李維峰，王婭玲，郭　芬，高云濤

（1.云南農(nóng)業(yè)大學熱帶作物學院，云南普洱665000；2.云南民族大學化學與生物技術學院，云南昆明650031）

定心藤醇提物不同極性部分的體外抗氧化活性研究

李維峰1，王婭玲1，郭芬1，高云濤2，*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學熱帶作物學院，云南普洱665000；2.云南民族大學化學與生物技術學院，云南昆明650031）

研究定心藤75%乙醇提取物不同極性部位的體外抗氧化活性，采用5種不同極性溶劑萃?。ㄊ兔?、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水）得到5種萃取物，分別測定黃酮含量，并通過還原能力測定、DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力4種測定方法，對各萃取物抗氧化能力進行研究。結(jié)果顯示，各提取物對Fe3+均有一定的還原能力，乙酸乙酯萃取物還原效果最為明顯；定心藤不同極性部位均具有一定的抗氧化活性，乙酸乙酯萃取物抗氧化能力最強，DPPH·的半數(shù)清除濃度IC50為0.28mg/mL，羥自由基半數(shù)清除濃度IC50為0.41mg/mL，在0.2mg/mL濃度下，對超氧陰離子自由基的清除率達到42.88%，而其黃酮含量最高，達到609.96mg/g，這也許與它具有較高的抗氧化活性有關。說明乙酸乙酯萃取物具有較好的開發(fā)天然抗氧化劑的前景。

定心藤，不同極性部位，抗氧化活性，總黃酮

傣族“雅解”藥中定心藤稱為鄧嘿罕，是“雅解”藥多種單方或復方解藥的重要藥物之一，為茱萸科植物定心藤（Mappianthus iodioides Hand.Mazz）的干燥藤莖。據(jù)《傣藥學》記載該藥性涼，微苦，澀、平，祛風活絡，消腫、解毒，用于風濕性腰酸腿痛，手足麻痹，跌打損傷等癥［1］。相關研究表明，定心藤中含有黃酮、多糖、有機酸、強心苷、皂苷和鞣質(zhì)等多種化學成分［2-5］，研究這些成分的藥理活性作用，對開發(fā)定心藤類藥物、保健品，促進我國民族醫(yī)藥的發(fā)展具有重要意義。

前人研究發(fā)現(xiàn)，定心藤中多糖及揮發(fā)性油類均具有一定的抗氧化活性［6-7］，而其總黃酮類提取物對DPPH具有較強的清除作用［8］，但對定心藤的抗氧化作用僅局限于從其活性成分的總類（如總多糖、總揮發(fā)油和總黃酮）上進行研究，具體是這些活性成分的何種結(jié)構(gòu)或何部分物質(zhì)起到主要抗氧化作用，目前還未見研究報道。

因此，本文專門采用五種極性溶劑對定心藤乙醇提取物進行萃取，獲得五種不同的極性部分，通過比較各部分黃酮含量、清除DPPH自由基、羥自由基的能力和超氧陰離子自由基以及還原能力，比較各極性萃取物抗氧化能力，目的在于探討定心藤抗氧化作用機理，為定心藤的進一步開發(fā)提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

定心藤2013年10月采自云南省普洱市柏枝寺，采集樹齡5年的定心藤地上無損傷部分約1kg，經(jīng)云南農(nóng)業(yè)大學熱帶作物學院馬曉老師鑒定為真品。樣本切片，于60℃干燥后粉碎過40目篩，冷藏備用；蘆丁標準品（HPLC≥98%） 購自上海士鋒科技有限公司，20mg/瓶，產(chǎn)品批次：20140212；其他試劑均為國藥集團分析純。

FW-200萬能粉碎機北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SK5210HP超聲清洗儀上?？茖С晝x器有限公司；UV759紫外-可見分光光度計上海精科儀器有限公司；AL204電子分析天平梅特勒-托利多公司；DZF-6053真空干燥箱上海一恒科學儀器有限公司；EV321旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀萊伯泰科有限公司；HC-3018高速冷凍離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品制備取800g上述定心藤粉末，用8L 70%乙醇回流提取4h，過濾，濾渣重新用8L 70%乙醇回流提取兩次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干得到31.215g提取物浸膏，浸膏用500mL去離子水分散溶解后，依次用600mL石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇各萃取三次，合并各部分萃取液，減壓蒸干，得到定心藤醇提物的不同極性萃取物備用。

1.2.2定心藤不同極性萃取物黃酮含量的測定

1.2.2.1標準曲線繪制總黃酮含量的測定采用分光光度法，配制0.2mg/mL蘆丁為標準溶液，分別取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00mL于25mL比色管中，加入1mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后放置6min，然后加入1mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻后放置6min，再加入6mL 4%氫氧化鈉溶液，用30%乙醇定容至刻度線［9］，搖勻，放置15min，于510nm測定吸光度，以吸光度A為縱坐標，蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.2.2黃酮含量的測定不同極性萃取物分別配制成濃度為0.5mg/mL的樣品液，精確移取0.5mg/mL的各極性部位萃取液1mL，按照1.2.2.1的方法于510nm處測定其吸光度值，并利用回歸方程計算各極性部位的黃酮含量。

1.2.3還原力的測定采用Galbe的方法［10］，不同極性萃取物配制10個濃度（0.025、0.1、0.15、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4mg/mL）梯度樣品液，取20mL的試管，加入3mL 0.2mol/L pH=6.6的磷酸緩沖溶液、2.5mL不同濃度樣品液、2.5mL 1%鐵氰化鉀，搖勻后50℃水浴20min，快速冷卻，加2.5mL質(zhì)量濃度10%三氯乙酸，離心10min（3000r/min），取5mL上清液，分別加1mL 0.1%的三氯化鐵，超純水4mL，放置10min后，700nm測吸光度。以同等濃度的抗壞血酸作為陽性對照，進行實驗。每一吸光度值平行測定3次，取平均值。

1.2.4清除羥自由基能力的測定參考陳留勇等的水楊酸法［11］，并略加改動。利用雙氧水和亞鐵離子混合產(chǎn)生羥自由基，再向反應液中加入水楊酸，使其反應產(chǎn)生有色化合物，在510nm處測定其吸光度值。實驗時，不同極性萃取物配制13個濃度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mg/mL）梯度樣品液，取1支20mL試管，依次加入樣品液2mL、9mmol/L硫酸亞鐵溶液2mL、0.1%雙氧水溶液2mL，混勻靜置10min，然后加入9mmol/L水楊酸2mL，混勻，37℃水浴反應30min，流水冷卻，12000r/min離心6min，上清液在510nm處測定其吸光度值為A1；以蒸餾水代替雙氧水得到的吸光度值為空白對照A0，以70%乙醇代替樣品溶液作為本底液吸光度值A2，樣品液對羥自由基的清除率：

K（%）=［1-（A1-A0）/A2］×100

以相同濃度的VC做陽性對照。每個樣品平行測定3次，取平均值。

1.2.5超氧陰離子自由基清除能力的測定參照萬軍等的鄰苯三酚自氧化法［12］。不同極性萃取物配制8個濃度（0.05、0.1、0.15、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL）梯度樣品液，取50mmol/L pH8.2的Tris-HCl緩沖液4.5mL，加入3.2mL蒸餾水于試管中，放到25℃水浴中預熱20min，分別加入1mL不同濃度的樣品溶液，立即加入0.3mL 25℃水浴中預熱的3mmol/L鄰苯三酚，迅速混勻，然后放置于25℃水浴中精確反應4min，立即加入2滴8mol/L HCl終止反應，以蒸餾水代替樣品溶液做空白實驗，以10mmol/L HCl代替鄰苯三酚溶液作為調(diào)零空白，320nm處測定各管的吸光度值，每個樣品重復實驗3次，取平均值，以VC做陽性對照，樣品液對超氧自由基的清除率

K（%）=［（A0-A1）/A0］×100

式中，A0對照組吸光度值；Ai為樣品組吸光度值。

1.2.6DPPH自由基清除能力的測定參考Tseng等的方法［13］，不同極性萃取物配制11個濃度（0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mg/mL）梯度樣品液，取0.325mmol/L DPPH乙醇溶液2mL，加入2mL樣品溶液，搖勻，在黑暗處放置20min，以無水乙醇為空白在517nm處測定其吸光度，每個樣品平行測定3次，樣品液對DPPH的清除率：

K（%）=｛1-［（A1-A3）/A2］｝×100

式中，A1：樣品溶液2mL+DPPH液2mL溶液的吸光度；A2：DPPH液2mL+無水乙醇2mL溶液的吸光度；A3：樣品液2mL+無水乙醇0.5mL溶液的吸光度。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理與作圖，以上測定均重復三次，圖中數(shù)據(jù)均為三次重復平均值加標準差。

2　結(jié)果與分析

2.1定心藤乙醇提取物不同極性部分的黃酮含量比較

圖1　蘆丁的標準曲線Fig.1　The standard curve of rutin

由圖1可知，蘆丁溶液質(zhì)量濃度x（mg/mL）與y（吸光度值A）的回歸方程：y=12.559x+0.0034，相關系數(shù)R2=0.9996，線性范圍為0.008～0.056mg/mL。

圖2　定心藤乙醇提取物不同極性部分的黃酮含量Fig.2　Total flavonoids contents of different polar fraction from ethanol extract of Mappianthus iodioides

定心藤不同極性部位黃酮含量如圖2所示。由圖2可以看出，乙酸乙酯相中黃酮類物質(zhì)明顯高于其他各極性部位，達到609.96mg/g，而在氯仿相（260.00mg/g）和正丁醇相（311.03mg/g）中黃酮類也明顯多于其他兩種溶劑，水相中存在的黃酮類物質(zhì)較少，為150.1mg/g，石油醚相中黃酮類化合物最少，僅為118.92.96mg/g。測定表明，黃酮類化合物在極性溶劑中的溶解度順序為：乙酸乙酯相＞正丁醇相＞氯仿相＞水相＞石油醚相。

2.2定心藤乙醇提取物不同極性部分的還原力測定

抗氧化劑的活性與其還原能力存在密切的聯(lián)系，抗氧化劑通過提供電子使具有氧化活性的自由基還原而達到清除自由基的效果，所以其還原力越強，則抗氧化活性越高。因此可以根據(jù)還原力的大小判斷抗氧化劑活性的強弱［14］。如圖3所示，在實驗測定范圍內(nèi)各極性部位實驗樣品濃度與還原力呈正相關，隨著試液濃度增大，還原力均不斷增強，表明定心藤各極性萃取物均具有一定的還原力，但是，在同等濃度下，它們的還原能力始終弱于VC。根據(jù)圖3，在低濃度范圍內(nèi)，乙酸乙酯相與其他萃取相的還原能力差異不大；但隨著濃度的逐漸增加，乙酸乙酯相的還原能力明顯高于其他相，還原能力順序為：乙酸乙酯相＞正丁醇相＞氯仿相＞水相＞石油醚相。

圖3　定心藤乙醇提取物不同極性部分的還原能力（n=3）Fig.3　Reducing power of different polar fraction from ethanol extract of Mappianthus iodioides（n=3）

2.3定心藤乙醇提取物不同極性部分的DPPH自由基清除能力比較

DPPH可以在有機溶劑中形成穩(wěn)定的自由基，呈紫紅色，在517nm處有強吸收。當存在自由基清除劑時，由于自由基清除劑與其單電子配對而使其吸收消失，其褪色程度與所接受的電子數(shù)成定量關系［15］。定心藤不同極性醇提物和VC對DPPH·的清除作用結(jié)果見圖4。由圖4可知，定心藤各極性部位均表現(xiàn)出較強的DPPH·的清除能力，尤其是乙酸乙酯相，在0.5mg/mL的濃度下，對DPPH·清除作用可以達到同等VC濃度的77%。經(jīng)過實驗得出DPPH·被清除一半時各極性部位的所需的濃度（IC50）分別為石油醚相0.94mg/mL、氯仿相0.44mg/mL、乙酸乙酯相0.28mg/mL、正丁醇相0.49mg/mL、水相0.87mg/mL。

圖4　定心藤乙醇提取物不同極性部分的DPPH自由基清除能力（n=3）Fig.4　Scavenging DPPH·activities of different polar fraction from ethanol extract of Mappianthus iodioides（n=3）

2.4定心藤乙醇提取物不同極性部分的超氧陰離子自由基清除能力比較

超氧陰離子自由基是生物體內(nèi)較穩(wěn)定的一類自由基，通?？梢耘c其他物質(zhì)反應產(chǎn)生其他自由基，從而對生物體產(chǎn)生傷害［16］。定心藤各極性部位對超氧陰離子自由基的清除作用見圖5。由圖5中可以看出，定心藤各極性部位表現(xiàn)出的清除超氧陰離子自由基的能力差異較大，其中乙酸乙酯部分清除能力最強，在0.2mg/mL濃度下，其對超氧陰離子自由基的清除率達到42.88%，而正丁醇部分為33.42%，水相部分為20.75%，氯仿部分為20.64%，石油醚部分僅為9.12%，說明乙酸乙酯部分對超氧陰離子的清除作用最好，石油醚部分最差。與VC相比較，在0.2mg/mL濃度下，乙酸乙酯部分對超氧陰離子自由基等清除作用大約為VC的59.5%。

圖5　定心藤乙醇提取物不同極性部分的超氧陰離子自由基清除能力（n=3）Fig.5　Scavenging superoxide anion free radical activities of different polar fraction from ethanol extract of Mappianthus iodioides（n=3）

2.5定心藤乙醇提取物不同極性部分的羥自由基清除能力比較

圖6　定心藤乙醇提取物不同極性部分的羥自由基清除能力（n=3）Fig.6　Scavenging hydroxyl free radical activities of different polar fraction from ethanol extract of Mappianthus iodioides（n=3）

羥自由基對生物組織危害性較強，其會導致細胞膜系統(tǒng)氧化損傷，進而影響膜的流動性，使膜通透性升高，引起膜內(nèi)物質(zhì)外泄。羥自由基也會使生物體內(nèi)生物大分子氧化，對生命活動產(chǎn)生危害［17-18］。定心藤不同極性部位對羥自由基的清除能力如圖6所示。由圖6中可知，定心藤不同極性部位均具有一定的清除羥自由基的能力，且有明顯的量效關系，其中乙酸乙酯清除羥自由基能力最強，在2.0mg/mL濃度下，清除率大小順序為乙酸乙酯相＞正丁醇相＞氯仿相＞水相＞石油醚萃相；在此濃度下，與陽性對照VC相比，乙酸乙酯相、氯仿相、正丁醇相、水相、石油醚相對羥自由基的清除率分別為VC的95.2%、60.63%、61.6%、41.9%、32.6%，即乙酸乙酯部分對超氧陰離子自由基的清除能力與VC大體相當，其他極性部位的清除能力弱于VC。

3　結(jié)論

定心藤乙醇提取物的不同極性萃取物抗氧化實驗結(jié)果表明，不同極性萃取物均具有抗氧化活性，其中以乙酸乙酯相抗氧化能力最強，其次是氯仿相和正丁醇相，最弱的為水相及石油醚相，這與黃酮類化合物在各極性部位的分部相一致，從而說明黃酮類化合物可能是定心藤中抗氧化活性的主要成分。

乙酸乙酯極性部位相對于其他極性部位表現(xiàn)出較強的還原能力和清除自由基的能力，可以作為定心藤抗氧化活性成分研究的主要極性部位進行深入研究。本實驗為從定心藤中提取分離有效成分提供一定思路參考，并為進一步探討定心藤的抗氧化機制提供了一定的理論基礎，也為定心藤進一步資源化利用和相關產(chǎn)品的開發(fā)提供了技術支撐。

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Study on antioxidative activities in vitro of different polarity fractions of ethanol extract from Mappianthus iodioides Hand.Mazz

LI Wei-feng1，WANG Ya-ling1，GUO Fen1，GAO Yun-tao2，*
（1.Faculty of Tropical Crops，Yunnan Agricultural University，Puer 665000，China；2.School of Chemistry and Biotechnology，Yunnan Nationalities University，Kunming 650031，China）

To investigate the antioxidant activities in vitro of different polarity fractions of 75%ethanol extract from Mappianthus iodioides，five polarities of extracts were obtained by using different polarity solvents，such as petroleum，chloroform，ethyl acetate，normal butyl alcohol and water.The content of flavonoids was detected by absorption spectroscopy.Their antioxidant activities were evaluated by reduction energy capability and scavenging capability of DPPH，hydroxyl free radical and superoxide anion free radical.The results showed that all of the extracts had strong deoxidization ability of Fe3+.Ethyl acetate extracts had significant deoxidization ability.All the different polarity fractions of extract antioxidant activities were observed，of which the ethyl acetate extract had highest antioxidant activity，and 50%inhibitory concentration（IC50）of DPPH of the ethyl acetate extract was 0.28mg/mL，50%inhibitory concentration（IC50）of·OH of the ethyl acetate extract was 0.41mg/mL.When the concentration of the ethyl acetate extract reached to 0.2mg/mL，O2-·scavenging rate was 42.88%.In addition，total flavonoids content of ethyl acetate extract was significantly higher than that of others，reached to 609.96mg/g，which might related with its higher antioxidant activity.It was indicated that ethyl acetate extract of 75%ethanol extract from Mappianthus iodioides had good development potential for natural antioxidant.

Mappianthus iodioides；different polarity fractions；antioxidant activity；total flavones

TS255.1

A

1002-0306（2015）14-0107-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.14.012

2014－11－18

李維峰（1981-），男，碩士，講師，主要從事天然產(chǎn)物化學方面的研究。

高云濤（1962-），男，教授，主要從事分析科學與技術方面的研究。

云南省教育廳科學研究基金一般項目（2013Y536）。