侯進(jìn)慧，陳集雙，丁愛軍，胡燕花

（1.江蘇大豐海港控股集團(tuán)有限公司，江蘇大豐224100；2.南京工業(yè)大學(xué)，江蘇南京210009；3.徐州工程學(xué)院，江蘇徐州221111）

一株大質(zhì)粒決定的耐鎘假單胞菌的鑒定與耐受性分析

侯進(jìn)慧1，2，3，陳集雙2，丁愛軍2，胡燕花2

（1.江蘇大豐海港控股集團(tuán)有限公司，江蘇大豐224100；2.南京工業(yè)大學(xué)，江蘇南京210009；3.徐州工程學(xué)院，江蘇徐州221111）

分離到一株耐鎘菌株XZC1，結(jié)合菌落特征和16S rDNA序列對其進(jìn)行鑒定，將該菌在含Cd2+液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，獲得菌體生長情況，分析該菌株鎘耐性是否與質(zhì)粒相關(guān)，檢測菌株對其他幾種重金屬的耐性。結(jié)果表明，該菌株是Pseudomonas sp.，在Cd2+濃度為400mg/L LB培養(yǎng)基中可正常生長；經(jīng)過質(zhì)粒消除的XZC1不具有鎘耐性，說明該菌株的鎘耐性基因存在于大質(zhì)粒上；XZC1對Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+的耐性較強(qiáng)，在400mg/L以上。菌株XZC1在重金屬污染防治方面有深入研究價值。

重金屬污染，耐鎘細(xì)菌，假單胞菌屬，質(zhì)粒消除

重金屬污染是指重金屬及其化合物對大氣、土壤和水質(zhì)等環(huán)境的污染。常見的重金屬元素有鎘、汞、鉛等，它們可能通過生物界的食物鏈系統(tǒng)進(jìn)入人體，危害人類健康。鎘具有的“三致”作用，必需從環(huán)境中富集去除，才能達(dá)到環(huán)境修復(fù)的目的，因此該元素一直是環(huán)境修復(fù)研究的重點(diǎn)。通過微生物進(jìn)行重金屬富集研究顯示，微生物具有重金屬富集作用［1］。根際微環(huán)境聯(lián)系著植物與土壤，控制著重金屬等污染物從土壤向植物的遷移。由于根系分泌物的作用，根際有較高濃度的碳水化合物、氨基酸、維生素和其他生長因子，使之成為微生物生長旺盛的區(qū)域。微生物不能降解鎘，但可以影響鎘的形態(tài)轉(zhuǎn)化、分散和富集。比如，在環(huán)境污染的脅迫下，一些微生物能夠從體內(nèi)分泌出具有絡(luò)合或分解轉(zhuǎn)化污染物能力的有機(jī)物質(zhì)，與植物根系分泌的多糖等粘膠物質(zhì)共同形成粘膠層，粘膠層的擴(kuò)大有利于將大量金屬離子滯留于根外。有些微生物產(chǎn)生一些物質(zhì)與溶液中的污染物發(fā)生化學(xué)沉淀反應(yīng)，形成不溶性化合物，從而影響鎘的有效性［2］。根際微生物通過多種方式影響土壤重金屬的毒性和生物可利用性，目前對根系分泌物在植物積累和忍耐重金屬方面仍缺乏直接證據(jù)［3-4］。篩選耐受重金屬的微生物是開發(fā)微生物富集和修復(fù)的基礎(chǔ)。對于微生物耐鎘的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究都需要不斷深入。

草本植物牛蒡（Arctium lappa L.）是江蘇主要的出口農(nóng)產(chǎn)品之一，有較高的營養(yǎng)價值。本文在分析牛蒡根際微生物多樣性的過程中，篩選到了一株耐鎘細(xì)菌菌株，結(jié)合菌落形態(tài)觀察、生理生化特性和16S rDNA序列分析等方法對菌株進(jìn)行了鑒定，確定其抗性基因存在于大質(zhì)粒上，對微生物修復(fù)土壤重金屬污染研究具有理論和應(yīng)用意義。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

實(shí)驗(yàn)樣品采集自蘇北農(nóng)田土壤。

質(zhì)粒提取試劑盒天根生化科技（北京）有限公司；分子生物學(xué)試劑上海天昊生物科技有限公司；生化分析試劑國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；PCR引物上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2培養(yǎng)基

液體LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：酵母膏5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，加水定容至1L。每升LB液體培養(yǎng)基加入12g瓊脂粉制做固體培養(yǎng)基。耐鎘菌株篩選培養(yǎng)基是向LB培養(yǎng)基中加入CdSO4，調(diào)節(jié)到相應(yīng)的鎘濃度。

1.3菌株分離

取1g土壤樣品，加入100mL含鎘50mg/L的LB液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)1d。將菌液接種于鎘終濃度分別為100、200、300、400mg/L的固體培養(yǎng)基，在28℃培養(yǎng)2d。待長出菌落后，通過劃線法純化獲得菌種，采用甘油保藏法，將菌種在-20℃低溫保藏備用。

1.4分子鑒定

使用苯酚-氯仿抽提，乙醇沉淀的方法提取菌株基因組DNA［5］，瓊脂糖凝膠檢測DNA，選擇質(zhì)量較好的做為模版，PCR擴(kuò)增菌株16S rDNA。引物序列是：F：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’，R：5’GGTTACC TTGTTACGACTT3’。PCR反應(yīng)體系是50μL，其中有10×PCR反應(yīng)緩沖液5μL，dNTP 4μL，上、下游引物各1μL，基因組DNA模板1μL，Long Taq DNA聚合酶0.5μL，加無菌超純水補(bǔ)足體積。擴(kuò)增條件是95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，54℃退火60s，72℃延伸90s，進(jìn)行25個循環(huán)；72℃延伸6min。菌株16S rDNA序列送上海Sangon生物工程技術(shù)公司測序。根據(jù)序列比對情況，對菌株進(jìn)行分子鑒定［6-7］。

1.5鎘對菌株生長狀況影響分析

按照1%接種量將菌液分別轉(zhuǎn)接到鎘濃度為0、100、200、400mg/L的液體培養(yǎng)基中，在600nm處連續(xù)測定培養(yǎng)基中的菌體吸光度，繪制生長曲線，分析菌株在不同鎘濃度液體培養(yǎng)基的生長情況。

1.6質(zhì)粒消除分析

根據(jù)文獻(xiàn)的方法［8］，采用SDS法將菌株的質(zhì)粒進(jìn)行消除，具體實(shí)驗(yàn)方法是：將菌株接種于SDS濃度為20mg/L的液體LB培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)48h。將菌液依次進(jìn)行0、10、100倍稀釋后分別涂布于含Cd2＋濃度分別是0、50mg/L的固體培養(yǎng)平板上，于30℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察菌落生長情況，每個稀釋濃度梯度做3個平行實(shí)驗(yàn)。

1.7大質(zhì)粒提取分析

依據(jù)李鈞敏［9］中的方法，提取XZC1質(zhì)粒。具體方法是，將活化的1mL菌液在10，000r/min離心收集菌體；加入200μL預(yù)冷的TE緩沖液，重懸浮菌體；加入400μL新鮮配制的裂解液（NaOH 0.2mol/L、3%SDS），室溫放置10min；加入200μL TS溶液（Tris-HCl 1mmol/L、NaCl 4mmol/L、pH7.0），12，000r/min離心10min；取上清液，加入800μL無水乙醇沉淀DNA，在-20℃放置30min，12，000r/min離心10min；棄上清，向沉淀中加入400μL 70%乙醇，12，000r/min離心5min；棄上清，將沉淀溶于100μL含RNase（終濃度為50μg/mL）的TE緩沖液中，37℃水浴1h，置冰箱中備用。

1.8菌株對其他重金屬的耐受性分析

將菌株接種到含有50、100、200、400mg/L等不同濃度Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+等其他重金屬的固體LB培養(yǎng)基中，分析菌株對其他重金屬的耐受性。

圖1　菌株16S rDNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　PCR result of 16S rDNA

圖2　菌株XZC1演化樹分析Fig.2　Phylogenetic tree analysis of XZC1

2　結(jié)果與分析

2.1菌株分離與鑒定

篩選到一株耐鎘特性較強(qiáng)的菌株XZC1，在Cd2+濃度為400mg/L LB培養(yǎng)基中可正常生長，可見到清晰的菌落。經(jīng)純培養(yǎng)，獲得單菌落，液體擴(kuò)大培養(yǎng)獲得大量的菌體，提取基因組DNA作為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增獲得16S rDNA（圖1）。將16S rDNA序列送生物公司測序，獲得了DNA序列，利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行比對分析，構(gòu)建演化樹（圖2）。結(jié)果表明，菌株XZC1與Pseudomonas sp.IC59和Pseudomonas putida具有較近的演化關(guān)系。綜合菌落形態(tài)觀察和16SrDNA序列特征等結(jié)果，確定菌株XZC1是假單胞菌Pseudomonas sp.。

2.2鎘對菌株XZC1生長的影響

隨著培養(yǎng)基中鎘濃度的增加，菌株XZC1生長的壓力也不斷增大。經(jīng)過分析，獲得了菌株XZC1在不同鎘濃度條件下的生長情況（圖3）。結(jié)果顯示，隨著鎘濃度的不斷增加，菌株達(dá)到指數(shù)生長期的時間也不斷增加。在沒有鎘存在時，菌株在13h進(jìn)入指數(shù)生長期，在鎘濃度是100、200、400mg/L時，進(jìn)入指數(shù)生長期的時間分別是24、61、85h。在菌體達(dá)到平臺期后的菌體濃度方面，鎘濃度100mg/L與不添加鎘達(dá)到的濃度相似，A600在2.5左右；鎘濃度200mg/L的菌體濃度略小，而鎘濃度400mg/L的平臺期菌體濃度最低，A600在1.5左右。由此可見，鎘濃度的增加會給菌體XZC1生長帶來壓力，并影響到菌體在平臺期的濃度。

圖3　XZC1在Cd2+液體培養(yǎng)基的生長曲線Fig.3　Growth curve of XZC1 in Cd2+

2.3質(zhì)粒消除分析

為了分析XZC1菌株的鎘抗性基因是否在質(zhì)粒上，進(jìn)行了質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，經(jīng)過質(zhì)粒消除的XZC1在固體LB培養(yǎng)基上可以正常生長，而在含50mg/L CdSO4的固體LB培養(yǎng)基上不能生長。說明耐鎘基因不在染色體上而是在質(zhì)粒上。

2.4大質(zhì)粒提取分析

采用假單胞菌大質(zhì)粒提取法，對在50mg/L Cd2+條件下培養(yǎng)的XZC1菌體的大質(zhì)粒進(jìn)行提取，將提取的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)分離到了菌株XZC1的大質(zhì)粒，說明該菌株存在著大質(zhì)粒。

2.5XZC1對其他重金屬耐受性測定

在固體培養(yǎng)基上，將菌株XZC1對Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+等重金屬的耐受性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，XZC1對Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+等重金屬耐受性都在400mg/L以上，對Zn2+的耐受性是200mg/L，不耐400mg/L的Zn2+。

圖4　菌株XZC1大質(zhì)粒電泳結(jié)果Fig.4　Electrophoresis analysis of XZC1 big Plasmid

3　討論

隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，土壤中鎘含量顯著增加，鎘污染問題日趨嚴(yán)峻，嚴(yán)重威脅農(nóng)產(chǎn)品和食品的安全［10-11］。國際和國內(nèi)對于重金屬污染及其防治的研究日益成為生物科學(xué)熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。其應(yīng)用性研究側(cè)重于分析重金屬污染的來源、防治措施和環(huán)境修復(fù)，而基礎(chǔ)性研究則側(cè)重于分析重金屬污染危害性與防治的機(jī)理［3，12-13］。微生物由于其獨(dú)特的生理生化特征和廣泛的適應(yīng)性，在重金屬污染修復(fù)研究中被人們所重視。

在假單胞菌對重金屬耐受性研究中，研究者分離了一些耐重金屬假單胞，并克隆分析了一些重金屬抗性基因［14-21］。從P.putida中分離到了金屬轉(zhuǎn)運(yùn)ATPase CadA［21］。在獲得全基因組序列后，研究者使用生物信息學(xué)軟件，分析得出P.putida中存在多個與金屬調(diào)節(jié)、吸收、排出和螯合作用相關(guān)的基因。P.putida KT2440有61個ORF參與了金屬體內(nèi)平衡的維持以及解毒作用，另有7個ORF可能參與類金屬的解毒作用［15］，這些結(jié)果還需要具體的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。目前已經(jīng)有10多株假單胞菌的基因組完成了全基因組測序，這些信息將會推動人們對假單胞菌重金屬耐受性的研究。本文在分析鎘耐受性較強(qiáng)的假單胞菌菌株XZC1時，通過質(zhì)粒消除發(fā)現(xiàn)與該菌鎘抗性基因在大質(zhì)粒上，并提取出了該質(zhì)粒，為深入分析假單胞菌耐受性提供了很好的研究基礎(chǔ)。這方面的研究既可以為微生物修復(fù)重金屬污染提供技術(shù)支持，也能使人們弄清楚微生物對重金屬耐受性的機(jī)理。

4　結(jié)論

經(jīng)過純化和鑒定，獲得一株重金屬耐較強(qiáng)的菌株P(guān)seudomonas sp.XZC1，該菌在Cd2+濃度為400mg/L LB培養(yǎng)基中可正常生長。提取獲得XZC1的大質(zhì)粒，經(jīng)過質(zhì)粒消除的XZC1不具有鎘耐性，說明該菌株的鎘耐性基因在大質(zhì)粒上。該菌株在重金屬污染微生物修復(fù)方面有深入研究價值。

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Identification and tolerance analysis of a large plasmid determined cadmium resistance Pseudomonas sp.

HOU Jin-hui1，2，3，CHEN Ji-shuang2，DING Ai-jun2，HU Yan-hua2
（1.Jiangsu Dafeng Harbor Holdings Limited，Dafeng 224100，China；2.Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China；3.Xuzhou Institute of Technology，Xuzhou 221111，China）

A cadmium resistant strain，XZC1，was separated.The strain was identified by colony characteristics and 16S rDNA sequence.XZC1 was then cultured in liquid LB medium containing Cd2+to study its growth curve.The relationship between Cd2+tolerance and plasmid was analyzed.The tolerance of the strain to several other heavy metals was tested.The results show that，the strain was Pseudomonas sp.，it could grow in LB with 400mg/L Cd2+，after plasmid elimination，XZC1 had no Cd2+tolerance，indicating that Cd2+tolerance gene of the strain exists in large plasmid，XZC1 had high tolerance to Fe2+，Cu2+，Mn2+，Ni2+，which was above 400mg/L.The strain was of significant on the research of prevention heavy metal pollution.

heavy metal pollution；cadmium resistance bacterium；Pseudomonas sp.；plasmid elimination

TS201.1

A

1002-0306（2015）14-0225-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.038

2014－09－27

侯進(jìn)慧（1980-），男，博士，副教授，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)與生物工程。

江蘇省博士后基金項目（1302041B）；江蘇省雙創(chuàng)博士項目（2014）；江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室開放基金項目（2014）；徐州工程學(xué)院重點(diǎn)校級項目。