許海棠，盧建芳，趙彥芝，周菊英

（廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530006）

山豆根提取物抗氧化和抑菌活性的研究

許海棠，盧建芳，趙彥芝，周菊英

（廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530006）

研究山豆根不同溶劑（氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇）提取物的抗氧化活性和抑菌活性，通過(guò)測(cè)定四種提取物的DPPH自由基、ABTS自由基、羥自由基的清除能力以及還原能力來(lái)評(píng)估其抗氧化能力；并通過(guò)測(cè)試各提取物對(duì)7種實(shí)驗(yàn)菌的最低抑菌濃度（MIC）來(lái)評(píng)估它們的抑菌活性。結(jié)果表明：山豆根四種溶劑提取物均具有一定的抗氧化能力和抑菌活性，其中，對(duì)DPPH自由基的清除效果最佳，EC50均小于0.2mg/mL；乙酸乙酯提取物對(duì)金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用，其MIC為0.313mg/mL。

山豆根，提取物，抗氧化，抑菌

山豆根為豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep．）的干燥根及根莖，主產(chǎn)于廣西、云南、貴州等地。始載于《開(kāi)寶本草》，藥性苦寒，有毒。具有清熱解毒，消腫利咽之功效。近代臨床常用于治療咽喉腫痛、濕熱黃疸以及心律失常等病癥。山豆根化學(xué)成分豐富，主要成分有生物堿和黃酮化合物，還含有香豆素、蒽醌、甾醇、咖啡酸、脂肪酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖等成分。

據(jù)目前已有的研究表明，山豆根具有抗炎［1-2］、抗病毒［3］、免疫［4］、保肝［5］、抗腫瘤［6-8］以及改善心血管系統(tǒng)循環(huán)［9-10］的作用。胡庭俊等研究發(fā)現(xiàn)山豆根醇提取物、多糖具有抗氧化及抑菌作用［11］。但是，迄今為止，尚未見(jiàn)有關(guān)系統(tǒng)考察山豆根不同極性部位的抗氧化性能及抑菌效果的報(bào)道。本文采用4種體外抗氧化評(píng)價(jià)方法對(duì)山豆根不同極性溶劑提取物進(jìn)行抗氧化能力的測(cè)定，并測(cè)定其對(duì)7種常見(jiàn)病原菌的最低抑菌濃度，以評(píng)估山豆根不同溶劑提取物的抗氧化性和抑菌性，旨在更好地指導(dǎo)臨床用藥，并進(jìn)一步篩選活性成分，為促進(jìn)山豆根的綜合開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

山豆根購(gòu)于廣西南寧老百姓大藥房，產(chǎn)地廣西；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS［2，2’-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽］均購(gòu)于sigma公司；牛肉浸膏、蛋白胨、標(biāo)準(zhǔn)菌種（金黃色葡萄球菌CMCC26003、大腸埃希菌CMCC44102、銅綠假單胞菌CMCC10104、普通變形桿菌CMCC49027、肺炎克雷伯氏菌CMCC46117、乙型溶血性鏈球菌ATCC21059、白色念珠球菌ATCC10231）均購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑國(guó)產(chǎn)分析純。

UV-1800島津紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)蘇州島津儀器有限公司；RE-52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；PL203電子天平梅特勒-托利多儀器有限公司；SPS401F型電子天平奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司；AJF-1001-U型基礎(chǔ)性純水器艾科浦公司；DP-06A高速中藥粉碎機(jī)浙江大鵬機(jī)械有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；SPH-2102型恒溫?fù)u床上海世安實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1山豆根提取物的制備山豆根經(jīng)粉碎后過(guò)40目篩，稱取100g，用600mL石油醚回流1.5h，揮干濾渣中的石油醚后，用氯仿回流提取2h，過(guò)濾，共提取2次，合并兩次濾液，得氯仿提取液。同樣，揮干濾渣中上次溶劑后，接著依次用乙酸乙酯、正丁醇、乙醇回流提取，每種溶劑各提取2次，每次2h，過(guò)濾，分別合并兩次濾液。四種濾液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾，濃縮物真空干燥至干，得到山豆根不同溶劑提取物，備用。

1.2.2樣品溶液的制備抗氧化活性樣品溶液：先用二甲基亞砜（DMSO）溶解山豆根各提取物，配成20mg/mL的樣品溶液，用之前用乙醇稀釋至適宜濃度，進(jìn)行測(cè)試。抑菌實(shí)驗(yàn)的樣品溶液：先用DMSO溶解山豆根各提取物，配成100mg/mL的樣品溶液，用之前用無(wú)菌水稀釋至10mg/mL，備用。

1.2.3抗氧化活性測(cè)定

1.2.3.1清除DPPH自由基能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)［12］的方法，在517nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品及對(duì)照品抗壞血酸（VC）對(duì)DPPH自由基的清除能力，平行測(cè)定3次，計(jì)算清除率。

1.2.3.2清除ABTS自由基參考文獻(xiàn)［13］的方法，稍作修改。在734nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品及對(duì)照品VC對(duì)ABTS自由基的清除能力，平行測(cè)定3次，計(jì)算清除率。

1.2.3.3清除羥自由基參照文獻(xiàn)［14］的方法，在536nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品及對(duì)照品VC對(duì)羥自由基的清除能力，平行測(cè)定3次，計(jì)算清除率。

1.2.3.4還原力測(cè)定參照文獻(xiàn)［15］，在700nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品及對(duì)照品VC的還原能力，平行測(cè)定3次，記錄吸光值。

1.2.4抑菌性研究

1.2.4.1菌懸液的制備挑取適量菌種到50mL無(wú)菌肉湯，放置恒溫?fù)u床培養(yǎng)，細(xì)菌在37℃培養(yǎng)24h，白色念珠球菌于28℃培養(yǎng)48h。各菌株活化后，用無(wú)菌生理鹽水稀釋并校正菌液濃度至0.5號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁埽喈?dāng)于1.5×108cfu/mL，再稀釋100倍作為上樣菌懸液，備用。

1.2.4.2最低抑菌濃度的測(cè)定參照文獻(xiàn)［16］，采用試管二倍稀釋法測(cè)定MIC。取10支滅菌試管，各管分別加入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基1mL。在第1管中加入1mL滅菌的10mg/mL山豆根各提取物溶液，混勻后吸取1mL加入到第2管中，依此類推，直至第8管。第8管吸取1mL棄去，使其形成1∶2、1∶4、1∶8等濃度梯度。向1～8管中分別加入0.1mL菌懸液。第9管只加菌液0.1mL作為陽(yáng)性對(duì)照，以觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況；第10管不加菌液，作為陰性對(duì)照。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，將各細(xì)菌管置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，白色念珠球菌管置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

2.1抗氧化活性的測(cè)定

2.1.1清除DPPH自由基能力由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各提取物對(duì)DPPH自由基都表現(xiàn)出一定程度的清除能力，并呈明顯的量效關(guān)系，但各提取物的清除能力都稍弱于VC。

當(dāng)樣品濃度為0.1mg/mL時(shí)，4種提取物的清除DPPH自由基能力最強(qiáng)的是乙酸乙酯部，其清除率可達(dá)80%；而清除力最差的是乙醇部位，未達(dá)40%；氯仿和正丁醇部位能力接近，達(dá)到50%左右。

隨著濃度的增大，各提取物的清除能力也相應(yīng)增大，當(dāng)濃度為0.5mg/mL時(shí)，4個(gè)部位的樣品清除能力相差很小，都達(dá)到了90%以上。說(shuō)明山豆根各提取部位對(duì)DPPH自由基的清除能力較好。

圖1　樣品和VC對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.1　Scavenging effect of sample and VCon DPPH radical

2.1.2清除ABTS自由基能力由圖2可知，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各個(gè)溶劑提取物對(duì)ABTS自由基都表現(xiàn)出一定程度的清除能力，并且其清除率（Y）與各提取部位的質(zhì)量濃度（x）呈近似線性關(guān)系，擬合直線，得到各線性方程如表1所示。

圖2　樣品和VC對(duì)ABTS自由基的清除作用Fig.2　Scavenging effect of sample and VCon ABTS radical

通常，清除自由基的活性用清除率為50%時(shí)的抗氧化劑質(zhì)量濃度（EC50）表示，EC50值與抗氧化活性呈負(fù)相關(guān)，EC50值越小，抗氧化劑清除自由基能力越強(qiáng)。從表1可以看出，清除率與各提取部位質(zhì)量濃度之間呈良好的線性關(guān)系，利用線性方程計(jì)算出氯仿部、乙酸乙酯部、正丁醇部、乙醇部的EC50值分別為1.08、0.55、1.27、3.08mg/mL。由此可知，山豆根不同溶劑提取物清除ABTS自由基的能力依次是乙酸乙酯部＞氯仿部＞正丁醇部＞乙醇部。

表1　ABTS自由基清除率與各部位質(zhì)量濃度的線性關(guān)系Table 1　The linear relationship between ABTS radical scavenging ratio and the concentration of different extracts

2.1.3清除羥自由基能力由圖3可知，在實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各個(gè)溶劑提取物對(duì)羥自由基都表現(xiàn)出一定程度的清除能力，并呈明顯的量效關(guān)系。山豆根不同溶劑提取物清除羥自由基的能力相差比較明顯，大小順序依次是氯仿部＞乙酸乙酯部＞正丁醇部＞乙醇部。氯仿部清除羥自由基的能力遠(yuǎn)優(yōu)于其他部位，與VC的清除能力接近；而乙醇部的清除能力很弱。將清除率（Y）與各提取部位的質(zhì)量濃度（x）關(guān)系線擬合直線，得到各線性方程如表2所示。由線性方程計(jì)算出氯仿部、乙酸乙酯部、正丁醇部的EC50值分別為1.33、2.80、5.00mg/mL。

圖3　樣品和VC對(duì)羥自由基的清除作用Fig.3　Scavenging effect of sample and VCon hydroxyl radical

表2　羥自由基清除率與各部位質(zhì)量濃度的線性關(guān)系Table 2　The linear relationship between hydroxyl radical scavenging ratio and the concentration of different extracts

山豆根各提取物均具有清除自由基的能力。胡庭俊等報(bào)道的山豆根多糖、醇提物的清除自由基的實(shí)驗(yàn)中［11，17］，也得到山豆根具有清除自由基的作用的結(jié)論。在本實(shí)驗(yàn)中，山豆根各提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用最強(qiáng)，其次是清除ABTS自由基的能力，清除羥自由基的能力稍弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，清除DPPH自由基與清除ABTS自由基的能力的強(qiáng)弱順序是一致的，而清除羥自由基的能力則不盡相同?？梢?jiàn)，相同極性部位的提取物，在不同的抗氧化體系中，其抗氧化能力也不同。這可能是由于山豆根提取物不同極性部位中所含抗氧化成分的種類和結(jié)構(gòu)不同，從而對(duì)不同類型的自由基具有選擇性清除作用的結(jié)果。

2.1.4還原能力測(cè)定山豆根不同溶劑提取物的還原力結(jié)果見(jiàn)圖4。通常，吸光值越大，還原能力就越強(qiáng)。由圖4可以看出，4個(gè)提取部位的吸光度值（A）與各部位的質(zhì)量濃度（x）呈明顯的量效關(guān)系，擬合直線，得到各線性方程如表3所示。令吸光值為0.5，由表3中的線性方程計(jì)算出氯仿部、乙酸乙酯部、正丁醇部、乙醇部的EC50值分別為0.60、0.64、0.51、0.84mg/mL。從圖4可以看出，當(dāng)樣品濃度較低時(shí)，山豆根各溶劑提取物的還原能力相差不大。隨著濃度的增大，各提取物還原能力逐漸增大，差距也增大。當(dāng)濃度為1.0mg/mL時(shí)，還原能力大小依次是正丁醇部＞氯仿部＞乙酸乙酯部＞乙醇部，均弱于VC的還原能力。

圖4　樣品和VC的還原能力Fig.4　Reducing power of sample and VC

表3　還原能力吸光值與各部位質(zhì)量濃度的線性關(guān)系Table 3　The linear relationship between reducing power and the concentration of different extracts

2.2山豆根提取物最低抑菌濃度（MIC）

表4是山豆根4種溶劑提取物對(duì)6種細(xì)菌和1種霉菌的抑制結(jié)果，MIC越低，則抑菌效果越好。從表4可以看出，山豆根各提取部位對(duì)6種常見(jiàn)細(xì)菌的抑制作用最強(qiáng)的是乙酸乙酯提取部位，尤其是對(duì)金黃色葡萄球菌，其MIC只有0.313mg/mL，而活性最差的乙醇提取物抑制金黃色葡萄球菌的MIC是5mg/mL。這結(jié)果明顯優(yōu)于胡庭俊等［11］研究的山豆根總生物堿的最小抑菌濃度62.5mg/mL，山豆根醇提物的最小抑菌濃度為31.25mg/mL。說(shuō)明采用本實(shí)驗(yàn)的提取方法所獲得的提取物抑制金黃色葡萄球菌的能力比山豆根總生物堿和醇提物的抑菌能力強(qiáng)。

其次是氯仿部位，它對(duì)普通變形桿菌和銅綠假單胞菌的抑制作用最強(qiáng)，抑制其他實(shí)驗(yàn)菌的能力僅次于乙酸乙酯部位。正丁醇提取部位對(duì)這6種細(xì)菌的抑制作用都比較弱，乙醇提取部位對(duì)這6種細(xì)菌的抑制作用是4種溶劑提取物中最弱的。乙酸乙酯、氯仿提取物均能抑制白色念珠球菌，這與吳榮達(dá)等在研究山豆根水煎液對(duì)白色念珠菌的抗菌作用得到的結(jié)論吻合［18］。

表4　樣品對(duì)實(shí)驗(yàn)菌的最低抑菌質(zhì)量濃度（mg/mL）Table 4　MIC of samples to the test bacteria（mg/mL）

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用了4種體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法對(duì)山豆根不同溶劑提取物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選。結(jié)果表明，山豆根的不同溶劑提取物都具有一定的抗氧化活性，但它們的抗氧化活性差別較大，其中乙酸乙酯部位和氯仿部位抗氧化性較強(qiáng)，正丁醇部位和乙醇部位抗氧化性較弱。此外，在抑菌活性測(cè)試實(shí)驗(yàn)中，乙酸乙酯部位和氯仿部位對(duì)7種實(shí)驗(yàn)菌都顯示了一定的抑制作用，尤其是乙酸乙酯提取物表現(xiàn)了較強(qiáng)的抑菌性。綜合上述結(jié)果可得出山豆根乙酸乙酯提取部分和氯仿提取部分的抗氧化及抑菌活性最好，可將其作為研究重點(diǎn)，進(jìn)一步分離有效活性成分，確定山豆根抗氧化及抑菌的化學(xué)物質(zhì)。

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Antioxidant and antibacterial activity of extracts from Sophora tonkinensis Gagnep

XU Hai-tang，LU Jian-fang，ZHAO Yan-zhi，ZHOU Ju-ying
（Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products，College of Chemistry and Chemistry Engineering，Guangxi University for Nationalities，Nanning 530006，China）

To study the antioxidant and antibacterial activity of different extracts from Sophora tonkinensis Gagnep. The chloroform，ethyl acetate，butanol and ethanol extracts were obtained by backflow-extraction.DPPH，ABTS，OH radical scavenging assays and reducing power assay were used to measure the antioxidant activity. And seven common test bacterias were employed to test the antibacterial activity in vitro.The result indicated that different extracts from Sophora tonkinensis Gagnep exhibited good antioxidant activity，especially for DPPH radical，which EC50＜0.2mg/mL.The antibacterial experiments in vitro showed that the ethyl acetate extract had the obvious antibacterial effect on the Staphylococcus aureus and the minimum inhibitory concentration was 0.313mg/mL.

Sophora tonkinensis Gagnep；extracts；antioxidant；antibacterial

TS201.2

A

1002-0306（2015）14-0111-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.013

2014－11－03

許海棠（1975-），女，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向：藥用植物資源開(kāi)發(fā)。

廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（YB2014100）；廣西自然科學(xué)基金（2013GXNSFBA019035）；國(guó)家自然科學(xué)基金（51203027）。