梁俊琴 伊力努爾·哈力甫 鄒云敏 羅東 袁虎 普雄明

皮膚鱗狀細胞癌組織中SFRP1基因啟動子甲基化研究

梁俊琴 伊力努爾·哈力甫 鄒云敏 羅東 袁虎 普雄明

目的 探討SFRP1與皮膚鱗狀細胞癌（鱗癌）臨床病理的關(guān)系及其在鱗癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用機制。方法 用MassARRAY質(zhì)譜儀EpiTYPER甲基化方法檢測鱗癌組織，癌旁組織和正常皮膚組織各40例樣本中SFRP1基因啟動子甲基化狀態(tài)。結(jié)果 共完成SFRP1基因啟動子2個片段17個CpG位點1951個CpG單位（1951/2255，86.52%）的甲基化評估，鱗癌與癌旁組織相比、癌旁組織與正常組織相比分別檢測出10個CpG位點（10/17，58.82%），5個CpG位點（5/17，29.41%）甲基化率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。檢測到SFRP1基因啟動子3個位點在不同組織病理級別差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其甲基化率鱗癌Ⅲ級＞鱗癌Ⅱ級＞鱗癌Ⅰ級。結(jié)論 SFRP1在皮膚鱗癌中呈現(xiàn)高甲基化率，可能參與了鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程。

癌，鱗狀細胞；DNA甲基化；信號傳導(dǎo)；SFRP1；基因啟動子

皮膚鱗狀細胞癌（鱗癌）是常見的皮膚腫瘤之一。研究表明，鱗癌發(fā)病除了與紫外線照射尤其是長波紫外線、放射性損傷、人類乳頭瘤病毒（HPV）感染、炎癥病變長期潰瘍、癌基因突變等因素相關(guān)之外，還與一些遺傳及表觀遺傳因素有關(guān)，越來越多的分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在惡性腫瘤中的作用受到關(guān)注［1］。Wnt信號通路是生物進化中具有高度同源性，相對保守的信號通路，也是細胞發(fā)育和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生長的一個關(guān)鍵途徑［2］。我們用EpiTYPER甲基化方法檢測40例皮膚鱗癌，癌旁組織和正常皮膚組織中Wnt信號通路抑制因子SFRP1基因啟動子甲基化狀態(tài)，探討其可能的作用機制，為皮膚鱗癌表觀遺傳學(xué)發(fā)病機制提供一定依據(jù)。

對象與方法

一、對象

7例（17.50%）；未見Ⅳ級。其中男23例，女17例，年齡45.3～93.1.0歲，平均年齡（63.86±4.14）歲，病程6～203個月，平均（23.41±1.28）個月；②癌旁組織組：上述患者取皮膚鱗癌癌旁組織1～2 cm；③正常對照組：40例正常人取自整形科手術(shù)切除正常皮膚，兩組年齡和性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

二、主要材料與儀器

DNA提取盒（德國 Qiagen公司）；EZ DNA Bisulfite Treatment試劑盒和MassCleavetm Reagent試劑盒 （日本 TaKaRa公司）；Nanodispenser、MassARRAY質(zhì)譜儀（美國Sequenom公司）。

三、方法

1.基因組DNA的提取及濃度純度檢測：將組織蠟塊切成5～10 μm薄片，取10～15片放入微量離心管中，按照DNA提取盒操作步驟進行提取。用超微量紫外分光光度計檢測記錄DNA濃度、A260/A230的比值和A260/A280的比值。A260/A280的比值在1.6～1.9之間表明核酸樣品無蛋白質(zhì)污染，為合格樣本；＜1.6說明樣品中有蛋白質(zhì)的污染。DNA濃度＞20 ng/μl為合格樣本。

2.引物設(shè)計：軟件進行引物設(shè)計得到SFRP1基因CpG島可擴增片段，選擇其中2段作為目的片段。分別標記為SFRP1_1、SFRP1_2。SFRP1_1引物序列：5′-CATGTGTGCCTGAGTGATGGACTTGGTAT TTACACCAGCCACGCTGATAAGTGCACATGTGTTT TTAATGTTTTGGCTTTCCACACCACAAACACACAG ATGTGCTGTCGCCCGGGCTAGGACTTGAGTAGGGT TTTTCTATTTAAATATATATTATATATTTAAAAAAG TGTCCTCCCAGAGCTAATACCGTTGCTAGCAGCTC TTCCTGCCGCCACACCGGGCAAAGTCCACCCACTG CCCCAGTGTTGAGGGCCACCATGGGCGGCCCCAC CTGGAGAGGTGCTGCTC-3′。SFRP1_2引物序列：5′-AGTTTGGGAGGCCAAGGCAGGAGCATCACCTGA GGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCTAACATGG TGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAAATTA GCGGGGGCATGGTGGCACGCGGCTGTAATCCCAG CTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGA ACCCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTCAGCGGAGATA GCGCCATTGCACTCCAGCTTAGGCAACAAGAGCG AAACTGTCTCAAAAAAAAAAAGTCTTCATAATTTC ATGGGTTTGCAAGTATGATCCAGGCTCC-3′。

3.EpiTYPER甲基化檢測步驟：①將樣本加入CT轉(zhuǎn)化劑等按照步驟進行基因組DNA亞硫酸氫鹽處理；②按照反應(yīng)條件，將準備好的配置堿基特異性酶切混合物混勻，離心后放置到384反應(yīng)中按照條件循環(huán)進行PCR擴增反應(yīng)；③從PCR儀中取出樣品進行蝦堿性磷酸酶處理，PCR擴增產(chǎn)物（SAP純化）后進行片段化及樹脂交換；④將所有準備好的樣本放入MassArray點樣儀，逐一點樣，點好樣本的芯片放入MassArray質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜檢測，在數(shù)據(jù)服務(wù)器上通過EpiTYPER數(shù)據(jù)軟件進行分析。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

EpiTYPER軟件對SFRP1基因啟動子甲基化質(zhì)譜分析；運用SPSS17.0軟件計算皮膚鱗癌，癌旁組織及正常組織組織中SFRP1各CpG單位平均甲基化率及標準誤差。皮膚鱗癌組與癌旁組織比較采用配對秩和檢驗，兩組與正常對照組的比較采用Mann-WhitneyU檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、3組樣本中SFRP1各CpG單位甲基化率比較結(jié)果

在鱗癌與正常組織比較中檢測到，除了CpG2_8、CpG 2_11、CpG 2_12三個位點之外，其余14個CpG位點（14/17，82.35%）在皮膚鱗癌的SFRP1基因CpG位點甲基化率高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。皮膚鱗癌與癌旁組織相比較有10個（10/17，58.82%）CpG位點甲基化率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），10個CpG位點分別為CpG 1_2、CpG 1_5、CpG 1_6、CpG 1_7、CpG 2_1、CpG 2_2、CpG 2_3、CpG 2_4.5、CpG 2_6、CpG 2_12，皮膚鱗癌SFRP1基因甲基化率高于癌旁組織。癌旁組織與正常組織中有5個（5/17，29.41%）甲基化CpG位點差異有統(tǒng)計意義（均P＜0.05），分別是CpG 1_6、CpG 2_1、CpG 2_2、CpG 2_4.5、CpG 2_6。這5個CpG位點甲基化率在癌旁組織高于正常對照組織，結(jié)果見表1，2。

二、SFRP1各CpG位點甲基化率在皮膚鱗癌不同組織病理分級的比較

SFRP1共2個CpG片段17個CpG位點591個（86.91%）CpG單位的甲基化率與皮膚鱗癌病理分級比較，結(jié)果見表3，其中3個SFRP1 CpG位點，分別是CpG 1_5、CpG 1_7、CpG 2_8，在不同病理級別差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其位點甲基化率鱗癌Ⅲ級＞Ⅱ級＞Ⅰ級。

表1 皮膚鱗狀細胞癌（鱗癌）組織、癌旁組織與正常皮膚組織中SFRP1各CpG位點甲基化率比較

表2 皮膚鱗狀細胞癌（鱗癌）組織與癌旁組織中SFRP1各CpG位點甲基化率比較

三、SFRP1各CpG位點甲基化的受試者工作特征曲線

運用 SPSS17.0軟件繪制SFRP1的2個CpG片段17個CpG位點1951個（1951/2255，86.52%）CpG單位甲基化率的ROC曲線，判斷各位點甲基化檢測對皮膚鱗癌診斷識別能力的比較。SFRP1 CpG 1_1-4位點甲基化ROC曲線最靠左上角，提示該CpG位點高甲基化率檢測皮膚鱗癌識別能力最高。

討論

皮膚鱗癌的發(fā)生是一個多因素參與的、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜過程，涉及遺傳、感染、物理、化學(xué)、免疫等多種因素，其最終導(dǎo)致不可調(diào)控的細胞異常增殖而誘發(fā)腫瘤［4］。研究顯示，腫瘤發(fā)病研究熱點包含遺傳學(xué)機制和表觀遺傳學(xué)兩大機制［5］。腫瘤細胞DNA甲基化主要表現(xiàn)形式有基因總體甲基化水平降低和某些特定區(qū)域的甲基化水平增高，總體水平的基因低甲基化常發(fā)生在高度重復(fù)序列和中度重復(fù)序列，這種低甲基化狀態(tài)使染色體不穩(wěn)定，使對應(yīng)的CpG島甲基化增強，相關(guān)的細胞周期調(diào)控基因，DNA相關(guān)修復(fù)基因表達沉默，誘發(fā)腫瘤［6］。EI-Naggar等［7］研究中，通過蛋白質(zhì)、DNA、RNA 3個水平上檢測頭頸部鱗癌細胞系和46例原發(fā)性頭面頸部腫瘤組織p16基因甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示，6例在exon1和exon2發(fā)現(xiàn)甲基化。Rosas等［8］用甲基化特異的聚合酶鏈反應(yīng)（MSP）法同時檢測了p16、O6-甲基鳥苷-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）、死亡相關(guān)蛋白激酶（DAP-K）基因在30例頭頸部鱗癌組織中的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)56%患者中至少有1個基因發(fā)生異常甲基化。本實驗研究皮膚鱗癌組織中Wnt信號通路的抑制因子SFRP1，基因啟動子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，在不同的皮膚鱗癌病理級別中表現(xiàn)不同。

Wnt信號通路是生物進化中具有高度同源性，相對保守的信號通路，也是細胞發(fā)育和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生長的一個關(guān)鍵途徑。鱗狀細胞癌細胞的生長和存活依賴于Wnt信號通路［9］。Wnt信號通路抑制因子分泌型卷曲相關(guān)蛋白（secreted frizzled related protein，SFRP）也是一種分泌型糖蛋白家族，由SFRP基因編碼，約有300個氨基酸殘基，包括一個同源的N-末端CRD和一個C-末端。SFRP1基因是分泌型糖蛋白家族之一，定位于染色體8p12-11.1與卷曲蛋白受體（Fz）的結(jié)構(gòu)上極為相似，具有同源的配體抑制區(qū)，它可通過競爭性抑制Fz受體而抑制Wnt通路［10］。SFRP1基因甲基化后激活Wnt信號通路，導(dǎo)致其通路中的核心蛋白β聯(lián)蛋白在細胞質(zhì)中累積并轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而參與皮膚鱗癌的發(fā)生發(fā)展［11］。本研究觀察皮膚鱗癌組織、癌旁組織、正常皮膚組織中共120個樣本，檢測SFRP1基因2個CpG片段17個CpG位點1951個CpG單位的甲基化率。在皮膚鱗癌與正常組織比較除了CpG2_8、CpG 2_11、CpG 2_12三個位點之外，檢測到其余14位點在皮膚鱗癌的SFRP1基因甲基化率高于正常組。皮膚鱗癌與癌旁組織相比有10個CpG位點（10/17，58.82%）甲基化率，這些位點在皮膚鱗癌甲基化率高于癌旁組織。癌旁組織與正常組織相比，檢測出5個CpG位點（5/17，29.41%）癌旁組織的甲基化率高于正常對照組織。SFRP1基因啟動子CpG位點甲基化率鱗癌Ⅲ級＞Ⅱ級＞Ⅰ級。SFRP1基因啟動子高甲基化引起基因失活導(dǎo)致其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常，使SFRP蛋白表達減少或缺失并對細胞異常增生的抑制能力減弱。同時SFRP通過抑制Wnt信號通路的傳導(dǎo)，在細胞凋亡、胚胎發(fā)育、提供腫瘤標記物與抗腫瘤中發(fā)揮作用，其具體機制尚需進一步研究。

表3 不同皮膚鱗狀細胞癌（鱗癌）組織病理級別中SFRP1甲基化狀態(tài)比較

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Methylation of SFRP1 gene promoter in cutaneous squamous cell carcinoma tissue

Liang Junqin*,Yilinuer·Halifu, Zou Yunmin,Luo Dong,Yuan Hu,Pu Xiongming.*Xinjiang Medical University,Urumqi 830002,China
< class="emphasis_italic">Corresponding author:Pu Xiongming,Email:puxiongming@163.com

Pu Xiongming,Email:puxiongming@163.com

ObjectiveTo investigate the relationship between SFRP1 gene and clinicopathologic features of cutaneous squamous cell carcinoma（CSCC）,and to explore the possible mechanism of action of SFRP1 in the occurrence and development of CSCC.MethodsCSCC and paracarcinomatous tissue specimens were obtained from 40 patients with CSCC,and normal skin tissue specimens from 40 healthy human controls.The EpiTYPER assay was conducted to evaluate the methylation status of SFRP1 gene promoter in all the specimens with a MassARRAY mass spectrometer.ResultsTotally,the methylation status of 1951（86.52%,1951/2255）CpG motifs were evaluated in 17 CpG loci in 2 fragments of the SFRP1 gene promoter.The methylation rate significantly differed in 10（10/17,58.82%）CpG loci between the CSCC and paracarcinomatous tissue specimens,and in 5（5/17,29.41%）CpG loci between the paracarcinomatous and normal tissue specimens（allP＜0.05）.Furthermore,significant differences were observed in the methylation rates of three CpG loci（CpG 1_5,CpG 1_7,CpG 2_8）in the SFRP1 gene promoter between tissue specimens from different pathological grades of CSCC（P＜0.05）,and their methylation rates sequentially decreased from gradeⅢto gradeⅡandⅠ.ConclusionThe frequency of methylation is high in the SFRP1 gene promoter in patients with CSCC,and the SFRP1 gene may participate in the occurrence and development of CSCC.

Carcinoma,squamous cell;DNA methylation;Signal transduction;SFRP1;Gene promoter

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.10.014

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（2015211C911）

830002烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學(xué)（梁俊琴）；新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科（梁俊琴、伊力努爾、鄒云敏、羅東、袁虎、普雄明）

普雄明，Email：puxiongming@163.com

2015-06-01）

（本文編輯：吳曉初）