朱洪康，孫軍勇，陸　　健，2，*

（1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122；2.宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，江蘇宿遷223800）

紹興腐乳發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)水解及其對成品白點影響的研究

朱洪康1，孫軍勇1，陸健1，2，*

（1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122；2.宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，江蘇宿遷223800）

研究了紹興腐乳發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)水解與酪氨酸含量變化的規(guī)律，分析了不同發(fā)酵時間腐乳樣品的氨基酸態(tài)氮、三氯乙酸-氮溶指數(shù)（TCA-NSI）、游離氨基酸、蛋白質(zhì)水解度（DH）、酪氨酸含量及蛋白質(zhì)分子量變化。結(jié)果表明：紹興腐乳發(fā)酵過程中坯料中酪氨酸隨著氨基酸態(tài)氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH的增加而增加；1～40d內(nèi)主要是7S和11S蛋白質(zhì)的分解，40d以后主要是小分子蛋白質(zhì)的進一步分解。相關(guān)性分析表明，游離酪氨酸的含量與DH的Pearson相關(guān)系數(shù)最高。同時對成熟腐乳的研究發(fā)現(xiàn)有白點腐乳的TCA-NSI、DH和游離酪氨酸顯著高于無白點腐乳，這表明了腐乳中白點的形成是由蛋白質(zhì)過度水解造成的。本研究為紹興腐乳白點的控制提供了參考。

腐乳，白點，酪氨酸，蛋白水解

腐乳又稱乳腐、乳豆腐、霉豆腐、豆腐乳、臭豆腐或長毛豆腐，是我國著名的傳統(tǒng)釀造豆制品和調(diào)味品之一［1］。它是用大豆蛋白的凝乳狀物，經(jīng)過接種微生物、加鹽腌制、加酒后酵、成熟包裝等工藝制成的一種干酪型產(chǎn)品，在歐美地區(qū)被稱為中國干酪［2］。腐乳作為佐餐食品或調(diào)味品，因其滋味鮮美，風(fēng)味獨特，營養(yǎng)豐富，價格低廉而深受國內(nèi)外人們的喜愛［3］。而紹興腐乳與國內(nèi)其他腐乳最為本質(zhì)的區(qū)別在于紹興腐乳配料鹵采用的是具有獨特風(fēng)味和獨特營養(yǎng)與口感的紹興黃酒，使紹興腐乳產(chǎn)生一種與其他腐乳不同的腐乳濃香［4］。

然而，紹興腐乳在貨架期期間表面產(chǎn)生的白色顆粒或片狀物則會影響腐乳的外觀質(zhì)量，影響產(chǎn)品的銷售。這些白色顆?；蚱瑺钗锎蟛糠指皆诟楸砻娴木z體上，也有的沉積于容器底部，一般稱之為腐乳白點［1］。腐乳生產(chǎn)企業(yè)通常采取在標(biāo)簽上注明“本品表面偶有白點或白片，系氨基酸結(jié)晶，食用無妨”。目前對白點的研究集中在白點分析［5］、菌株馴化和酶活控制方面［6-7］。鮑松林［5］分析了腐乳白點的成分，證實其主要成分為酪氨酸（73%～76%）、少量苯丙氨酸和一些菌絲體；何熙［6］、江景泉［7］用酪氨酸對毛霉菌株進行馴化，發(fā)現(xiàn)成熟腐乳中酪氨酸含量明顯降低，從而認(rèn)為可以有效控制白點的產(chǎn)生。

腐乳是豆腐經(jīng)發(fā)酵制成，而已知1kg大豆分離蛋白含有酪氨酸38g［8］。目前對紹興腐乳發(fā)酵過程中酪氨酸形成規(guī)律的研究還未見報道。何冰芳［9］研究發(fā)現(xiàn)豆腐經(jīng)過毛霉發(fā)酵后酪氨酸與苯丙氨酸含量增加7.25倍。本研究通過分析紹興腐乳發(fā)酵過程中大豆蛋白的水解程度與酪氨酸含量的變化，研究酪氨酸的形成規(guī)律，并且分析有白點和無白點的腐乳蛋白質(zhì)水解程度的差異，為腐乳白點的控制提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

腐乳紹興當(dāng)?shù)爻?；毛霉菌株實驗室保藏菌株Mucor sp.SX11；豆坯江蘇無錫農(nóng)貿(mào)市場，含水量80.59%；黃酒浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，酒精度≥12%vol；食鹽江蘇省鹽業(yè)集團有限責(zé)任公司；酪氨酸Sigma-Aldrich公司；乙腈為色譜純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品上海生工生物工程公司；其他試劑均為分析純。

UV-2100紫外-可見分光光度計尤尼柯（上海）儀器有限公司；SCINO KT260凱氏定氮儀福斯賽諾分析儀器（蘇州）有限公司；Agilent 1260高效液相色譜美國安捷倫公司；垂直電泳儀美國Bio-Rad公司；Centrifuge 5415DEppendorf公司；JD-801凝膠成像儀江蘇省捷達科技發(fā)展有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1紹興腐乳生產(chǎn)工藝參見王瑞芝《中國腐乳釀造》中紹興腐乳生產(chǎn)工藝［1］，具體參數(shù)如下：培養(yǎng)基為麩皮10g，水11mL，接種后30℃培養(yǎng)3d，加入200mL無菌水，紗布過濾后用噴壺均勻噴灑到豆坯（24mm× 24mm×14mm）表面，25℃培養(yǎng)2d，腌制時加鹽量為18%，腌至鹽坯食鹽含量≥12%，每14塊坯料加黃酒90mL，室溫發(fā)酵。

1.2.2樣品處理取豆坯、毛坯、腌坯、后酵不同時間的腐乳樣品坯料7塊于漏斗上靜置30min，放入潔凈的研缽中研磨成糊狀后凍干備用；稱取1g凍干粉末于100mL燒杯中，加水20mL煮沸，冷卻后定容至100mL，過濾，取濾液待測。

1.2.3氨基酸態(tài)氮測定甲醛滴定法［1］。

1.2.4三氯乙酸-氮溶指數(shù)（TCA-soluble nitrogen index，TCA-NSI）稱取0.1g樣品粉末，加入0.8mol/L TCA 20mL，振蕩后靜置10min，過濾，取濾液10mL，凱氏定氮法測其中含氮量；另稱取0.1g樣品粉末用凱氏定氮法直接測其含氮量，兩者之比即為三氯乙酸-氮溶指數(shù)［10］。

1.2.5氨基酸分析

1.2.5.1游離酪氨酸分析取0.1g樣品粉末，加入5% TCA 5mL，超聲處理30min后雙層濾紙過濾，取濾液1mL 10000r/min離心10min，取清液100μL與100μL硼酸鈉溶液（pH=10.4）混勻后用高效液相色譜法測定酪氨酸含量。采用HYPERSIL ODS（C18，250mm×4.6mm，5μm）色譜柱，5%的乙腈水溶液為流動相，柱溫40℃，洗脫流速=1.0mL/min，F(xiàn)LD檢測波長：Ex=215nm、Em=283nm［11］。

1.2.5.2游離氨基酸分析上述離心后的上清液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，取1mL，參照莫蓓紅［12］的方法進行。

1.2.6蛋白水解度（degree of hydrolysis，DH）1.2.2濾液稀釋后取2mL，加入2mL茚三酮顯色劑，沸水浴加熱15min，冷卻后加入5mL 40%乙醇溶液混勻，用50mL容量瓶定容，15min后在570nm下測吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得腐乳游離-NH2數(shù)［13］。

準(zhǔn)確稱取0.05g凍干豆腐樣品于水解管中，加入6mol/L的鹽酸10mL，抽真空后用酒精噴燈密封，110℃恒溫器中反應(yīng)24h，水解完后，把水解管開封，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除鹽酸，干涸后用蒸餾水溶解，定容至100mL后過濾；稀釋5倍后取稀釋液2mL按上述方法操作，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得蛋白強酸水解后的總游離-NH2數(shù)。按下式計算：

式中：Nh—不同時間腐乳樣品中的游離-NH2數(shù)（μmol）；N0—豆腐蛋白中固有的游離-NH2數(shù)（μmol）；NT—蛋白強酸水解后的總游離-NH2數(shù)（μmol）。

1.2.7Tricine-SDS-PAGE分析0.1g凍干粉末于2mL離心管，加入15%的TCA-丙酮1mL，振蕩后離心，去掉上清液，重復(fù)2次，用丙酮洗滌沉淀3次后將沉淀晾干，加入1mL溶劑（含8mol/L尿素、1%SDS、1%β-巰基乙醇、0.05mol/L Tris），振蕩后離心，取上清液作為電泳樣品，上樣量為10μL；本實驗采用分析小分子肽的N-三（羥甲基）甘氨酸-十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine-SDS-PAGE），采用三層不連續(xù)膠結(jié)構(gòu)，配制的濃縮膠、夾層膠、分離膠分別為7%、12%、16.5%；陽極緩沖液為Tris 12.11g加水定容至500mL，用6mol/L HCl調(diào)至pH=8.90；陰極緩沖液為Tris 6.06g，Tricine 8.96g，SDS 0.5g，加水定容至500mL；先用40V電泳，樣品離開加樣孔后改用70V電泳至結(jié)束［14］。凝膠在50%甲醇、10%醋酸溶液中固定30min后以考馬斯亮藍R-250染色1.5h，染色結(jié)束后以10%甲醇、10%醋酸脫色至背景清晰，凝膠用JD-801凝膠成像儀記錄。

1.2.8腐乳含氮物質(zhì)分析對市售無白點腐乳和有白點腐乳按上述實驗方法進行含氮物質(zhì)含量分析與顯著性分析。

1.3數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用SPSS 19.0分析軟件進行分析。

2　結(jié)果與分析

2.1氨基酸態(tài)氮與游離酪氨酸含量的變化

由圖1可知，腐乳在后酵過程中，氨基酸態(tài)氮隨著腐乳發(fā)酵的進行而增加，同時腐乳中游離酪氨酸含量也增加。氨基酸態(tài)氮在1～10d內(nèi)變化不明顯，從第10d開始，氨基酸態(tài)氮含量明顯增加，30d以后逐漸下降可能是因為微生物對含氮物質(zhì)的利用；游離酪氨酸含量在1～60d內(nèi)緩慢增加，從60d開始，游離酪氨酸從0.13g/100g增加到0.24g/100g，增加79.45%。這可能是因為以蛋白酶為主的毛霉酶系在毛坯、腌坯和發(fā)酵初期主要在腐乳表面，蛋白質(zhì)水解較慢；隨著后酵的進行，蛋白酶滲入豆坯內(nèi)部，蛋白質(zhì)降解，釋放出氨基端，使得氨基酸態(tài)氮增加，而小分子蛋白質(zhì)和多肽水解成酪氨酸則較慢。

圖1　腐乳發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮與游離酪氨酸變化Fig.1　Changes of the amino nitrogen and free Tyrosine during sufu fermentation

2.2TCA-NSI與游離酪氨酸含量的變化

三氯乙酸能溶解小分子肽類，所以TCA-NSI表示腐乳中小分子肽的含量，從而可以表示蛋白的水解程度。由圖2看出，腐乳經(jīng)過接種培養(yǎng)、腌制和前期發(fā)酵，直到后酵20d，TCA-NSI都是增加的，從20d以后變化趨于平緩，表明此時大分子的豆坯蛋白質(zhì)在毛霉內(nèi)肽酶作用下已基本降解成小分子的肽。同時，游離酪氨酸含量緩慢增加，這說明小分子肽在形成的同時也被外肽酶降解形成酪氨酸。

圖2　腐乳發(fā)酵過程中TCA-NSI與游離酪氨酸變化Fig.2　Changes of the TCA-NSI and free Tyrosine during sufu fermentation

2.3游離氨基酸與游離酪氨酸含量的變化

由圖3發(fā)現(xiàn)，豆坯、毛坯和腌坯時游離氨基酸含量幾乎沒有變化，1～30d內(nèi)，游離氨基酸含量增加緩慢，而游離酪氨酸含量增幅明顯高于游離氨基酸；30～50d內(nèi)，游離酪氨酸增幅卻低于游離氨基酸，這可能是由于外肽酶對小分子肽類作用加快，從而形成氨基酸速度加快；50～70d內(nèi)，游離氨基酸含量趨于穩(wěn)定，此時游離酪氨酸含量在60～70d增幅加快，這可能是因為此時的小分子肽類更適宜被分解成氨基酸。

圖3　腐乳發(fā)酵過程中游離氨基酸與游離酪氨酸變化Fig.3　Changes of free amino acid and free Tyrosine during sufu fermentation

2.4DH與游離酪氨酸含量的變化

水解度表示蛋白質(zhì)被水解的程度，從圖4可以看出，豆坯從接種培養(yǎng)開始水解，毛坯、腌坯和后酵1d時，蛋白水解度幾乎沒有變化，從1d開始到后酵結(jié)束，蛋白水解度逐漸增加，在1～40d內(nèi)變化最明顯，從1.92%增到5.04%。而游離酪氨酸在毛坯、腌坯和后酵1d時含量變化較小，1d以后隨著蛋白質(zhì)的水解度增加而緩慢增加，在發(fā)酵后10d，游離酪氨酸增幅達79.45%，說明腐乳中酪氨酸的含量是隨著蛋白質(zhì)的水解而產(chǎn)生的。

圖4　腐乳發(fā)酵過程中蛋白水解度與酪氨酸變化Fig.4　Changes of the DH of protein and Tyrosine during sufu fermentation

2.5Tricine-SDS-PAGE分析

大豆貯藏蛋白的主要成分是球蛋白，根據(jù)其沉淀特征將其分為2S、7S、11S及15S，分別占總蛋白量的8%、35%、52%及5%，7S組分的分子量在150～180ku，主要是β-伴大豆球蛋白，由α’、α和β 3個亞基構(gòu)成，其分子量分別為72、68、52ku；11S組分的分子量在360ku左右，主要是大豆球蛋白，由酸性和堿性亞基構(gòu)成，其分子量分別為38ku和20ku左右［15］。

由圖5可知，豆坯中蛋白質(zhì)主要為11S組分，其次為7S組分，而7S優(yōu)先被降解，從毛坯到后酵20d，7S組分逐漸降解；11S組分中發(fā)生降解的主要是30～40ku左右的蛋白，蛋白降解后5～25ku分子量的蛋白明顯增加，進入后酵40d時，蛋白質(zhì)條帶的變化已經(jīng)不明顯，說明大分子蛋白質(zhì)的降解已基本結(jié)束，此后直到成熟，腐乳中主要是小分子蛋白質(zhì)或多肽的降解。

圖5　腐乳發(fā)酵過程中Tricine-SDS-PAGE圖譜Fig.5　Tricine-SDS-PAGE during sufu fermentation

2.6相關(guān)性分析

以游離酪氨酸為縱坐標(biāo)，分別以氨基酸態(tài)氮、TCA-NSI、游離氨基酸和DH為橫坐標(biāo)做散點圖，利用SPSS19.0進行兩變量間的相關(guān)性分析，并且進行線性回歸分析，相關(guān)分析結(jié)果見表1。

顯著性（雙側(cè)）小于0.01時，表示在0.01水平上顯著相關(guān)，所以如表1所示，氨基酸態(tài)氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH與游離酪氨酸均在0.01水平上具有極顯著相關(guān)性；Pearson相關(guān)系數(shù)越接近于1說明相關(guān)度越高，表1中DH-游離酪氨酸的Pearson相關(guān)系數(shù)最大，且最接近于1，所以DH-游離酪氨酸的相關(guān)度最高，線性回歸方程的擬合度最好。因此，成熟腐乳中酪氨酸的過量與大豆蛋白的過度水解有很大關(guān)系。

2.7含氮物質(zhì)對白點影響的分析

對市售無白點腐乳和有白點腐乳坯料中的氨基酸態(tài)氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH與游離酪氨酸的曲線擬合模型見圖6，顯著性分析結(jié)果見表2。

表1　氨基酸態(tài)氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH與游離酪氨酸相關(guān)性分析參數(shù)估計值Table 1　The correlation of parameter between amino nitrogen，TCA-NSI，free amino acid，DH and free Tyrosine

圖6　氨基酸態(tài)氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH與游離酪氨酸的曲線擬合模型Fig.6　Curve fitting model between amino nitrogen，TCA-NSI，free amino acid，DH and free Tyrosine

如表2所示，有白點腐乳中氨基酸態(tài)氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH和游離酪氨酸都高于無白點腐乳中的成分。已知當(dāng)顯著性小于0.05時表示測量值有顯著差異。所以，從表2中發(fā)現(xiàn)，有白點腐乳和無白點腐乳的氨基酸態(tài)氮、游離氨基酸無顯著差異；而TCA-NSI、DH和游離酪氨酸有顯著差異。由此可以認(rèn)為，腐乳白點的形成與TCA-NSI、DH和游離酪氨酸有關(guān)。而TCANSI、DH都表示蛋白質(zhì)的水解程度，所以，腐乳白點的產(chǎn)生跟大豆蛋白質(zhì)的過度水解產(chǎn)生過量酪氨酸有關(guān)，這為進一步控制腐乳白點的產(chǎn)生提供了理論參考。

表2　紹興無白點腐乳與有白點腐乳坯料中氨基酸態(tài)氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH與游離酪氨酸分析Table 2　The analysis of amino nitrogen，TCA-NSI，free amino acid，DH and free Tyrosine in Shaoxing sufu phetze without and with white particles

3　結(jié)論

作為傳統(tǒng)大豆發(fā)酵制品，大豆蛋白中的酪氨酸在腐乳發(fā)酵過程中伴隨著蛋白質(zhì)的水解而游離出來。在紹興腐乳發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH和游離酪氨酸都隨著發(fā)酵的進行而增加。通過對腐乳發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮、TCA-NSI、游離氨基酸、DH與游離酪氨酸的相關(guān)性分析以及對成熟無白點腐乳和有白點腐乳中此類含氮物質(zhì)的分析發(fā)現(xiàn)，酪氨酸的產(chǎn)生與蛋白質(zhì)的水解度相關(guān)性最高且有白點腐乳和無白點腐乳中此類含氮物質(zhì)具有顯著差異性。本研究通過跟蹤紹興腐乳發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的水解和酪氨酸含量的變化以及對成熟腐乳的含氮物質(zhì)分析，研究酪氨酸形成及其對成熟腐乳白點形成的影響，為進一步控制腐乳白點提供理論參考。

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Study on the hydrolysis of proteins in the process of Shaoxing sufu fermentation and the influence on white particles in products

ZHU Hong-kang1，SUN Jun-yong1，LU Jian1，2，*
（1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University；The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University；School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Industrial Technology Research Institute of Jiangnan University in Suqian，Suqian 223800，China）

The rules of the protein hydrolysis and the tyrosine content were studied.The changes of amino nitrogen，TCA-soluble nitrogen index（TCA-NSI），free amino acid，degree of hydrolysis（DH），tyrosine and protein molecular weight were analyzed.Results showed that tyrosine increased with the increase of amino nitrogen，TCA-NSI，free amino acid，DH in pehtze during Shaoxing sufu fermentation.The mainly degraded proteins in the first 40 days were 7S and 11S proteins，while the mainly degraded substance after 40 days was low molecular protein.Correlation analysis indicated that the Pearson correlation coefficient of the content of free tyrosine and DH was higher than that of others.Besides this，the TCA-NSI，DH and free tyrosine were higher in sufu with white particles than those in sufu without white particles，so it could be concluded that the white particles in sufu were formed due to the excessive hydrolysis of proteins.This research could provide reference to control white particles in Shaoxing sufu.

sufu；white particles；Tyrosine；hydrolysis of proteins

TS201.1

A

1002-0306（2015）14-0175-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.028

2014－09－01

朱洪康（1989-），男，碩士研究生，主要從事調(diào)味品方面的研究。

陸?。?968-），男，博士，教授，研究方向：啤酒釀造微生物與酶技術(shù)、傳統(tǒng)發(fā)酵領(lǐng)域微生物資源與酶體系、新型生物制劑（大宗飼料原料的生物技術(shù)處理）。

973項目（2012CB720802）；973項目（2013CB733602）；安全食品精深加工科技創(chuàng)新平臺建設(shè)（2012B091400030）；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計劃（111計劃）資助項目（111-2-06）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目。