向　　福，江安娜，項　　俊，*，方元平，付建強，王書珍

（1.經(jīng)濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，黃岡師范學院，湖北黃州438000；2.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北黃州438000）

不同生育期紫蘇葉中β-胡蘿卜素和總黃酮的動態(tài)積累

向福1，2，江安娜1，項俊1，2，*，方元平1，2，付建強1，王書珍1，2

（1.經(jīng)濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室，黃岡師范學院，湖北黃州438000；2.大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北黃州438000）

為了探討紫蘇品種和生育期對紫蘇葉中β-胡蘿卜素和總黃酮含量的影響，指導紫蘇的合理采收和資源化利用，采用高效液相和紫外分光光度法分別測定四種紫蘇葉在營養(yǎng)生長期、開花期和落葉期的β-胡蘿卜素和總黃酮含量。結果表明：四種紫蘇葉中β-胡蘿卜素均在開花期達到最大含量，以河北保定栽培種P11-3紫蘇葉中β-胡蘿卜素含量最高，為4.32mg/g；不同紫蘇葉中總黃酮分別在開花期和落葉期有最大含量，以湖北英山野生種P11-7開花期紫蘇葉中總黃酮含量最高，達83.9mg/g。因此，開花期是利用湖北英山野生紫蘇葉中β-胡蘿卜素和總黃酮的最佳采收期，從而為大別山紫蘇的合理采收和資源化利用提供了理論依據(jù)。

紫蘇葉，β-胡蘿卜素，總黃酮，動態(tài)積累，開花期

紫蘇（Perilla frutescens L.Britt）為一年生草本植物，具有特異芳香味，栽培歷史悠久，既是我國傳統(tǒng)的油料作物，也是衛(wèi)生部首批頒布的藥食兼用植物品種。紫蘇葉富含β-胡蘿卜素、黃酮等多種生物活性物質［1-2］，具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒、降血脂、止血鎮(zhèn)痛等功效［2-3］，可用于開發(fā)改善免疫功能、延緩衰老、抗癌、抗過敏以及心血管疾病相關藥物和功能產(chǎn)品［4］，應用前景廣闊。

近年來，人們探討植物中總黃酮含量的動態(tài)變化的研究較多。研究發(fā)現(xiàn)，不同居群不同部位紫蘇總黃酮含量存在明顯差異［5］，不同品種桑葉中黃酮含量差異較大［6］，不同屬間和品種間豆科牧草總黃酮的動態(tài)變化和不同組織中的分布存在明顯差異［7］。通過黃酮含量的積累變化研究，確定了銀杏葉、射干、荷葉等資源利用的最佳采收期［8-10］。就紫蘇而言，相關研究目前主要集中在化學成分分析、提取工藝優(yōu)化以及藥理作用方面［3-4］，通過探討紫蘇主要活性成分的積累與轉化規(guī)律，進而為紫蘇資源的科學利用和合理采收提供依據(jù)的研究較少。大別山地區(qū)紫蘇資源豐富，區(qū)域紫蘇產(chǎn)業(yè)正在形成。本文擬通過研究四種不同紫蘇葉中β-胡蘿卜素和總黃酮在植株營養(yǎng)生長期、開花期和落葉期的含量變化，探討紫蘇品種和采收期對紫蘇葉資源利用的影響，從而為紫蘇的合理采收和資源化利用提供理論依據(jù)，促進大別山地區(qū)紫蘇產(chǎn)業(yè)的科學發(fā)展。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

重慶豐都紫蘇栽培種P11-1、甘肅慶陽紫蘇栽培種P11-2、河北保定紫蘇栽培種P11-3重慶阿爾康生物工程有限公司；湖北英山紫蘇野生種P11-7湖北李時珍生物科技有限公司；石油醚（30～60℃沸程）、無水乙醇、三氯甲烷、丙酮、二氯甲烷、無水硫酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉天津市凱通化學試劑有限公司，分析純；甲醇天津市凱通化學試劑有限公司，色譜純；蘆丁上海阿拉丁試劑公司，標準品；β-胡蘿卜素中國藥品生物制品檢定所，標準品。

TD5自動平衡離心機長沙平凡儀器儀表有限公司；Waters2695高效液相色譜儀美國Waters公司；Cary-100紫外可見分光光度計美國Varian公司；FA2014電子天平上海精細天平有限公司；SZF-06脂肪測定儀上海精隆科學儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；RE-S2AA旋轉蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠。

1.2實驗方法

播種長至有2對葉片的幼苗時進行移栽，采用完全隨機區(qū)組設計，每小區(qū)面積大約23m2，行間距60cm×45cm。移栽實驗田20d后，開始每隔20d采摘一次葉片，每次按離實驗區(qū)邊界相同距離隨機選擇5個點取樣，采摘方法為全株采摘。根據(jù)紫蘇生長情況，葉片采摘分為營養(yǎng)生長期、開花期和落葉期。將新鮮葉片用清水漂洗除去泥砂后拭干表面水分，自然陰干，粉碎過40目，得紫蘇葉粉，備用。

1.2.1β-胡蘿卜素含量的測定

1.2.1.1色譜條件β-胡蘿卜素標準品樣液掃描，在455nm和481nm處有兩個吸收峰，由于455nm處吸收強度最大，故將其作為檢測波長。色譜條件為：色譜柱Symmetry C18，流動相乙腈-二氯甲烷（體積比80∶20），檢測波長455nm，柱溫30℃，流速1.0mL/min；進樣體積20μL。

1.2.1.2β-胡蘿卜素標準曲線的制作精確配制濃度為500μg/mL的標品母液，分別稀釋成高、低兩種不同濃度范圍的系列標準溶液：10、20、30、40和50μg/mL及1.0、2.5、5.0、7.5和10μg/mL。取各濃度標準溶液，進樣量20μL，平行進樣三次，測得其峰面積值。

1.2.1.3樣品制備及含量測定精確稱取四種紫蘇粉1.25g于離心管中，并加0.1g VC，分次加入石油醚-丙酮（體積比8∶2）混合液24mL，在振蕩器上避光振搖提取15min，無水硫酸鈉脫水，離心后吸取上清液，合并提取液，定容于25mL棕色容量瓶。取該提取液10mL在45℃旋蒸至干得樣品，用10mL甲醇溶解，稀釋100倍后，經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過濾，按色譜條件在455nm波長處測定峰面積。

β-胡蘿卜素標液保留時間為10.975min，樣品保留時間為10.934min，出峰較一致。將樣品色譜圖中相應的色譜峰面積代入回歸方程，利用式（1）計算β-胡蘿卜素含量：

式（1）中，C為樣品中β-胡蘿卜素含量，mg/g；X為進樣液中β-胡蘿卜素濃度，μg/mL；V為定容體積，mL；100為樣品稀釋倍數(shù)；M為樣品質量，g。

1.2.1.4精密度實驗將四種開花期紫蘇粉按上述方法重復提取5份，以相同方法測定β-胡蘿卜素。

1.2.1.5回收率實驗取已測定β-胡蘿卜素含量的P11-3紫蘇粉5份，每份1.25g，分別加入一定量的β-胡蘿卜素標液，按上述方法提取定容，測β-胡蘿卜素回收率。

1.2.2總黃酮含量的測定

1.2.2.1標品液和樣品液制備精確稱取在120℃烘至恒重的蘆丁標準品11.5mg，用50%的乙醇溶液定容至25mL，搖勻，即得濃度為0.46mg/mL的標品液。

根據(jù)文獻方法［11］，分別精確稱取四種紫蘇粉2.5g，先用石油醚脫脂6h，石油醚揮發(fā)干凈后，加入60%乙醇溶液40mL，60℃超聲30min（100W），再恒溫提取1.5h，渣重提一次，合并提取液，旋蒸至干，用50%乙醇溶液溶解過濾后，定容到50mL，搖勻，即得樣品液。

1.2.2.2波長掃描精密量取蘆丁標品液和四種樣品液各0.5mL，置25mL容量瓶中，加50%乙醇溶液5.5mL，加5%NaNO2試液1.0mL，搖勻，放置6min，加10%Al（NO3）3試液1.0mL，搖勻，放置6min，加4% NaOH試液10mL，加50%乙醇溶液至刻度，搖勻，放置15min，以相應試劑作空白，于紫外可見分光光度計上，在波長400～700nm進行波長掃描。

1.2.2.3蘆丁標準曲線的制作精確吸取0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL標品液分別置于25mL容量瓶中，加50%乙醇溶液5.5mL，其余操作同上。

1.2.2.4總黃酮含量的測定取樣品液0.5mL，置25mL容量瓶中，加50%乙醇溶液5.5mL，其余操作同上。在506nm處測定吸光值，由回歸方程計算得樣品液總黃酮濃度，由式（2）計算得樣品中總黃酮含量：

式（2）中，D為樣品中總黃酮含量，mg/g；B為樣品液中總黃酮濃度，mg/mL；V為定容的體積，mL；50為樣品稀釋倍數(shù)；M為樣品質量，g。

1.2.2.5精密度實驗將四種開花期紫蘇粉按上述方法重復提取5份，以相同方法測定總黃酮。

1.2.2.6重現(xiàn)性實驗取開花期河北保定的栽培種P11-3紫蘇粉按上述方法重復提取5份，以相同方法平行測定總黃酮含量。

1.2.2.7回收率實驗取開花期河北保定的栽培種P11-3紫蘇粉5份，各加入蘆丁對照品適量按上述方法制備5份樣品液，每份吸取0.5mL，置于25mL容量瓶中，按上述方法分別測定總黃酮含量。

2　結果與討論

2.1β-胡蘿卜素的含量變化

2.1.1β-胡蘿卜素含量測定β-胡蘿卜素在1.0～10μg/mL范圍內線性關系良好，回歸方程為：Y= 9678.1X-5936.9，R2=0.9988。其中，Y為色譜峰面積，X為進樣液中β-胡蘿卜素濃度（μg/mL）。根據(jù)式（1）計算四種紫蘇在不同生育期其葉中β-胡蘿卜素的含量，結果如表1所示。方差分析表明，在不同生育期各品種紫蘇葉中β-胡蘿卜素含量差異極顯著（p＜0.01）。表1中精密度實驗RSD在1.81%～5.87%，表明測定方法精密度較高?；厥章蕦嶒炈忙?胡蘿卜素平均回收率為93.66%，RSD為6.48%。

2.1.2β-胡蘿卜素含量變化規(guī)律從表1可知，除重慶豐都的栽培種P11-1外，P11-2、P11-3、P11-7三種紫蘇葉中β-胡蘿卜素含量從營養(yǎng)生長期到開花期均有所增加，特別是河北保定的栽培種P11-3，其葉中β-胡蘿卜素積累效應最為顯著，從營養(yǎng)生長期到開花期增加了35%，β-胡蘿卜素含量高達4.32mg/g，含量和增量均遠高于其他品種。到了落葉期，除湖北英山的野生種P11-7紫蘇葉中β-胡蘿卜素含量由3.18mg/g降為2.9mg/g外，P11-1、P11-2、P11-3三種紫蘇葉中均檢測不到β-胡蘿卜素。

光合作用是植物生理代謝的基礎，為植物的生長發(fā)育提供物質能量。β-胡蘿卜素作為光合作用過程中的光保護色素和天線色素，在保護光和器官、防止光氧化損傷等方面具有重要作用［12-13］。表1中結果表明，紫蘇葉中含有豐富的β-胡蘿卜素（四種紫蘇葉中最低也達到2.44mg/g），其主要營養(yǎng)生長期和開花期大量積累和轉化，在落葉期β-胡蘿卜素則迅速減少。這可能是由于紫蘇在營養(yǎng)生長期處于不斷生長新葉階段，紫蘇葉不斷發(fā)育，β-胡蘿卜素的含量逐漸增加，為光合作用提供支持，到開花期紫蘇葉完全發(fā)育，β-胡蘿卜素含量達到最大；落葉期時，由于葉片衰老、纖維化以及營養(yǎng)物質轉移等原因［14］，紫蘇葉片生理活動減弱、β-胡蘿卜素合成能力降低，含量急劇下降。食葉紅紫蘇葉中β-胡蘿卜素含量在不同生育期也有相同的變化規(guī)律［15］。

表1　不同生育期不同品種紫蘇葉中β-胡蘿卜素含量及精密度實驗分析Table 1　The β-carotene contents in leaves of Perilla frutescens at different development stages and precision test

另外，不同品種紫蘇葉中β-胡蘿卜素含量變化較大。在相同種植背景下，河北保定的栽培種P11-3紫蘇葉中β-胡蘿卜素含量最高，分別是重慶豐都栽培種P11-1的1.6倍，甘肅慶陽栽培種P11-2的1.5倍和湖北英山野生種P11-7的1.4倍。在四種紫蘇中，又以湖北英山野生種P11-7較為獨特，紫蘇葉在落葉期仍有高達2.9mg/g的β-胡蘿卜素含量。

盡管不同采收期、不同品種紫蘇葉中β-胡蘿卜素含量存在較大差異，但都在開花期接近最大值，以河北保定栽培種P11-3紫蘇葉中β-胡蘿卜素含量最高，其次為湖北英山野生種P11-7。

2.2總黃酮的含量變化

2.2.1總黃酮含量測定蘆丁標品液和各樣品溶液均在506nm處有最大吸收，故選506nm為測定波長。同時，在顯色反應結束10min后，取同一樣品在506nm波長進行穩(wěn)定性考察發(fā)現(xiàn)，在30min內吸光度穩(wěn)定。本實驗選擇在加NaOH后20min測吸光度，得吸光值（A）與蘆丁濃度（B）的回歸方程為：A=10.084B-0.0003，R2=0.9998，線性關系良好。

根據(jù)式（2）計算不同生育期四種紫蘇葉中總黃酮含量，結果如表2所示。方差分析表明，在不同生育期各品種紫蘇葉中總黃酮含量均差異顯著（p＜0.1）。表2中精密度實驗RSD在1.11%～3.40%范圍，表明測定方法精密度較高。

表2　不同生育期不同品種紫蘇葉中總黃酮含量及精密度實驗分析Table 2　The total flavonoids contents in leaves of Perilla frutescens at different development stages and precision test

回收率實驗所得總黃酮平均回收率為97.87%，RSD為0.70%，說明測定方法準確可靠。重現(xiàn)性實驗測定總黃酮平均含量為52mg/g，RSD為1.81%，表明重現(xiàn)性良好。

2.2.2總黃酮含量變化規(guī)律從表2可知，四種紫蘇葉中總黃酮含量在營養(yǎng)生長期均較低，其中以甘肅慶陽的栽培種P11-2最低，總黃酮含量14.7mg/g；含量較高的為河北保定的栽培種P11-3和湖北英山野生種P11-7，其葉中總黃酮含量分別有19.4mg/g和19.1mg/g。

植株生長到開花期，四種紫蘇葉中總黃酮含量急劇增加，其中湖北英山野生種P11-7增量最大，由生長期的19.1mg/g劇增到開花期的83.9mg/g，總黃酮含量增加了3.4倍；重慶豐都的栽培種P11-1也由17.1mg/g劇增到67.1mg/g，開花期總黃酮含量是生長期的3.9倍；河北保定的栽培種P11-3次之，開花期總黃酮含量52.0mg/g，是生長期的2.7倍；總黃酮含量增長最低的是甘肅慶陽的栽培種P11-2，開花期總黃酮含量是生長期的2.6倍。

落葉期時，各品種紫蘇葉中總黃酮含量無明顯的整體變化趨勢。如表2所示，河北保定栽培種P11-3和湖北英山野生種P11-7紫蘇葉總黃酮含量呈下降趨勢，從開花期到落葉期P11-3紫蘇葉則在落葉期未檢測出黃酮，P11-7紫蘇葉總黃酮含量降低了11.6%；相反，重慶豐都栽培種P11-1和甘肅慶陽栽培種P11-2紫蘇葉總黃酮則在落葉期繼續(xù)合成積累，含量分別增加了4.5%和30.3%。上述結果表明，紫蘇葉中含有豐富的黃酮類化合物，且在開花期大量合成和積累。

作為次生代謝產(chǎn)物，總黃酮的合成積累是以葉片成熟為前提，以光合產(chǎn)物為基礎［16］。隨著植物從幼苗生長到開花期，紫蘇葉片漸為成熟，光合作用能力增強，初生和次生代謝活動旺盛，從而在開花期形成黃酮合成高峰，積累了較多的黃酮類物質成分，總黃酮含量急劇增加。在落葉期，由于紫蘇籽的充分生長和成熟，需要紫蘇葉提供大量營養(yǎng)物質，使得紫蘇葉中的黃酮類物質大量轉移至紫蘇籽中，同時由于代謝機能變緩，紫蘇葉的次生代謝逐漸降低，而紫蘇葉中原有黃酮類物質也因持續(xù)參與代謝而消耗，導致P11-7紫蘇葉在落葉期的總黃酮含量呈下降趨勢，甚至在落葉期的P11-3紫蘇葉中未檢測到總黃酮。

早期人們研究桂葉巖薔薇葉中黃酮的積累規(guī)律發(fā)現(xiàn)，葉片活躍生長時，葉中黃酮類物質合成較快，會產(chǎn)生一個黃酮合成高峰，在植物葉片停止生長而接近衰老時又會出現(xiàn)一個黃酮合成高峰［17］。P11-1和P11-2紫蘇在落葉期紫蘇籽已趨于成熟，對總黃酮需求量減少，且可能再次出現(xiàn)黃酮合成高峰，從而導致P11-1和P11-2紫蘇葉總黃酮含量在落葉期反常增加。

紫蘇葉總黃酮含量的變化還與品種種質不同有關。在營養(yǎng)生長期，不同品種紫蘇葉中總黃酮含量較為一致，差別較小。在開花期和落葉期，紫蘇品種對葉中總黃酮含量的影響特別顯著。開花期時，湖北英山野生種P11-7紫蘇葉中總黃酮含量高達83.9mg/g，甘肅慶陽栽培種P11-2紫蘇葉中總黃酮含量只有37.6mg/g，前者是后者的2.2倍。落葉期時，P11-1和P11-7紫蘇葉中總黃酮含量均超過70mg/g，在四種紫蘇中含量最高，而河北保定栽培種P11-3紫蘇葉中甚至檢測不到總黃酮。表2結果說明，不同紫蘇品種間紫蘇葉黃酮含量存在巨大差異，而部分品種間紫蘇葉總黃酮含量又趨一致。紫蘇葉總黃酮含量在不同品種間變化的這種二重性與人們報道的銀杏葉黃酮含量變化的二重性一致［16，18］。

因此，不同采收期、不同品種紫蘇葉中黃酮含量存在較大差別，P11-3和P11-7紫蘇葉在開花期采收總黃酮含量較高，P11-1和P11-2在落葉期采收總黃酮含量較高；就品種而言，以湖北英山野生種P11-7紫蘇葉中總黃酮含量最高。在開發(fā)利用紫蘇葉中黃酮時，應注意不同品種和不同采收期的影響。

3　結論

為科學利用紫蘇葉中總黃酮和β-胡蘿卜素等活性成分，應注意不同紫蘇品種和不同采收期對其含量變化的影響。開花期是利用紫蘇葉β-胡蘿卜素的最佳采收期，而利用紫蘇葉總黃酮的最佳采收期則應視具體品種而確定為開花期或落葉期。就大別山紫蘇資源利用而言，開花期則是利用湖北英山野生紫蘇葉中總黃酮和β-胡蘿卜素的最佳采收期。不同生育期紫蘇葉中β-胡蘿卜素和總黃酮的積累變化研究為紫蘇資源的合理采收和資源化利用提供了理論依據(jù)，有利于促進大別山地區(qū)紫蘇產(chǎn)業(yè)的科學發(fā)展。

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Dynamic accumulation of flavonoids and β-carotene in leaves of Perilla frutescens at different stages of development

XIANG Fu1，2，JIANG An-na1，XIANG Jun1，2，*，F(xiàn)ANG Yuan-ping1，2，F(xiàn)U Jian-qiang1，WANG Shu-zhen1，2
（1.Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization，Huanggang Normal University，Huangzhou 438000，China；2.Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains，Huangzhou 438000，China）

In order to investigate the accumulation of flavonoids and β-carotene in leaves of Perilla frutescens，the contents of flavonoids and β-carotene in four kinds of perilla leaves at different stages of development，namely vegetation，blossom，and defoliation phases，were determined by UV spectrophotometry and HPLC，respectively.Results showed that β-carotene in perilla leaf were greatly accumulated at blossom phase and the highest content of β-carotene was in the leaf of Baoding-cultivar P11-3 with 4.32mg/g and flavonoids contents reached the maximum at blossom or defoliation phases with the highest content of total flavonoids being in leaf of Yingshan-wild-specie P11-7 with 83.9mg/g.Consequently，the best harvest period of perilla leaf for the development and utilization of flavonoids and β-carotene in Yingshan-wild-specie P11-7 was blossom phase，which provided theoretical basis for the reasonable harvest and utilization of perilla resources in Dabie Mountains.

folium perillae；β-carotene；total flavonoids；dynamic accumulation；blossom phase

TS255.1

A

1002-0306（2015）14-0143-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.021

2015－01－30

向福（1977－），男，博士，副教授，主要從事生物資源利用方面的研究。

項?。?963-），男，教授，主要從事天然植物資源利用方面的研究。

生物資源保護與利用湖北省重點實驗室開放基金（PKLHB1103）。