張中華楊愛梅

（甘肅省中醫(yī)院藥學部1 蘭州理工大學生命科學與工程學院2 甘肅 蘭州 730050）

響應面法優(yōu)化沙米總黃酮提取工藝的研究

張中華1，2楊愛梅2

（甘肅省中醫(yī)院藥學部1 蘭州理工大學生命科學與工程學院2 甘肅 蘭州 730050）

目的：采用雙水相法萃取沙米中總黃酮，通過響應面法優(yōu)化獲得最佳萃取工藝條件。方法：采用無水乙醇（C2H5OH）/硫酸銨（（NH4）2SO4）雙水相體系分離沙米中的黃酮，通過單因素試驗和Box-Benhnken實驗設計探討黃酮粗提液質量分數(shù)、NaCl質量分數(shù)和pH值對萃取效果的影響。結果：最佳萃取條件為：黃酮粗提液質量分數(shù)13.88%、NaCl質量分數(shù)2%、pH8，在此條件下，沙米中總黃酮主要分布在上相，萃取率可達到91.29%。結論：在此條件下進行驗證實驗，結論與理論值基本吻合，表明該模型合理有效。

響應面法；雙水相體系；沙米；總黃酮

沙米（Agtiopllyllum squarrosum） 屬黎科沙蓬屬的種子，又稱沙蓬，主要分布于中國東北、華北、西北及河南等地區(qū)，是一種耐寒、耐旱的沙生植物。作為沙漠野生植物，安全、營養(yǎng)、無污染，中醫(yī)中稱之為天然減肥食品和心腦血管、腎臟功能減退、糖尿病人的理想食品［1］，故沙米是一種“藥食同源”的綠色食品。而其中有一種重要營養(yǎng)成分黃酮。沙米中黃酮分子量小，能被人體吸收，能通過血腦屏障，能進入脂肪組織，進而體現(xiàn)出如下功能：消?；钅X、抗脂肪氧化、抗衰老、保護血管、防動脈硬化、擴張毛細管疏通微循環(huán)的功能。黃酮類化合物還具有抗癌抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調節(jié)、降血糖等作用［2］。因此，越來越多的植物黃酮被開發(fā)并應用到食品添加劑、醫(yī)藥以及化妝品等行業(yè)［3］。

本試驗采用C2H5OH/（NH4）2SO4雙水相體系萃取沙米中的黃酮。分別考察了C2H5OH質量分數(shù)，（NH4）2SO4質量分數(shù)，NaCl質量分數(shù)，粗提液質量分數(shù)，pH對沙米黃酮萃取率的影響，對影響萃取率的三因素進行Box-Benhnken實驗，獲取最佳萃取條件。目前沙米黃酮提取尚未見報道，如果能夠對其加以開發(fā)利用，可以充分利用沙漠野生資源。本實驗對沙米總黃酮的提取工藝進行了研究，以便為更好地開發(fā)利用野生沙米資源提供可靠依據。

1、材料與方法

1.1 材料與試劑

沙米（粉末），C2H5OH、（NH4）2SO4、氯化鈉均為分析純。722型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司制造）；超聲波微波組合系統(tǒng)（南京先歐儀器制造有限公司）；電子天平（梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司）；超級恒溫水?。〒P州市三發(fā)電子有限公司）；循環(huán)水真空泵（鞏義市京華儀器有限責任公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗提液制備

稱取沙米6.0g，溶于60mL50%C2H5OH中，超聲輔助提取10min，抽濾，得粗提液。

1.2.2 標準曲線的制作

本文采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH體系絡合化學吸光法［4］測定黃酮含量，510nm處測定吸光值。利用陳陽等方法獲得標準曲線方程為：Y=1.2450X-0.0024（R2=0.99920）。

1.2.3 雙水相萃取方法

稱取一定量的C2H5OH、（NH4）2SO4和粗提液，使總體系達到10.0g，溶解混合，在一定條件下靜置形成雙水相體系，所得體系總黃酮富集于上相，下相為（NH4）2SO4相。待萃取完成后，準確測定上、下相體積，求萃取率。相比R=Vt/Vb；

分配系數(shù)K=Ct/Cb；萃取率Y%=KR/（KR+1）×100%（Vt為上相體積/ml；Vb為下相體積/ml；Ct為上相黃酮濃度/（mg/ml）；Cb 為下相黃酮濃度/（mg/ml））。

1.2.4 單因素實驗

分別取不同的C2H5OH質量分數(shù)、（NH4）2SO4質量分數(shù)、粗提液質量分數(shù)、NaCl質量分數(shù)、pH值測其黃酮含量，以選擇最佳的各單因素取值范圍。

1.2.5 Box-Benhnken實驗設計及驗證實驗

在單因素基礎上，以粗提液質量分數(shù)、NaCl質量分數(shù)、pH值為影響因素，進行Box-Benhnken設計實驗，以選擇最佳提取工藝條件并進行驗證實驗。

2.1 確定雙水相體系

2.1.1 C2H5OH質量分數(shù)對雙水相體系的影響

在雙水相體系中，（NH4）2SO4質量分數(shù)為22%，改變C2H5OH的質量分數(shù)，在室溫條件下靜置使其分相，對上下相溶液進行測定，結果如圖1。

由圖1可知，當C2H5OH質量分數(shù)為27%時，沙米黃酮提取率最大83.2%。當C2H5OH質量分數(shù)超過27%時，兩相體系出現(xiàn)（NH4）2SO4不能完全溶解的現(xiàn)象。說明最佳C2H5OH質量分數(shù)為27%。

2.1.2 (NH4)2SO4質量分數(shù)對雙水相體系的影響

在雙水相體系中，取C2H5OH的質量分數(shù)27%，改變（NH4）2SO4的質量分數(shù)，室溫條件下靜置使其分相，對上下相溶液進行測定，結果如圖2。

由圖2可知，在（NH4）2SO4質量分數(shù)小于14%時溶劑體系不成相，這主要是因為（NH4）2SO4質量分數(shù)很低時鹽析效果不明顯。當（NH4）2SO4質量分數(shù)為16%時，沙米黃酮的萃取率最大87.2%，而隨著（NH4）2SO4質量分數(shù)的增加，其萃取率逐漸減少，原因當（NH4）2SO4的質量分數(shù)過高時，鹽析作用過強，另外（NH4）2SO4質量分數(shù)增加，乙醇相體積會減少，相比降低，黃酮將被部分析出［5］。故22%-24%（NH4）2SO4時有部分不溶解沉淀沉在底層。因此（NH4）2SO4的最佳質量分數(shù)為16%。

2.2 單因素的確定

2.2.1 粗提液質量分數(shù)對萃取效果的影響

在27%C2H5OH-16%（NH4）2SO4雙水相體系中，改變粗提液質量分數(shù)。室溫條件下靜置使其分相，對上下相溶液進行測定，結果如圖3。由圖3可知，粗提液質量分數(shù)為12%時，其沙米總黃酮萃取率達85.6%。隨著粗提液質量分數(shù)持續(xù)增加，粗提液體積大，粗提液在濃縮時體積的增大，濃縮時間變長而部分被氧化，使沙米總黃酮萃取率逐漸減小。而粗提液質量分數(shù)太小，提取不完全［6］。因此最佳粗提液質量分數(shù)為12%。

圖1 C2H5OH質量分數(shù)對雙水相體系的影響

圖2 (NH4)2SO4質量分數(shù)對雙水相體系的影響

2.2.2 NaCl質量分數(shù)對萃取效果的影響

在27%C2H5OH-16%（NH4）2SO4雙水相體系中，12%粗提液下加入不同質量分數(shù)的NaCl，室溫條件下靜置使其分相，對上下相溶液進行測定，結果如圖4。由圖4可知，NaCl質量分數(shù)為1.5%時，其萃取率最大77%，原因是加入少量無機鹽時，由于無機鹽的正負離子在兩相系統(tǒng)中分配不同，將在兩相間產生電位差，兩相間電位差的變化，縮短了分相時間，提高了相分離速度［7］，沙米黃酮在上相的分配增加，隨著NaCl質量分數(shù)的繼續(xù)加大，其萃取率減小，因為萃取相的極性增強，使沙米黃酮的溶解度下降，而出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象［7］。因此，最佳NaCl的質量分數(shù)選擇1.5%。

2.2.3 pH值對沙米黃酮萃取效果的影響

在27%C2H5OH-16%（NH4）2SO4雙水相體系中，加入1.5%的NaCl后，再加入12%的粗提液，改變pH值。室溫條件下靜置使其分相，對上下相溶液進行測定，結果如圖5。由圖5可知，當pH值為7時，沙米黃酮萃取率達到最大；pH＞7時，隨著pH值的增大萃取率減小，因pH＞7，使黃酮雜環(huán)鏈裂解，導致萃取率降低。因此最佳體系pH值選擇中性。

圖3 粗提液質量分數(shù)對萃取效果的影響

圖4 NaCl質量分數(shù)對沙米黃酮萃取效果的影響

圖5 pH值對沙米黃酮萃取效果的影響

由圖5可知，在當pH＜7時，沙米黃酮萃取率隨著pH值的增大而增大；當pH值為7時，沙米黃酮萃取率達到最大；當pH＞7時，隨著pH值的增大萃取率減小，是因為當pH＞7時，使黃酮雜環(huán)鏈裂解，導致萃取率降低。因此選擇pH7。

2.3 曲面響應法對提取沙米黃酮工藝的優(yōu)化結果分析

在27%C2H5OH-16%（NH4）2SO4雙水相萃取體系中影響萃取率的3個因素（粗提液質量分數(shù)、NaCl質量分數(shù)、pH值）為考察對象，按表1進行3因素17水平優(yōu)化實驗，以提取率為指標，考察綜合因素對提取率的影響，選擇最佳沙米總黃酮提取工藝參數(shù)，實驗水平見表1，結果見表2。

表1 響應面設計的因素與水平Table1 The factors and level of response surface design

表2 Box-Benhnken實驗設計及響應值表(N=17)Table2 Box-Benhnken experimental design and response value (N=17)

2.3.1 Box-Benhnken實驗數(shù)據分析

以萃取率為響應值，根據表2結果，用Design-Expert8.6.0軟件進行多元回歸分析，結果如表3。經回歸擬合后得到的回歸方程為：Y=52.44-0.525A+6.7625B+1.9375C+3.525AB+3.975AC-0.6BC+1.105A2+20.48B2+5.73C2（A、B、C分別代表粗提液、pH、NaCl的編碼值）。

表3 響應面方差分析Table3 response surface analysis of variance

由表3可知，模型Pr＞F值小于0.0500，說明該模型是極顯著的；B、B2影響極顯著，C2影響顯著，其余項影響不顯著［11］。模型失擬項＞F值為0.606，說明回歸方程具有很好的擬合度。同時，模型的相關系數(shù)R2=0.949256，表明94.9256%的實驗數(shù)據的變異性可用此回歸模型來解釋［8］。變異系數(shù)（C.V）反映模型的置信度，C.V值越低模型的置信度越高，本實驗的C.V值為6.69445%，說明模型方程可以很好地反映真實的實驗值，因此，我們可以用該模型來分析響應值的變化［9］。

2.3.2 響應面交互作用分析與優(yōu)化

為了進一步研究相關變量之間的交互作用以及確定最優(yōu)點，通過Design-Expert8.6.0軟件繪制響應面曲線圖來進行分析，見圖6。通過軟件分析計算，得到沙米黃酮萃取率最大時的工藝條件為：A=0.94，B=0.96，C=1.00，即粗提液質量分數(shù)為13.88%，pH值為8，NaCl質量分數(shù)為2%，此時萃取率預測值為92.5033%。在此條件下進行驗證實驗，結果沙米黃酮的萃取率為91.29%，與理論值基本吻合，表明該模型合理有效。

圖6 粗提液質量分數(shù)、pH值、NaCl質量分數(shù)對萃取率交互作用的等高線圖Fig.6 crude extract concentration, pH value, NaCl concentration on the extraction rate of the interaction of contour maps

3、討論

雙水相萃取與傳統(tǒng)方法相比，具有如下優(yōu)點：不存在有機溶劑殘留、分相時間短、萃取周期短易于生產、能除去大量雜質和固體物質、易于工程放大和連續(xù)操作等，被廣泛應用于生物化工、天然活性產物等領域［10］。國內外有將該體系用于天然活性成分的研究，但側重于如何提高目標產物萃取率，忽略了目標成分與雜質的分離問題，若經離心分相，方能得到界面清晰的雙水相體系，從而萃取過程中不易發(fā)生乳化，能更好地除去不溶性雜質。針對這一情況，本實驗運用C2H5OH/（NH4）2SO4體系，在保證分離效果的前提下，系統(tǒng)地考察了該體系對沙米黃酮的萃取條件，而且使沙米中黃酮與樣品溶液中其他物質得到有效分離。本研究為黃酮的萃取分離提供了一種有效方法，旨在為沙米黃酮的分離純化和開發(fā)利用提供一定的依據。

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Optimization of extraction technology of total fl avonoids from Agtiopllyllum squarrosum using response surface analysis

ZHANG Zhong-hua1YANG Ai-mei2
The phamaceutical department of Gansu provincial hospital of Traditional Chinese Medicine， College of Life Science and Engineering， Lanzhou University of Technology Lanzhou，730050，Gansu，China；

Abstrect:Objective: Optimization of extraction technology of total flavonoids from Agtiopllyllum squarrosum using response surface analysis.Method:An aqueous two-phase system composed of 27%C2H5OH and 16%Na2SO4 was used to extract total flavonoids from Agtiopllyllum squarrosum.The effects of crude extract mass fraction， NaCl mass fraction and pH value on the extraction efficiency of total flavonoids were explored by one-factor-at-a-time and Box-Benhnken design methods.Result:The optimal aqueous two-phase extraction conditions were crude extract mass fraction of 13.88%， NaCl mass fraction of 2% and pH of 8and extraction rate of 91.29%.Conclusion: Under this condition， the experiment is carried out， and the conclusion is basically in agreement with the theoretical value， which indicates that the model is reasonable and effective..

Response surface method； Aqueous two-phase system； Agtiopllyllum squarrosum； Flavonoids

R284.2