蘇日娜，張美莉

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

響應面優(yōu)化水提取燕麥抗真菌蛋白的研究

蘇日娜，張美莉*

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

以裸燕麥籽粒為原料，利用水提取燕麥蛋白中的抗真菌蛋白（antifungal protein），用打孔法觀察并測量抑菌圈直徑，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，應用響應面分析法，探討提取時間、提取溫度、pH以及液料比對燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響，確定燕麥抗真菌蛋白的最佳水提工藝。實驗結(jié)果：當提取時間12h，提取溫度30℃，pH7.5，液料比12∶1mL/g時，抑菌圈直徑達到最大為18.10mm。

燕麥，抗真菌蛋白，水提取法，響應面分析法

植物病害是病原真菌侵染所引致的［1］。真菌病害會導致糧食作物減產(chǎn)，經(jīng)濟作物品質(zhì)降低。然而，在長期生長進化的過程中，高等植物其自身常產(chǎn)生一些物質(zhì)來與外源侵襲物對抗，抗真菌蛋白就是其中的一類，他們可以抑制真菌生長或殺死真菌。一些學者發(fā)現(xiàn)抗真菌蛋白還具有抑制HIV病毒反轉(zhuǎn)錄的功能［2-3］?？拐婢鞍卓梢宰鳛樘烊皇称贩栏瘎瑧{借其抗菌性強、安全、無毒等特點受到廣泛關(guān)注［4］。因此從食源性材料中提取抗真菌蛋白是未來研制天然食品防腐劑的一個趨勢。目前，已經(jīng)從多種食源性材料中提取到抗真菌蛋白，如苦蕎、黑麥、豌豆、蘿卜、香蕉等［5-9］，但是關(guān)于燕麥中提取抗真菌蛋白從未報道。

燕麥，又被稱為莜麥、玉麥、雀麥、鈴鐺麥，其蛋白質(zhì)含量在所有谷物中最高［10］。燕麥蛋白質(zhì)含有18種氨基酸，其必需氨基酸組成合理、全面，特別含有谷物類普遍缺乏的氨基酸，含量高達約0.68g/100g，是大米和小麥的2倍以上，是其他糧食作物所不及的。相關(guān)研究表明燕麥同時具有降血脂、降血糖、免疫增強、抗氧化、益生等多種保健功能［11-13］。本實驗以裸燕麥為原料，利用水提取法，研究在水提取過程中抑真菌活性的變化，確定水提取燕麥抗真菌蛋白的最佳工藝條件，以期為深入加工、開發(fā)燕麥蛋白資源提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

裸燕麥籽粒吉林白城農(nóng)科院提供；鏈格孢菌內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院植物病害與保護實驗室保藏；無水乙醚國藥集團化學試劑有限公司，分析純；G-250考馬斯亮藍北京金銳林有限公司；牛血清白蛋白北京金銳林有限公司。

HH-6型電子恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司；PB-10型酸度計美國賽多利斯公司；真空冷凍干燥機北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；粉碎機浙江高鑫工貿(mào)有限公司；SIGMA 3-18k型高速冷凍離心機德國SIGMA公司；超凈臺北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；SPX-80BSH-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1燕麥抗真菌蛋白樣品制備工藝流程裸燕麥籽粒→粉碎→過80目篩→索式抽提脫脂→自然干燥（12h）→加入超純水→攪拌浸提→4℃、10000r/min離心10min→取上清液→冷凍干燥→燕麥水提取蛋白凍干粉。

1.2.2燕麥抗真菌蛋白水提取法單因素實驗設(shè)計

1.2.2.1提取時間對燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響準確稱取5g脫脂燕麥粉，加入50mL超純水，調(diào)節(jié)pH到7.0，在30℃水浴分別攪拌浸提8、10、12、14、16h，測量樣品的抑菌圈直徑。

1.2.2.2提取溫度對燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響準確稱取5g脫脂燕麥粉，加入50mL超純水，調(diào)節(jié)pH到7.0，分別在20、25、30、35、40℃的水浴中攪拌浸提12h，測量樣品的抑菌圈直徑。

1.2.2.3pH對燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響準確稱取5g脫脂燕麥粉，加入50mL超純水，調(diào)節(jié)pH到6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，在30℃水浴中攪拌浸提12h，測量樣品的抑菌圈直徑。

1.2.2.4液料比對燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響準確稱取5g脫脂燕麥粉，調(diào)節(jié)pH到7.0，分別以液料比5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1mL/g，在30℃水浴中攪拌浸提12h，測量樣品的抑菌圈直徑。

1.2.3水提工藝響應面設(shè)計根據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用統(tǒng)計軟件Design Expert中的Box—Behnken設(shè)計，確定對抑菌圈大小有影響的四個因素。以提取時間、提取溫度、pH、液料比為自變量，選取抑菌圈直徑作為響應變量，進行四因素三水平的響應面優(yōu)化實驗（表1）。

表1　響應面實驗設(shè)計表Table 1　Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in responses surface analysis

1.2.4提取液蛋白得率的測定采用考馬斯亮藍法［14］，以標準蛋白質(zhì)溶液的吸光度A為縱坐標，以標準蛋白質(zhì)溶液的濃度C為橫坐標，繪制標準曲線。取0.05mL燕麥提取蛋白液，準確加入蒸餾水至1mL，再加入5mL考馬斯亮藍G-250溶液，搖勻，靜置2min，測定595nm處吸光度，查標準曲線即可得燕麥提取液蛋白含量。參比為1mL蒸餾水加入5mL考馬斯亮藍G-250溶液。

蛋白得率（mg/g）=提取液蛋白質(zhì)量（mg/mL）/原料總質(zhì)量（g）×提取液總體積（mL）

1.2.5抑菌圈的測定

1.2.5.1打孔法以鏈格孢菌作為指示菌，將鏈格孢菌接種到馬鈴薯（PDA）培養(yǎng)基中心，用滅過菌的打孔器在平皿上十字對稱打四個孔，打孔直徑為6mm。在三個孔中分別加入20μL的濃度為50mg/mL的燕麥水提取蛋白樣品，一個孔作為空白對照加入20μL的滅菌蒸餾水，將培養(yǎng)基平穩(wěn)地置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，測量并記錄抑菌圈直徑，每個樣品做三個重復，三個平行樣。

1.2.5.2抑菌圈直徑的測量方法在反射光的照射條件下用游標卡尺在培養(yǎng)皿背面測量抑菌圈直徑，垂直測量三次，取平均值［15］。

1.2.6數(shù)據(jù)處理方法實驗數(shù)據(jù)均經(jīng)過三次平行實驗得到的平均值，響應面實驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0軟件繪圖并作方差和顯著分析等。

2　結(jié)果與分析

2.1標準蛋白質(zhì)溶液測定曲線

以標準蛋白質(zhì)溶液的濃度C為橫坐標，標準蛋白質(zhì)溶液的吸光度A為縱坐標，繪制標準蛋白溶液標準曲線圖。如圖1標準曲線方程為：y=4.3083x+0.3823（R2=0.9971）。

圖1　標準曲線Fig.1　Standard curve

圖2　提取時間對燕麥抗真菌蛋白抑菌性和蛋白得率的影響Fig.2　Effect of extraction time on oat protein antifungal activity and rate of protein extraction

2.2單因素實驗

2.2.1提取時間對燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響由圖2可知，提取時間在8～12h的范圍內(nèi)，隨著提取時間的不斷增加，抑菌圈直徑和蛋白得率逐漸變大，當提取時間到達12h時，抑菌圈直徑和蛋白得率都達到了最大。在此之后，隨著提取時間增加，抑菌圈直徑和蛋白質(zhì)得率開始降低。這是因為提取時間會影響到溶劑與燕麥中抗真菌蛋白的接觸與溶解。但是浸提時間過長，會引起燕麥中抗真菌蛋白抑菌性下降。所以選擇12h為響應面時間因素的中心值。

2.2.2提取溫度對燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響由圖3可知，隨著溫度的升高，抑菌圈直徑和蛋白得率也隨之增大，溫度達到30℃時，蛋白得率達到了最大。此時，該提取溫度為燕麥中抗真菌蛋白溶出的最適溫度，所以抑菌性也達到了最大。所以選擇30℃為響應面的中心值。

圖3　提取溫度對燕麥抗真菌蛋白抑菌性和蛋白得率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on oat protein antifungal activity and rate of protein extraction

2.2.3pH對燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響由圖4可知，pH從6.0～7.0時，抑菌圈直徑緩慢增大，當pH達到7.5時達到最大，抑菌圈直徑為17.72mm。而蛋白得率隨著pH的增大逐漸增大，pH為7.5時達到最大。這可能是因為燕麥抗真菌蛋白為一種偏堿性蛋白，過酸或過堿的條件下，會造成燕麥抗真菌蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響了抑菌效果。所以，選擇7.5為響應面中心值。

圖4　pH對燕麥抗真菌蛋白抑菌性和蛋白得率的影響Fig.4　Effect of pH on oat protein antifungal activity and rate of protein extraction

2.2.4液料比對燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響由圖5可知，隨著液料比增大，抑菌圈直徑逐漸變大，當液料比為10∶1mL/g時，抑菌圈直徑達到了最大，但在液料比增至15∶1mL/g后，液料比對抑菌圈直徑影響不大。而蛋白得率一直呈下降趨勢。這是因為液料比過小可能會影響到燕麥中抗真菌蛋白的溶解情況，而液料比過大又會減少蛋白質(zhì)含量，導致抑菌性下降，造成原料的浪費。所以，選擇液料比10∶1mL/g作為響應面中心值。

圖5　液料比對燕麥抗真菌蛋白抑菌性和蛋白得率的影響Fig.5　Effect of liquid-to-solid ratio on oat protein antifungal activity and rate of protein extraction

2.3響應面優(yōu)化實驗結(jié)果與分析

表2　響應曲面法優(yōu)化水提條件的實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2　Experimental design and results for responses surface analysis

表3　方差分析表Table 3　Variance analysis for antifungal activity

圖6　溫度和時間對對燕麥抗真菌蛋白抑菌性的響應曲面Fig.6　Extraction temperature and extraction time showing the effects on oat protein antifungal activity

圖7　液料比與時間對燕麥抗真菌蛋白抑菌性的響應曲面Fig.7　Liquid-to-solid ratio and extraction time showing the effects on oat protein antifungal activity

圖8　pH與時間對燕麥抗真菌蛋白抑菌性的響應曲面Fig.8　pH and extraction time showing the effects on oat protein antifungal activit

圖9　pH與溫度對燕麥抗真菌蛋白抑菌性的響應曲面Fig.9　pH and extraction temperature showing the effects on oat protein antifungal activity

圖10　液料比與溫度對燕麥抗真菌蛋白抑菌性的響應曲面Fig.10　Liquid-to-solid ratio and extraction temperature showing the effects on oat protein antifungal activity

其二次方程為：

Y=18.02+1.23A-0.61B+0.33C+1.50D-0.61AB+ AC+0.71AD+0.54BC-0.63BD-0.13CD-4.80A2-3.03B2-2.26C2-2.12D2

對建立的模型進行方差分析，由表3的方差分析結(jié)果可以看出，模型p值極顯著。失擬p=0.0724＞0.05，不顯著。說明未知因素對實驗結(jié)果影響小。R2= 0.9430，說明該模型擬合度良好，實驗誤差小?；貧w系數(shù)顯著性檢驗顯示，一次項A、D和二次項A2、B2、C2、D2對燕麥抗真菌蛋白抑菌性影響均達到了極顯著（p＜0.01）水平。模型可以看出各個因素對燕麥抗真菌蛋白抑菌性影響的大小順序：液料比（D）＞提取時間（A）＞提取溫度（B）＞pH（C）。

2.4響應面結(jié)果分析

由圖6～圖11可以看出，提取時間與pH交互作用顯著，其余各因素之間交互作用都很小。根據(jù)模型優(yōu)化的最佳水提條件：提取時間12.35h，提取溫度29.24℃，pH7.54，液料比12.01mL/g，抑菌圈直徑18.49mm。

2.5驗證實驗

結(jié)合實際條件，最終選擇的實驗條件：提取時間12h，提取溫度30℃，pH7.5，液料比12mL/g，進行三組平行驗證實驗，實驗得出實際數(shù)值為18.10mm與預測值18.49mm的差異為0.02%，說明該回歸方程能夠比較真實的反映各因素對燕麥抗真菌蛋白抑菌性的影響。證明響應面優(yōu)化提取條件真實可靠。

圖11　液料比與pH對燕麥抗真菌蛋白抑菌性的響應曲面Fig.11　Liquid-to-solid ratio and pH showing the effects on oat protein antifungal activity

圖12　驗證實驗結(jié)果Fig.12　Validation of the optimized process conditions

3　結(jié)論

水提取燕麥抗真菌蛋白的最優(yōu)工藝參數(shù)：提取時間12h，提取溫度30℃，pH7.5，液料比12∶1mL/g。在此條件下，抑菌圈直徑達到18.10mm，與預測值18.49mm的差異為0.02%。證明響應面優(yōu)化水提取燕麥抗真菌蛋白的條件是合理可靠的。該研究結(jié)果對燕麥抗真菌蛋白的進一步分離、純化提供了理論基礎(chǔ)。但本實驗只選取一種菌作為指示菌，代表性不強，后續(xù)的工作應系統(tǒng)地研究燕麥抗真菌蛋白的抑菌活性。

［1］康振生.我國植物真菌病害的研究現(xiàn)狀及發(fā)展策略［J］.植物保護，2010，36（3）：9-12.

［2］Park C J，Park C B，Hong S S，et al.Characterization and cDNA cloning of two glycine-and histidine-rich antimicrobial peptides from the roots of shepherd’s purse，Capsella bursapastoris［J］.Plant Molecular Biology，2000，44（2）：187-197.

［3］Ishisaki K，Honda Y，Taniguchi H，et al.Heterogonous expression and characterization of a plant class IV chitinase from thepitcherofthecarnivorousplantNepenthesalata［J］. Glycobiology，2012，22（3）：345-351.

［4］Rensen H P，Madsen L S，Petersen J，et al.Oat（Avena sativa）seed extract as an antifungal food preservative through the catalytic activity of a highly abundant class I chitinase［J］.Appl Biochem Biotechnol，2010（160）：1573-1584.

［5］Leung E H W，Ng T B.A relatively stable antifungal peptide from buckwheat seeds with antiproliferative activity toward cancer cells［J］.Journal of Peptide Science，2007，13（11）：762-767.

［6］那冰，余明琨，龔雋，等.小黑麥抗真菌蛋白組分的分離純化和性質(zhì)研究［J］.生物工程學報，2002（5）：561-565.

［7］Wang H X，Ng T B.An antifungal protein from the pea Pisum sativum var.arvense Poir［J］.peptides，2006，27：1732-1737.

［8］Thevissen K，De Mello Tavares P，Xu D，et al.The plant defensin RsAFP2 induces cell wall stress，septin mislocalization and accumulation of ceramides in Candida albicans［J］.Molecular microbiology，2012，84（1）：166-180.

［9］Vincent S M H，Jack H W，Ng T B.A thaumatin-like antifungal protein from the emperor banana［J］.Peptides，2007（28）：760-766.

［10］章海燕，張暉，王立，等.燕麥研究進展［J］.糧食與油脂，2009（8）：7-9.

［11］任順成，馬瑞萍.燕麥的功效因子及其保健功能［J］.糧食科技與經(jīng)濟，2013（3）：58-60.

［12］呂耀昌，鄭殿升，趙煒.燕麥保健功能的開發(fā)利用［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2011（3）：8-9.

［13］周素梅，盛清凱，路長喜，等.不同燕麥品種的輔助降血脂功效研究［J］.中國糧油學報，2011（3）：25-29.

［14］董娜，賈艷菊，張曉，等.考馬斯亮藍法測定奶粉中蛋白的研究［J］.食品科技，2011（11）：272-274.

［15］王碩，朱超，杜欣軍，等.食源性阪崎腸桿菌耐藥性分析及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢測［J］.食品科技，2011，36（9）：330-333.

Study on the optimization of water extraction of oat antifungal protein by response surface anaylsis

SU Ri-na，ZHANG Mei-li*
（Food Science and Engineering College，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

Antifungal proteins were extracted from seeds of naked oat by water extraction method.The antifungal activity of the protein was evaluated by hole method.Based on single factor method，response surface analysis were used to explore the effects of extraction time，extraction temperature，pH and liquid-to-solid ratio on antifungal activity of oat antifungal protein.These methods determined the optimal water extraction conditions of oat antifungal protein.Results：The optimal extraction time，extraction temperature，pH and liquid-to-solid ratio were 12h，30℃，7.5，12∶1mL/g.The actual maximum diameter of inhibition zone was 18.10mm.

oat；antifungal protein；water extraction method；response surface anaylsis

TS213.3

B

1002-0306（2015）14-0312-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.055

2014－12－08

蘇日娜（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：植物活性成分的分離純化。

張美莉（1966-），女，博士，教授，研究方向：植物活性成分的分離純化。