

（1.湖北民族學(xué)院生科院，湖北恩施445000；2.南京醫(yī)藥股份股份有限公司，博士后工作站，江蘇南京210012；3.南京同仁堂洪澤中藥材科技有限公司，江蘇洪澤223200）

對(duì)連錢(qián)草多糖進(jìn)行提取，并通過(guò)單因素及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)提取的四個(gè)因素：pH、液固比、提取溫度和提取時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：當(dāng)提取工藝為pH7.2、液固比33∶1（mL/g）、提取溫度89℃、提取時(shí)間160min時(shí)，多糖提取率最高，可達(dá)3.40%±0.05%，與理論值3.39%接近。此研究為連錢(qián)草多糖的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。

連錢(qián)草，Box-Behnken設(shè)計(jì)，效應(yīng)面法，多糖，提取

連錢(qián)草為唇形科活血丹屬植物活血丹［Glechoma longituba（Nakai）Kupr.］干燥地上部分，曬干；或鮮用。連錢(qián)草性味涼辛，微苦，微寒。歸肝、腎、膀胱經(jīng)［1］，具有降血糖［2］、利尿利膽［3］、抑菌［4］等功效。臨床上主要用于利小便，治療膀胱結(jié)石、腎結(jié)石、輸尿管結(jié)石、腎炎水腫、濕熱黃疸、膽囊炎、膽石癥、腮腺炎、燒傷等［5］。我國(guó)連錢(qián)草資源豐富，除西北、內(nèi)蒙古外，各地均有栽培。

研究表明植物多糖尤其是藥用植物多糖具有抗氧化［6］、免疫調(diào)節(jié)［7］、抗腫瘤［8］、抗炎［9］等功能，但目前對(duì)連錢(qián)草化學(xué)成分的研究主要集中在有機(jī)酸［10］、生物堿［11］、苷［12］、黃酮［13］、揮發(fā)油［14］等方面，尚無(wú)連錢(qián)草多糖研究的報(bào)道。本研究采用響應(yīng)面分析優(yōu)化了熱水浴提取連錢(qián)草多糖的工藝，以期為連錢(qián)草這一傳統(tǒng)中藥的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

連錢(qián)草南京同仁堂洪澤中藥材科技有限公司提供，經(jīng)劉曉鵬副教授鑒定為唇形科活血丹屬植物活血丹［Glechoma longituba（Nakai）Kupr.］；葡萄糖、無(wú)水乙醇、蒽酮、硫酸分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RT-02A型多功能粉碎機(jī)弘荃機(jī)械企業(yè)有限公司；BECKMAN COUCTER型離心機(jī)美國(guó)BECKMAN公司；HHS型恒溫水浴鍋上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1連錢(qián)草多糖的提取將連錢(qián)草60℃烘干、粉碎，過(guò)60目篩。稱取一定量的連錢(qián)草粉末，加適量的一定pH的緩沖液，水浴提取。將浸提液離心（8000r/min，20min），將無(wú)水乙醇緩緩加入上清液中，邊加邊攪拌，使乙醇終濃度為80%。將醇沉液離心（8000r/min，20min），將入蒸餾水溶解沉淀。按多糖溶液∶三氯甲烷∶正丁醇三者體積比25∶5∶1混合，振蕩20min，離心（8000r/min，20min）。蒽酮-濃硫酸法［15］測(cè)上清液中的多糖，按下列公式計(jì)算提取率：

式中：c為測(cè)定樣液的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為提取體積（mL）；m為連錢(qián)草質(zhì)量（mg）。

1.2.2單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1pH對(duì)連錢(qián)草多糖提取的影響稱取一定量的連錢(qián)草粉末，在液固比30∶1（mL/g）、水浴溫度90℃和提取時(shí)間120min下，分別以pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0緩沖液提取多糖，考察不同pH對(duì)連錢(qián)草多糖提取的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.2.2液固比對(duì)連錢(qián)草多糖提取的影響稱取一定量的連錢(qián)草粉末，加入pH7.0的緩沖液，90℃水浴，提取120min，分別按液固比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g），考察不同液固比對(duì)連錢(qián)草多糖提取的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.2.3提取溫度對(duì)連錢(qián)草多糖提取的影響稱取一定量的連錢(qián)草粉末，按液固比30∶1（mL/g）加入pH7.0的緩沖液，分別置于60、70、80、90、98℃水浴，提取時(shí)間均為120min，考察不同溫度下連錢(qián)草多糖提取率的變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.2.4提取時(shí)間對(duì)連錢(qián)草多糖提取的影響稱取一定量的連錢(qián)草粉末，于pH7.0、液固比30∶1（mL/g），提取溫度90℃條件下分別提取60、90、120、150、180min，計(jì)算多糖提取率，以考察不同提取時(shí)間對(duì)連錢(qián)草多糖提取的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.3Box-Behnken實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以pH、液固比、提取溫度和提取時(shí)間為自變量，多糖提取率為響應(yīng)值優(yōu)化連錢(qián)草多糖的提取工藝。實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　因素水平表Table 1　Levels and factors table

1.2.4數(shù)據(jù)分析單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（SE）表示，組間差異比較采用Tukey實(shí)驗(yàn)。Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析采用Design-Expert 8.0軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1pH對(duì)連錢(qián)草多糖提取的影響不同pH對(duì)連錢(qián)草多糖提取的影響如圖1所示。由圖1可以得知：當(dāng)提取液的pH為7.0時(shí)，連錢(qián)草多糖的提取率最高，并與其他pH條件時(shí)的提取率差異極顯著（p＜0.01）。說(shuō)明連錢(qián)草多糖在pH7.0時(shí)，溶解性及穩(wěn)定性最好，過(guò)酸過(guò)堿的提取條件可能會(huì)降低連錢(qián)草多糖的溶解性能或增加其水解。

圖1　pH對(duì)多糖提取率的影響Fig.1　Effect of pH on polysaccharides yield

2.1.2液固比對(duì)連錢(qián)草多糖提取的影響不同液固比會(huì)顯著影響連錢(qián)草多糖的提取率（圖2）。隨著液固比的增加，提取率隨之增加，當(dāng)液固比達(dá)到30∶1（mL/g）時(shí)，提取率的增加不再顯著（p＞0.05），當(dāng)液固比為50∶1（mL/g）時(shí)，多糖的提取率反而有所下降。這是因?yàn)殡S著液固比增加，多糖的溶出會(huì)增加，但過(guò)大的液固比會(huì)使后續(xù)操作體積過(guò)大從而增加損耗，反而使提取率下降。

圖2　液固比對(duì)多糖提取率的影響Fig.2　Effect of liquid-solid ratio on polysaccharides yield

2.1.3提取溫度對(duì)連錢(qián)草多糖提取的影響如圖3所示，提取溫度對(duì)連錢(qián)草多糖提取有著顯著影響。提取溫度為98℃時(shí)提取率最高，但與90℃水浴提取相比，差異不顯著（p＞0.05）。這可能是因?yàn)樘岣邷囟葧?huì)使植物細(xì)胞內(nèi)的多糖溶出增加，但過(guò)高的溫度會(huì)增加多糖的降解。

2.1.4提取時(shí)間對(duì)連錢(qián)草多糖提取的影響如圖4所示，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，連錢(qián)草多糖的提取率也顯著增加，但當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到150min后，提取率的增加不再顯著。這是因?yàn)殡S著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，連錢(qián)草多糖溶出增加，細(xì)胞內(nèi)外的多糖濃度梯度降低，最終達(dá)到平衡，溶出的多糖不再顯著增加。

圖3　提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on polysaccharides yield

圖4　提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.4　Effect of extraction time on polysaccharides yield

表2　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Results of Box-Behnken experiment

表3　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3　ANOVA of Box-Behnken experiment results

2.2Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1回歸模型的建立和檢驗(yàn)表2為Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。采用Design-Expert 8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，建立了四元二次回歸方程：

R=3.32+0.13A+0.13B-0.10C+0.09D-0.01AB-0.09AC+0.14AD+0.068BC+0.15BD+0.04CD-0.28A2-0.26B2-0.30C2-0.26D2。

該模型的決定系數(shù)R2為0.9564，校正后的R2為0.9128。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。從中可以得知：模型顯著p＜0.0001，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型與實(shí)際情況擬合較好。根據(jù)F值，各因素對(duì)響應(yīng)值影響大小的順序?yàn)锽＞A＞C＞D。除AB、BC、CD外，其余因子對(duì)提取率的影響均顯著，故可將AB、BC、CD從回歸方程中刪除，因此，最終的回歸方程為R=3.32+0.13A+0.13B-0.10C+0.09D-0.09AC+0.14AD+ 0.15BD-0.28A2-0.26B2-0.30C2-0.26D2。

2.2.2兩因素間的交互作用作用顯著的兩因素間的交互作用如圖5～圖7所示，三組圖直觀地反應(yīng)了當(dāng)其他兩個(gè)因素處于最佳水平時(shí)，pH與提取溫度、pH與提取時(shí)間和液固比與提取時(shí)間的交互作用對(duì)連錢(qián)草多糖提取率的影響。

圖5為液固比為33.3∶1（mL/g）、提取時(shí)間為160.2min時(shí)，提取液pH和提取溫度對(duì)多糖得率的影響。從圖5可以看出，當(dāng)pH和提取溫度都處于低水平時(shí)，提取率很低，隨著二者的上升，提取率急劇上升，當(dāng)pH和提取溫度分別在7.0～7.5和85～90℃范圍內(nèi)時(shí)，提取率最高。

圖5　pH和提取溫度交互作用對(duì)多糖提取率的影響Fig.5　Interactive effects of pH and extraction temperature on polysaccharides yield

圖6表示的是當(dāng)液固比33.3∶1（mL/g）、提取溫度89.2℃時(shí)，pH和提取時(shí)間的交互作用對(duì)多糖提取率的影響。如圖6所示，pH和提取時(shí)間的增大會(huì)顯著提高連錢(qián)草多糖的得率，當(dāng)pH在7.0～7.5之間、提取時(shí)間在150～180min范圍時(shí)，多糖的得率達(dá)到最大值。

圖6　pH和提取時(shí)間交互作用對(duì)多糖提取率的影響Fig.6　Interactive effects of pH and extraction time on polysaccharides yield

當(dāng)pH7.17，提取溫度89.2℃時(shí)，液固比和提取時(shí)間交互作用對(duì)多糖產(chǎn)量的影響如圖7所示。當(dāng)液固比較小、提取時(shí)間較短時(shí)，多糖產(chǎn)量較低，隨著液固比的加大、提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖產(chǎn)量顯著增加。當(dāng)液固比處于30∶1～40∶1（mL/g）、提取時(shí)間150～180min時(shí)，多糖產(chǎn)量最高。

2.2.3最佳工藝優(yōu)化及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)根據(jù)建立的回歸方程進(jìn)行各因素的優(yōu)化，得到當(dāng)A=0.34、B=0.33、C= -0.16、D=0.34時(shí)，R有極大值3.39%。即當(dāng)連錢(qián)草多糖提取條件為pH7.17、液固比33.3∶1（mL/g）、提取溫度89.2℃、提取時(shí)間160.2min時(shí)，多糖得率可達(dá)3.39%。為了方便操作，提取工藝被確定為pH7.2、液固比33∶1（mL/g）、提取溫度89℃以及提取時(shí)間為160min。對(duì)優(yōu)化的工藝進(jìn)行三次驗(yàn)證，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，三次的多糖提取率分別為3.26%±0.05%、3.52%±0.08%、3.41%±0.038%，平均提取率為3.40%±0.05%，說(shuō)明建立的回歸模型有較好的預(yù)測(cè)性，優(yōu)化的工藝對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有很好的指導(dǎo)作用。

圖7　液固比和提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.7　Interactive effects of liquid-solid ratio and extraction time on polysaccharides yield

3　結(jié)論

pH、液固比、提取溫度和提取時(shí)間是影響多糖提取的四個(gè)重要因素，為了研究這四個(gè)因素對(duì)連錢(qián)草多糖提取率的影響，先進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)。得出提取連錢(qián)草多糖的最佳工藝是pH7.2、液固比33∶1（mL/g）、提取溫度89℃、提取時(shí)間160min，并對(duì)該工藝進(jìn)行了驗(yàn)證，連錢(qián)草多糖的提取率可達(dá)3.40%±0.05%。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（2010版）一部［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

［2］袁春玲，王佩琪，郭偉英．連錢(qián)草的降血糖作用及其機(jī)制研究［J］．中藥藥理與臨床，2008，24（3）：57-58．

［3］胡萬(wàn)春，郭宇，喻曉潔.連錢(qián)草和金錢(qián)草利尿利膽活性篩選與比較實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007（增刊）：234.

［4］陶勇，石米揚(yáng).連錢(qián)草的抑菌活性研究［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31（10）：824-825.

［5］宋銳，張?jiān)?，叢曉東，等.連錢(qián)草的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（12）：2511-2514.

［6］賈琳斐，郭姣，李清宇，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化海紅果水溶性多糖提取工藝及抗氧化活性的研究［J］.食品工業(yè)科技，2014，35（10）：252-257.

［7］Li Y，Hu Y，Shi S，et al.Evaluation of antioxidant and immunoenhancingactivitiesofPurslanepolysaccharidesingastric cancer rats［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2014，68（1）：113-116.

［8］Shen H，Tang G，Zeng G，et al.Purification and characterization of an antitumor polysaccharide from Portulaca oleracea L.［J］. Carbohydrate Polymers，2013 93（1）：395-400.

［9］Batista J A，Dias EGN，Brito TV，et al.Polysaccharide isolated from Agardhiella ramosissima：Chemical structure and antiinflammation activity［J］.Carbohydrate Polymers，2014，99（1）：59-67.

［10］Kim JP，Song SB，Lee IS，et al.Anti-inflammatory activity of constituentsfromGlechomahederaceavar.longituba［J］. Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，2011，21（11）：3483-3487.

［11］Kumarasamy Y，Cox PJ，Jaspars M，et al.Isolation，structureelucidation and biological activity of hederacine A and B，two unique alkaloids from Glechoma hederaceae［J］.Tetrahedron，2003，59（34）：6403-6407.

［12］Yamauchi H，Kakuda R，Yaotta Y，et al.Two New Glycosides from the Whole Plants of Glechoma hederacea L.［J］.Chemical& Pharmceutical Bulletin，2007，55（2）：346-347.

［13］楊念云，段金廒，李萍，等.連錢(qián)草中的黃酮類(lèi)化學(xué)成分［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，36（3）：210-212.

［14］樊鈺虎，周剛，張璐，等．連錢(qián)草揮發(fā)油化學(xué)成分的氣相色譜-質(zhì)譜分析．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（13）：41-44.

［15］郭曉蕾，朱思潮，翟旭峰，等.硫酸蒽酮法與硫酸苯酚法測(cè)定靈芝多糖含量比較［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，28（9）：2000-2002.

Optimization of extraction process of polysaccharides from Glechoma longituba by Box-Behnken design-response surface method

JIANG Ning1，LIU Xiao-peng1，2，*，ZHANG Jun-xia1，JIANG Ya-dong3，DING Zhen-guo3，LI Li2
（1.School of Biological Science and Technology，Hubei Institute for Nationalities，Enshi 445000，China；2.Postdoctoral Research Station，Nanjing Medical Co.，Ltd.，Nanjing，Nanjing 210012，China；3.Nanjing Tongrentang Hongze Chinese Herbal Science&Technology Co.，Ltd.，Hongze 223200，China）

Polysaccharides from Glechoma longituba were extracted in the present study，and four factors including pH，liquid-solid ratio，extraction temperature and time were optimized by univariate tests and response surface methodology.The results showed that the highest yield of polysaccharides extracted from Glechoma longituba reached 3.40%±0.05%when the process was pH7.2，liquid-solid ratio 33∶1（mL/g），temperature 89℃ and extraction time 160min.This research might provide a theoretical basis for the further development and utilization.

Glechoma longituba；Box-Behnken design；response surface method；polysaccharides；extraction

TS201.1

B

1002-0306（2015）14-0279-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.056

2014－09－12

姜寧（1968-），女，在讀博士，副教授，研究方向：生物工程。

劉曉鵬（1971-），男，博士，副教授，研究方向：生物工程。

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAI04B04）；江蘇省“企業(yè)博士后集聚計(jì)劃”項(xiàng)目（2011033）；2013年湖北省戰(zhàn)略性新興（支柱）產(chǎn)業(yè)人才培養(yǎng)（生物工程）項(xiàng)目。