王　豪，楊博崴，徐致遠(yuǎn)，劉振民，章　慧

（1.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，光明乳業(yè)股份有限公司研究院，上海200436；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122；3.上海德諾產(chǎn)品檢測有限公司，上海200436）

一種無增稠劑開菲爾的研發(fā)

王豪1，楊博崴2，徐致遠(yuǎn)1，劉振民1，章慧3

（1.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，光明乳業(yè)股份有限公司研究院，上海200436；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122；3.上海德諾產(chǎn)品檢測有限公司，上海200436）

本文以黏度為評價指標(biāo)，研究了均質(zhì)壓力、菌種添加量、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間對無增稠劑開菲爾質(zhì)構(gòu)的影響。在單因素基礎(chǔ)上對關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行正交優(yōu)化，優(yōu)化參數(shù)為：均質(zhì)壓力21MPa、菌種添加量0.07g/kg、發(fā)酵溫度34℃、發(fā)酵時間23h。在該工藝條件下無增稠劑開菲爾的黏度達(dá)到0.768Pa·s，產(chǎn)品質(zhì)地及貯存穩(wěn)定性得到了極大改善，同時保留了典型的風(fēng)味和益生菌。

無增稠劑，開菲爾，黏度

開菲爾是一種源自于高加索山脈、具有特殊風(fēng)味的發(fā)酵乳制品，擁有悠久的食用歷史。許多世紀(jì)以前，高加索地區(qū)牧民發(fā)現(xiàn)新鮮牛奶在隨身攜帶的皮袋中會自然發(fā)酵形成一種具有爽快酸味的飲料，這便是最初的開菲爾［1］。傳統(tǒng)開菲爾使用開菲爾粒發(fā)酵制成，開菲爾粒是一種呈乳白色至乳黃色、形狀不規(guī)則的凝膠狀彈性顆粒，其表面和內(nèi)部均富含多樣化的微生物菌群。然而，開菲爾粒因來源生境不同，其菌相組成也千差萬別，易造成產(chǎn)品批次間風(fēng)味及菌數(shù)不穩(wěn)定，因此不適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。如今大多數(shù)乳品生產(chǎn)企業(yè)開始采用由開菲爾粒中分離得到的特征菌株所組成的復(fù)配菌群進(jìn)行發(fā)酵，菌株間配比及活菌數(shù)穩(wěn)定，以保證出廠產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定。開菲爾口感獨特，具有輕微的酒香味及殺口感，被譽為發(fā)酵乳中的香檳［2］。此外，開菲爾還具有多種益生功能，據(jù)報道其擁有抑菌、免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防癌癥以及降膽固醇作用［3-7］。與市面上普通發(fā)酵乳相比，開菲爾因其具備獨特的風(fēng)味、豐富的發(fā)酵菌群及益生功能而具有顯著的差異化競爭優(yōu)勢，歐美等發(fā)達(dá)國家已率先實現(xiàn)了開菲爾的工業(yè)化生產(chǎn)，規(guī)模效益日趨凸顯。

然而，商業(yè)化的開菲爾普遍添加了食品增稠劑來穩(wěn)定產(chǎn)品在貨架期內(nèi)的組織狀態(tài)。近年來，明膠、皮革水解奶等頻發(fā)的食品安全事件使國內(nèi)消費者對增稠劑十分反感，伴隨著消費者的健康意識逐步加強，消費者迫切希望購買到無增稠劑的發(fā)酵乳。然而，就現(xiàn)有發(fā)酵乳制備工藝而言，不使用增稠劑的產(chǎn)品在貨架期內(nèi)易出現(xiàn)黏度下降、乳清析出等現(xiàn)象，產(chǎn)品穩(wěn)定性的下降會削弱消費者的感官接受度，進(jìn)而影響到產(chǎn)品質(zhì)量。

因此，本文旨在基于不添加增稠劑的前提下，通過研究均質(zhì)壓力、菌種添加量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對開菲爾黏度的影響，繼而開發(fā)出一種質(zhì)地優(yōu)良、貨架期穩(wěn)定的無增稠劑開菲爾，從而滿足消費者的健康需求，同時產(chǎn)生積極的經(jīng)濟效益與社會效益。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

全脂牛奶光明乳業(yè)股份有限公司華東中心工廠；白砂糖廣西上上糖業(yè)有限公司；凍干型直投式菌種MILD-01（乳酸菌總數(shù)≥1×1010CFU/g，包括乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種、乳酸乳球菌雙乙酰亞種、腸膜明串珠菌腸膜亞種、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌） 丹尼斯克（中國）有限公司。

IKA T25高速組織分散機德國IKA公司；APV 1000型高壓均質(zhì)機丹麥APV公司；電熱恒溫水槽上海精宏實驗設(shè)備公司；proRheo-180黏度計德國proRheo公司；pH計美國奧立龍公司；JJ500電子天平美國雙杰兄弟集團有限公司；超凈工作臺美國LABCONCO公司；生物培養(yǎng)箱德國BINDER公司。

1.2工藝流程

牛奶驗收→配料→均質(zhì)→殺菌→冷卻→發(fā)酵→破乳→灌裝→冷藏

1.3操作要點

1.3.1牛奶驗收按GB19301-2010及工廠內(nèi)控驗收牛奶，驗收合格的牛奶標(biāo)準(zhǔn)化至脂肪≥3.1%，蛋白質(zhì)≥2.9%。

1.3.2配料將牛奶預(yù)熱至40～45℃后加入白砂糖，高速攪拌25min至充分溶解。

1.3.3發(fā)酵菌種加入后攪拌5～10min，保證其混合均勻，靜置發(fā)酵至pH達(dá)4.4～4.5。

1.3.4破乳凝乳攪拌至流體狀，無明顯凝塊。

1.3.5冷藏灌裝后須盡快冷藏，冷藏溫度為2～6℃，冷藏時間不低于12h。

1.4理化及微生物指標(biāo)的測定

pH的測定方法參考儀器說明書；乙醛及乙酸乙酯含量的測定參考文獻(xiàn)［8］；乙醇含量的測定參考文獻(xiàn)［9］；乳酸乳球菌及腸膜明串珠菌的測定參考文獻(xiàn)［10］。

黏度的測定：將冷藏的樣品傾倒出頂部料液，取中間部分作為待測樣，采用proRheo-180黏度計進(jìn)行測量；測量參數(shù)：2號轉(zhuǎn)子，溫度10℃，轉(zhuǎn)速64r/min，間隔10s。

1.5單因素實驗設(shè)計

1.5.1均質(zhì)壓力的確定固定菌種添加量0.03g/kg、發(fā)酵溫度28℃、發(fā)酵時間17h，在均質(zhì)溫度65℃下分別以均質(zhì)壓力13、15、17、19、21、23MPa進(jìn)行實驗，按1.4法測定產(chǎn)品黏度。

1.5.2菌種添加量的確定固定均質(zhì)壓力20MPa、發(fā)酵溫度28℃、發(fā)酵時間17h，分別以菌種添加量0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.11g/kg進(jìn)行實驗，測定產(chǎn)品黏度。

1.5.3發(fā)酵溫度的確定固定均質(zhì)壓力20MPa、菌種添加量0.03g/kg、發(fā)酵時間17h，分別以發(fā)酵溫度25、28、31、34、37、40℃進(jìn)行實驗，測定產(chǎn)品黏度。

1.5.4發(fā)酵時間的確定固定均質(zhì)壓力20MPa、菌種添加量0.03g/kg、發(fā)酵溫度28℃，分別以發(fā)酵時間14、17、20、23、26、29h進(jìn)行實驗，測定產(chǎn)品黏度。

1.6正交實驗設(shè)計

為確定無增稠劑開菲爾最佳質(zhì)構(gòu)的工藝條件，本實驗在單因素實驗基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實驗，選取均質(zhì)壓力、菌種添加量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間為考察因素，以黏度為評價指標(biāo)，設(shè)計L9（34）正交實驗，因素水平表見表1。

表1　L9（34）正交實驗因素水平表Table 1　L9（34）factors levels of orthogonal test

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Origin 7.5及DPS 7.05軟件處理分析，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行三次平行實驗。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1均質(zhì)壓力對無增稠劑開菲爾黏度的影響在均質(zhì)過程中，牛乳在均質(zhì)機中以極高的速度被強制通過一個窄縫，脂肪球破裂成比原來小得多的脂肪球，因此可減少脂肪上浮、減小脂肪成團或聚結(jié)的傾向，保證乳脂肪均勻分布。均質(zhì)工藝不僅可防止形成奶油層，同時還能降低脂肪氧化的敏感性，牛乳顏色更白、口感更好，更為重要的是可賦予成品較佳的穩(wěn)定性［11-12］。

適宜的均質(zhì)壓力可明顯提高發(fā)酵乳的黏稠度，提升產(chǎn)品保質(zhì)期內(nèi)的質(zhì)構(gòu)穩(wěn)定性。實驗研究了均質(zhì)壓力對無增稠劑開菲爾黏度的影響，結(jié)果見圖1。

圖1　均質(zhì)壓力對無增稠劑開菲爾黏度的影響Fig.1　Effect of homogenization pressure on the viscosity of kefir without thickeners

在經(jīng)充分均質(zhì)的牛乳中，新生的脂肪球表面積增加了4～6倍，而且它們不再被原有的天然脂肪膜所覆蓋，取而代之的是可同乳脂肪發(fā)生交互作用的大量酪蛋白及部分乳清蛋白，即形成了脂肪-蛋白質(zhì)復(fù)合物［13］。脂肪-蛋白質(zhì)復(fù)合物對產(chǎn)品黏稠度有著至關(guān)重要的影響，若均質(zhì)壓力過低則形成的微粒脂肪球偏少，脂肪-蛋白質(zhì)復(fù)合物減少，導(dǎo)致終產(chǎn)品黏稠度下降；若均質(zhì)壓力過高則會導(dǎo)致脂肪球內(nèi)部的液化脂肪釋出，從而阻礙脂肪與蛋白質(zhì)的交互作用并導(dǎo)致終產(chǎn)品黏度下降。

由圖1可知，在65℃均質(zhì)溫度下，當(dāng)均質(zhì)壓力由13MPa提高至17MPa時，開菲爾的黏度隨之明顯提高，黏度值上升了20%。隨后，伴隨著均質(zhì)壓力的繼續(xù)提高，開菲爾的黏度增幅減弱并趨于緩和，當(dāng)均質(zhì)壓力自19MPa升至23MPa時，開菲爾的黏度出現(xiàn)小幅下降。由此可見，適當(dāng)?shù)木|(zhì)壓力有助于提高開菲爾的黏度，但過高地提高均質(zhì)壓力則適得其反，且會加劇設(shè)備能耗上升。綜合黏度與能耗兩個方面考慮，無增稠劑開菲爾所使用的均質(zhì)壓力選擇19MPa為宜。

2.1.2菌種添加量對黏度的影響乳酸菌在發(fā)酵過程中除產(chǎn)生大量乳酸外，還會合成胞外多糖，可以改善產(chǎn)品的黏稠度和穩(wěn)定性。分泌胞外多糖的乳酸菌主要有乳桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬和明串珠菌屬等，但是這些胞外多糖在結(jié)構(gòu)和組成上是不同的［14］。與以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵而成的常規(guī)產(chǎn)品不同，開菲爾發(fā)酵過程中大多采用乳酸乳球菌和腸膜明串珠菌進(jìn)行發(fā)酵，基于胞外多糖的合成量及組成結(jié)構(gòu)的不同，兩類產(chǎn)品的黏度特性差異較為明顯。

菌種添加量的不同會影響產(chǎn)生胞外多糖的不同菌株間的相對比例，因此適當(dāng)?shù)慕臃N量有助于乳酸菌分泌并積累胞外多糖，從而提升產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)。實驗研究了菌種添加量對無增稠劑開菲爾黏度的影響，結(jié)果見圖2。

圖2　菌種添加量對無增稠劑開菲爾黏度的影響Fig.2　Effect of additive amount of starter culture on the viscosity of kefir without thickeners

由圖2可知，菌種添加量逐漸上升到0.07g/kg的過程中，隨添加量的增加開菲爾的黏度隨之提高，這是由于參與發(fā)酵的菌數(shù)增加，菌群優(yōu)勢促進(jìn)胞外多糖的合成量增多，黏度提升明顯。當(dāng)繼續(xù)提高菌種添加量至0.09g/kg時，開菲爾的黏度卻急劇下降，菌種添加量自0.09g/kg提高至0.11g/kg時開菲爾黏度下降趨緩。這可能是由于菌體細(xì)胞繁殖速度過快加劇了對營養(yǎng)物質(zhì)利用的競爭程度，從而加速了菌體細(xì)胞的自溶，導(dǎo)致生長環(huán)境不利于菌體代謝積累胞外多糖，產(chǎn)品的黏度下降。綜合圖2可知，無增稠劑開菲爾中菌種添加量選擇0.07g/kg。

2.1.3發(fā)酵溫度對黏度的影響溫度通過影響蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)如細(xì)胞膜的流動性及完整性來影響微生物的生長、繁殖和新陳代謝。過高的環(huán)境溫度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)或核酸的變性失活，而過低的溫度會使酶活力受到抑制，細(xì)胞的新陳代謝活動減弱。

在多菌株發(fā)酵過程中，菌株間以共生關(guān)系存在并進(jìn)行生長代謝，發(fā)酵溫度的不同會影響菌株間的分布比例，從而對菌相的共生平衡產(chǎn)生影響。牛乳必須保持在相應(yīng)發(fā)酵劑的最適溫度，即使與最適溫度有很小的偏差，也可能會因共生平衡被打破后造成對其中某些菌株的生長有益而對其他菌株不利，進(jìn)而使發(fā)酵乳不能獲得理想的酸感、風(fēng)味及黏度［15-17］。實驗研究了發(fā)酵溫度對無增稠劑開菲爾黏度的影響，結(jié)果見圖3。

圖3　發(fā)酵溫度對無增稠劑開菲爾黏度的影響Fig.3　Effect of fermentation temperature on the viscosity of kefir without thickeners

由圖3可知，隨發(fā)酵溫度的提高，開菲爾的黏度隨之升高。發(fā)酵溫度從25℃升至31℃的區(qū)間內(nèi)，黏度提升的較為緩慢。當(dāng)發(fā)酵溫度自31℃提高至37℃時，黏度上升速度明顯加快，這可能是由于發(fā)酵溫度逐漸步入菌群中產(chǎn)黏乳酸菌如乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌的最適發(fā)酵溫度范圍，胞外多糖合成速率加快致使黏度明顯提高。隨后，繼續(xù)提高溫度至40℃發(fā)現(xiàn)黏度上升趨緩。雖然在37～40℃范圍內(nèi)開菲爾具有相對較高的黏度值，但依據(jù)中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4575-2013《食品加工用乳酸菌》的菌種分類，

此溫度范圍有利于嗜熱型乳酸菌發(fā)酵，卻不利于嗜溫型乳酸菌發(fā)酵。開菲爾的特征風(fēng)味主要源自諸如乳酸乳球菌及腸膜明串珠菌等嗜溫型乳酸菌發(fā)酵所產(chǎn)生的揮發(fā)性芳香類物質(zhì)，當(dāng)溫度過高時會影響風(fēng)味物質(zhì)的釋放［18］。為避免產(chǎn)品喪失特征風(fēng)味，綜合黏度和風(fēng)味兩個方面考慮，無增稠劑開菲爾合適的發(fā)酵溫度選擇為34℃。

2.1.4發(fā)酵時間對黏度的影響發(fā)酵乳的發(fā)酵時間主要與所使用的發(fā)酵劑類型相關(guān)，如常規(guī)發(fā)酵乳的發(fā)酵時間普遍在4～10h左右，而開菲爾的發(fā)酵時間則普遍在12～35h左右，前者使用的是嗜熱型乳酸菌而后者使用的是嗜溫型乳酸菌［2，19］。

在發(fā)酵乳制備過程中，熱處理促使乳清蛋白變性并通過硫化橋與酪蛋白連接，隨后的發(fā)酵過程中需保證充足的發(fā)酵時間讓體系pH降低至酪蛋白等電點（4.4～4.5），酪蛋白才能聚集交聯(lián)形成致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)，從而防止產(chǎn)品在保質(zhì)期內(nèi)脫水收縮，提高產(chǎn)品黏度。同時，充足的發(fā)酵時間有助于積累由乳酸菌代謝分泌的胞外多糖，進(jìn)一步提升產(chǎn)品的黏度。實驗研究了發(fā)酵時間對無增稠劑開菲爾黏度的影響，結(jié)果見圖4。

圖4　發(fā)酵時間對無增稠劑開菲爾的影響Fig.4　Effect of fermentation time on the viscosity of kefir without thickeners

實驗過程中，發(fā)酵14h即至酪蛋白等電點。由圖4可知，發(fā)酵時間在14～20h范圍內(nèi)，黏度幾乎無變化，當(dāng)發(fā)酵時間自20h延長至26h時，黏度值加速遞增，這可能是由于此段時間是乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量累積的高峰期，因此黏度提升較為明顯。隨后，繼續(xù)延長發(fā)酵時間至29h，開菲爾的黏度值出現(xiàn)一定程度的下降，這是由于持續(xù)的發(fā)酵導(dǎo)致乳酸菌所分泌的蛋白酶持續(xù)作用于蛋白質(zhì)的亞基結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酪蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)松散、凝乳的凝膠強度降低，進(jìn)而引起產(chǎn)品的黏度下降［20］。綜合圖4可知，合適的發(fā)酵時間為26h。

2.2正交實驗結(jié)果與分析

單因素實驗結(jié)果表明，均質(zhì)壓力、菌種添加量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間對無增稠劑開菲爾的黏度均有一定的影響。為研究各因素之間的相互作用，提升無增稠劑開菲爾的質(zhì)構(gòu)穩(wěn)定性，在單因素的實驗基礎(chǔ)上通過正交實驗設(shè)計，對各項無增稠劑開菲爾的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，正交實驗結(jié)果見表2。

由極差分析可知，各因素對無增稠劑開菲爾的黏度影響次序為B＞C＞D＞A，即菌種添加量在四個因素中影響最大，發(fā)酵溫度的影響次之，發(fā)酵時間和均質(zhì)壓力的影響較小，最佳組合為A3B2C2D2。然而，通過表2分析發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時間D1與D2的K值K1與K2十分接近，即發(fā)酵時間23h和26h對黏度影響不大，考慮到節(jié)約能耗以及提高設(shè)備周轉(zhuǎn)等因素，選取D1為最佳值。由此，在表2基礎(chǔ)上優(yōu)化后的最佳組合為A3B2C2D1，即原料乳均質(zhì)壓力21MPa，菌種添加量0.07g/kg，發(fā)酵溫度34℃，發(fā)酵時間23h。經(jīng)驗證實驗顯示，此參數(shù)下無增稠劑開菲爾黏度可達(dá)（0.768±0.04）Pa·s。

表2　L9（34）正交實驗結(jié)果Table 2　L9（34）results of orthogonal test

2.3無增稠劑開菲爾與市售酸奶對比分析

對經(jīng)優(yōu)化后的無增稠劑開菲爾及市售常規(guī)酸奶進(jìn)行各項指標(biāo)檢測，結(jié)果見表3。

由表3分析可知，無增稠劑開菲爾的黏度與含增稠劑的市售酸奶相近，具有良好的穩(wěn)定性和稠厚度。就酸感而言，無增稠劑開菲爾因采用嗜溫型乳酸菌發(fā)酵，酸感更為溫和；就所含的菌群分析可知，市售酸奶不含乳酸乳球菌及腸膜明串珠菌，無增稠劑開菲爾中菌群更為豐富。兩者的風(fēng)味差異較大，這源于主要風(fēng)味物質(zhì)的分布模式不同。綜上，經(jīng)優(yōu)化后的無增稠劑開菲爾的黏度可與添加增稠劑的市售酸奶相媲美，且具有特殊的口感風(fēng)味及益生菌群。

表3　無增稠劑開菲爾與市售酸奶的特征對比Table 3　The comparison on characteristics between kefir without thickeners and commercial yogurt

3　結(jié)論

在無增稠劑開菲爾的生產(chǎn)過程中，均質(zhì)壓力、菌種添加量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間均對產(chǎn)品的質(zhì)地粘度有一定影響。研究得到無增稠劑開菲爾的關(guān)鍵工藝參數(shù)的合理控制點為：均質(zhì)壓力21MPa，菌種添加量0.07g/kg，發(fā)酵溫度34℃，發(fā)酵時間23h。該條件下的無增稠劑開菲爾粘度達(dá)（0.768±0.04）Pa·s。優(yōu)化后的無增稠劑開菲爾黏度可與市售含增稠劑的酸奶產(chǎn)品相媲美，一定程度上改善了無增稠劑體系下產(chǎn)品的貨架期穩(wěn)定性。無增稠劑開菲爾的研發(fā)符合時下消費者對天然健康的訴求，本研究對實際生產(chǎn)具指導(dǎo)意義。

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Research and development of kefir without thickeners

WANG Hao1，YANG Bo-wei2，XU Zhi-yuan1，LIU Zhen-min1，ZHANG Hui3
（1.State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Technology Center，Bright Dairy&Food Co.Ltd.，Shanghai 200436，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Shanghai Deno Products Testing Service Co.，Ltd，Shanghai 200436，China）

The effects of homogenization pressure，additive amount of starter culture，fermentation temperature and fermentation time on texture of kefir without thickeners were investigated by single-factor trial in which the viscosity was selected as the evaluating index.The optimal parameters obtained by orthogonal test were as follows：homogenization pressure 21MPa，additive amount of starter culture 0.07g/kg，fermentation temperature 34℃，fermentation time 23 hours.The viscosity of kefir without thickeners reached 0.768Pa·s under optimal condition，hence not only the texture and stability of end product were improved significantly during storage，but also the typical flavor and probiotics were retained thoroughly.

no thickeners；kefir；viscosity

TS252.54

A

1002-0306（2015）14-0189-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.031

2014－10－13

王豪（1984-），男，碩士，工程師，研究方向：乳品科學(xué)與技術(shù)。

國家“十二五”科技支撐計劃（2012BAD28B07）；國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目（2013GB2C000153）。