楊珮珮 彭晶 于作忠 施歌 黎兆軍 張國(guó)學(xué) 樊翌明

對(duì)稱(chēng)性肢端角化病皮損中脂肪酸結(jié)合蛋白5及二氫硫辛酰胺脫氫酶表達(dá)

楊珮珮 彭晶 于作忠 施歌 黎兆軍 張國(guó)學(xué) 樊翌明

目的探討脂肪酸結(jié)合蛋白5（FABP5）及二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLD）在對(duì)稱(chēng)性肢端角化病中的表達(dá)和意義。方法收集9例對(duì)稱(chēng)性肢端角化病患者腕部皮損及其周?chē)つw活檢標(biāo)本，9例健康人腕部皮膚為對(duì)照，用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）及免疫組化法檢測(cè)FABP5及DLD表達(dá)水平。結(jié)果RT-PCR顯示，F(xiàn)ABP5 mRNA及DLD mRNA表達(dá)在對(duì)稱(chēng)性肢端角化病患者腕部皮損、皮損周?chē)つw、健康人腕部皮膚3組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。免疫組化顯示，對(duì)稱(chēng)性肢端角化病皮損中FABP5陽(yáng)性染色范圍和強(qiáng)度增加，角質(zhì)層、顆粒層、棘層均有強(qiáng)染色；而皮損周?chē)つw中角質(zhì)層、顆粒層及棘層弱陽(yáng)性染色，健康對(duì)照皮膚中僅有棘層和基底層弱陽(yáng)性染色。對(duì)稱(chēng)性肢端角化病皮損中DLD表達(dá)減少，僅在角質(zhì)層和少數(shù)病例棘層表達(dá)；皮損周?chē)敖】等似つw表皮全層均有DLD陽(yáng)性染色，胞核、胞質(zhì)均呈深棕色。結(jié)論對(duì)稱(chēng)性肢端角化病皮損中FABP5高表達(dá)可能參與角質(zhì)形成細(xì)胞異常分化過(guò)程，而DLD表達(dá)下調(diào)提示存在能量代謝失衡。

角化?。恢舅峤Y(jié)合蛋白質(zhì)類(lèi)；二氫硫辛酰胺脫氫酶；對(duì)稱(chēng)性肢端角化病

對(duì)稱(chēng)性肢端角化?。╯ymmetrical acrokeratoderma，SAK）是我國(guó)學(xué)者姜袆群等［1］、朱曉浚等［2］于2008年首次報(bào)道并命名的一種皮膚病。樊翌明等［3］于2010年首次在國(guó)際上以“獲得性SAK”為名報(bào)道了2例，并對(duì)國(guó)內(nèi)報(bào)道的27例進(jìn)行了總結(jié)。目前國(guó)際皮膚科學(xué)界已認(rèn)可SAK是一種新的皮膚病［4］。迄今國(guó)內(nèi)共報(bào)道了212例SAK，國(guó)外未見(jiàn)報(bào)道［5-8］。SAK病因與發(fā)病機(jī)制不明。我們發(fā)現(xiàn)SAK皮損中炎癥細(xì)胞明顯增多［5］，而李常興等［6］的研究顯示，SAK 皮損中存在屏障功能受損。在前期的蛋白組學(xué)研究中，我們發(fā)現(xiàn)SAK皮損中脂肪酸結(jié)合蛋白5（fatty acid binding protein 5，F(xiàn)ABP5）表達(dá)明顯高于正常皮膚，而二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoamide dehydrogenase，DLD）表達(dá)明顯降低。FABP5是一個(gè)脂質(zhì)載體，能結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸，參與多種生物過(guò)程［9］，在正常皮膚中表達(dá)較低［9-10］，在銀屑病皮損中過(guò)度表達(dá)［11］。DLD是線粒體多酶復(fù)合物的共同黃素蛋白組分，參與氧化還原反應(yīng)，維持能量代謝平衡［12］。DLD缺乏或基因突變多引起代謝性疾?。?3］，在正常皮膚中表達(dá)迄今未見(jiàn)報(bào)道。我們擬用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫組化技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證SAK皮損、皮損周?chē)つw和健康人皮膚中FABP5 mRNA和DLD mRNA及蛋白表達(dá)差異，為今后進(jìn)行基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

作者單位：524001湛江，廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科［楊珮珮（現(xiàn)在湖北省荊門(mén)市第二人民醫(yī)院皮膚科，448000）、彭晶、于作忠、施歌、黎兆軍、張國(guó)學(xué)、樊翌明］

對(duì)象和方法

一、對(duì)象

2009年9月至2014年11月，對(duì)9例SAK患者腕部皮損進(jìn)行活檢，其中男8例，女1例，年齡20～37（25.67±5.94）歲，發(fā)病年齡 13～24（18.89±3.26）歲。SAK診斷根據(jù)臨床特征和病理檢查［1-3］，9例均在肢端部位發(fā)生對(duì)稱(chēng)性褐色角化性斑片，特別是手背、腕、踝部，掌跖不受累。皮損在浸水或出汗幾分鐘后變白，干燥后恢復(fù)原狀。皮損夏季出現(xiàn)，冬季減輕或消退。皮損組織病理檢查顯示，表皮角化過(guò)度，棘層增厚，輕度乳頭瘤樣增生，真皮淺層血管周?chē)∈枇馨蜆蛹?xì)胞浸潤(rùn)。9例腕部正常皮膚取自本機(jī)構(gòu)學(xué)生及醫(yī)生志愿者，男6例，女3例，年齡15～53（27.33±10.59）歲。兩組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.412，P=0.686）?；顧z標(biāo)本分別用液氮冷凍及4%甲醛固定。本研究經(jīng)廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，所有受檢者均簽署了知情同意書(shū)。

二、方法

1.RT-PCR：人FABP5、DLD和GAPDH引物序列采用Primer 3軟件設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）有限公司合成：FABP5：上游引物5′-TCAGCAGCTG GAAGGAAGAT-3′和下游引物 5′-CTTTCCTTCCCA TCCCACTC-3′；DLD：上游引物 5′-GCTCTTCTGGTG GTAAAGC-3′和下游引物 5′-GGATCTTCACCATGC CATCT-3′；GAPDH：上游引物 5′-CGAGATCCCTCC AAAATCAA-3′和下游引物 5′-GTCTTCTGGGTGGC AGTGAT-3′。液氮保存皮膚標(biāo)本加入Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）提取總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］合成cDNA及S1000TMThermal Cycler PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體積為20 μl，反應(yīng)體系為Premix Ex TaqTMⅡ（2×）［寶生物工程（大連）有限公司］10.0 μl，PCR 混合引物（10 μmol/L）1 μl，cDNA 模板 1 μl，加滅菌蒸餾水至 20 μl。擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性 5 min，98℃變性 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30～40個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）觀察、拍照，再用Image J系統(tǒng)檢測(cè)灰度值，計(jì)算FABP5、DLD mRNA灰度值與GAPDH mRNA灰度值之比。

2.免疫組化檢測(cè)：兔抗人 FABP5（sc-50379）及DLD（sc-135027）多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），即用型免疫組化EliVisionTMplus試劑盒（KIT-9902）、加強(qiáng)型 DAB 顯色試劑盒（DAB-2031）（福州邁新生物技術(shù)公司）。石蠟切片（厚度3 μm）脫蠟、水化，采用檸檬酸鹽高溫高壓法修復(fù)抗原，3%H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；滴加一抗（工作濃度1∶200），4℃孵育過(guò)夜后室溫孵育2 h；EliVisionTMplus試劑盒處理后DAB顯色。以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)不同視野（×400），觀察染色范圍及染色強(qiáng)度。染色范圍指陽(yáng)性染色細(xì)胞占各層細(xì)胞比例：0（-），1% ～ 25%（+），26% ～ 50%（++），51% ～ 75%（+++），76% ～ 100%（++++）。染色強(qiáng)度指陽(yáng)性染色顆粒顏色：陰性（-），淡黃色（+），棕黃色（++），深棕色（+++），棕黑色（++++）。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用方差分析及LSD檢驗(yàn)（方差齊）或Dunnett T3檢驗(yàn)（方差不齊）。

結(jié) 果

一、RT-PCR檢測(cè)FABP5和DLD mRNA表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)ABP5和DLD mRNA在SAK皮損、皮損周?chē)つw和健康對(duì)照皮膚中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1、表1）。

二、免疫組化染色

圖1 對(duì)稱(chēng)性肢端角化病（SAK）皮損中脂肪酸結(jié)合蛋白5（FABP5）及二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLD）mRNA RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 3組皮膚中FABP5、DLD mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異

表1 各組皮膚中脂肪酸結(jié)合蛋白5（FABP5）及二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLD）mRNA表達(dá)水平（±s）

表1 各組皮膚中脂肪酸結(jié)合蛋白5（FABP5）及二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLD）mRNA表達(dá)水平（±s）

注：表達(dá)水平為FABP5、DLD mRNA灰度值與GAPDH mRNA灰度值之比

組別 例數(shù) FABP5 DLD對(duì)稱(chēng)性肢端角化病皮損 9 0.651±0.625 0.499±0.572皮損周?chē)つw 9 0.321±0.353 0.677±0.799健康對(duì)照皮膚 9 0.358±0.359 0.642±0.615 F值 1.375 0.179 P值 ＞0.05 ＞0.05

1.FABP5：FABP5陽(yáng)性染色主要為胞質(zhì)著色，少數(shù)可見(jiàn)胞核染色。SAK皮損中FABP5染色均為強(qiáng)陽(yáng)性（圖2A），著色主要見(jiàn)于角質(zhì)層、顆粒層及棘層，基底層僅1例陽(yáng)性染色，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)約占棘層75%～100%。皮損周?chē)旧珵槿蹶?yáng)性或陰性（圖2B），陽(yáng)性著色見(jiàn)于角質(zhì)層、顆粒層及棘層，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)約占各層25%～50%。健康對(duì)照皮膚染色為弱陽(yáng)性或陰性（圖2C），陽(yáng)性著色主要見(jiàn)于棘層與基底層，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)約占各層25%～50%，少數(shù)完全為陰性。所有標(biāo)本可見(jiàn)小汗腺導(dǎo)管內(nèi)層胞質(zhì)著色，部分標(biāo)本可見(jiàn)毛囊皮脂腺染色。SAK皮損、皮損周?chē)敖】祵?duì)照皮膚中真皮淺層均有少量浸潤(rùn)細(xì)胞表達(dá)FABP5。見(jiàn)表2。

2.DLD免疫組化染色結(jié)果：SAK皮損（圖3A）、皮損周?chē)▓D3B）及健康對(duì)照皮膚（圖3C）中DLD染色均為陽(yáng)性，但皮損中染色較弱（表3）。皮損中陽(yáng)性著色主要見(jiàn)角質(zhì)層，部分病例在棘層可見(jiàn)胞核、胞質(zhì)均著色，基底層偶見(jiàn)陽(yáng)性。皮損周?chē)敖】祵?duì)照皮膚中陽(yáng)性著色見(jiàn)于表皮全層，胞核、胞質(zhì)均呈深棕色。所有標(biāo)本可見(jiàn)小汗腺導(dǎo)管細(xì)胞部分胞核著色，部分標(biāo)本可見(jiàn)毛囊內(nèi)根鞘細(xì)胞核及皮脂腺腺泡細(xì)胞胞質(zhì)陽(yáng)性染色。

討 論

圖2 脂肪酸結(jié)合蛋白5免疫組化染色（×200） 2A：對(duì)稱(chēng)性肢端角化病皮損中角質(zhì)層、顆粒層及棘層均有強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；2B：皮損周?chē)つw中顆粒層及棘層弱陽(yáng)性染色；2C：健康對(duì)照皮膚僅棘層下部弱陽(yáng)性染色

表2 脂肪酸結(jié)合蛋白5在對(duì)稱(chēng)性肢端角化?。⊿AK）皮損及皮損周?chē)つw和健康對(duì)照皮膚表皮各層染色情況

圖3 二氫硫辛酰胺脫氫酶（DLD）免疫組化染色（×200） 3A：對(duì)稱(chēng)性肢端角化病皮損中角質(zhì)層及部分棘層細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)；3B：皮損周?chē)つw中表皮全層均有陽(yáng)性染色；3C：健康對(duì)照皮膚表皮全層均有陽(yáng)性染色

表3 二氫硫辛酰胺脫氫酶在對(duì)稱(chēng)性肢端角化病（SAK）皮損及皮損周?chē)つw和健康對(duì)照皮膚表皮各層染色情況

本文結(jié)果顯示，SAK皮損、皮損周?chē)つw及健康對(duì)照皮膚中FABP5 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但免疫組化顯示，皮損中FABP5蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。FABP5在正常皮膚中表達(dá)較低，只表達(dá)在分裂后角質(zhì)形成細(xì)胞（KC），而基底細(xì)胞和暫時(shí)擴(kuò)增細(xì)胞幾乎不表達(dá)。有研究顯示，銀屑病皮損中FABP5表達(dá)增多，主要位于棘層［9-10］。重組FABP5轉(zhuǎn)染健康人KC誘導(dǎo)角蛋白K10和外皮蛋白高表達(dá)，而RNA干擾抑制FABP5的NF-κB和JNK信號(hào)通路，下調(diào)K10和外皮蛋白表達(dá)［9］。在銀屑病皮損KC培養(yǎng)過(guò)程中，抑制FABP5使細(xì)胞分化明顯減少；在高鈣（1.8 mmol/L氯化鈣）條件下，F(xiàn)ABP5沉默下調(diào)K10和外皮蛋白表達(dá)，而生存素和K16表達(dá)幾乎完全消失［9］。這些結(jié)果表明，F(xiàn)ABP5在KC分化中有重要作用，可能是導(dǎo)致銀屑病皮損中KC異常分化的原因之一［9］。我們前期的免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，SAK皮損中K16、外皮蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而K10表達(dá)與正常皮膚相似。SAK皮損中FABP5、K16、外皮蛋白表達(dá)模式類(lèi)似于銀屑病，提示FABP5可能通過(guò)調(diào)節(jié)K16、外皮蛋白表達(dá)參與KC異常分化過(guò)程。此外，F(xiàn)ABP5參與輔助T細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞的分化過(guò)程，在一些免疫相關(guān)細(xì)胞（如肺泡內(nèi)巨噬細(xì)胞、胸腺皮質(zhì)細(xì)胞、脾樹(shù)突細(xì)胞、肥大細(xì)胞）中也有表達(dá)［9，14］。本研究發(fā)現(xiàn)，SAK 皮損、皮損周?chē)つw及健康對(duì)照皮膚中真皮淺層均有少量浸潤(rùn)細(xì)胞表達(dá)FABP5，提示免疫細(xì)胞中FABP5表達(dá)可能在本病發(fā)生中無(wú)明顯作用。

DLD是線粒體多酶復(fù)合物的共同黃素蛋白組分，參與體內(nèi)多種代謝途徑，維持能量代謝平衡［12］。在生理?xiàng)l件下，DLD的主要功能是維持能量代謝平衡；在病理?xiàng)l件下，如不穩(wěn)定二聚體突變或者酸性線粒體基質(zhì)環(huán)境下，DLD的兼職硫辛酰胺脫氫酶活性增加，導(dǎo)致能量代謝減少，氧化性損害增加［12］。體內(nèi)氧自由基增多引起線粒體DNA突變、呼吸鏈損傷、線粒體膜損傷、線粒體鈣穩(wěn)態(tài)破壞，促進(jìn)細(xì)胞凋亡及機(jī)體老化［14］。皮膚中DLD表達(dá)及其生物學(xué)作用迄今未見(jiàn)報(bào)道，本研究檢測(cè)了SAK皮損及健康人皮膚中DLD表達(dá)情況。RT-PCR發(fā)現(xiàn)DLD mRNA在SAK皮損、皮損周?chē)つw及健康對(duì)照皮膚中表達(dá)差異無(wú)顯著性；免疫組化顯示，健康表皮全層均有DLD陽(yáng)性染色，而SAK皮損中DLD表達(dá)減少，僅在角質(zhì)層和少數(shù)病例棘層表達(dá)。鑒于DLD的主要作用是維持能量代謝平衡，DLD表達(dá)下調(diào)提示SAK皮損中存在能量代謝失衡。

由于在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中存在RNA降解和修飾、轉(zhuǎn)錄及翻譯后調(diào)節(jié)，故mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果可能不一致［15］。本文的免疫組化染色支持前期的蛋白組學(xué)結(jié)果，但SAK皮損中FABP5和DLD mRNA表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。SAK皮損中FABP5高表達(dá)可能參與KC異常分化過(guò)程，其具體通路有待繼續(xù)研究；SAK皮損中DLD表達(dá)下調(diào)，提示存在能量代謝失衡，角質(zhì)形成細(xì)胞中線粒體基質(zhì)環(huán)境、能量代謝及硫辛酰胺脫氫酶活性變化及其在本病發(fā)生中的作用有待進(jìn)一步研究。

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Expressions of fatty acid binding-protein 5 and dihydrolipoamide dehydrogenase in skin lesions of symmetrical acrokeratoderma

Yang Peipei,Peng Jing,Yu Zuozhong,Shi Ge,Li Zhaojun,Zhang Guoxue,Fan Yiming*.*Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001,Guangdong,China

ObjectiveTo investigate the expressions of fatty acid-binding protein 5 （FABP5）and dihydrolipoamide dehydrogenase（DLD）in skin lesions of symmetrical acrokeratoderma（SAK）,and to explore their significance.MethodsBiopsy specimens were obtained from skin lesions on the wrists and perilesional skin of 9 patients with SAK,and from normal skin in the wrists of 9 healthy volunteers（control group）.Reverse transcription PCR （RT-PCR）and immunohistochemical staining were performed to measure the expressions of FABP5 and DLD in these specimens.ResultsRT-PCR showed no significant differences in the mRNA expressions of FABP5 or DLD between lesional,perilesional and normal control skin specimens（bothP＞ 0.05）.Immunohistochemically,there was a significant increase in the extent and intensity of staining for FABP5 in SAK lesions.Concretely speaking,FABP5 was strongly expressed in the stratum corneum,granular and spinous layers in SAK lesions,but weakly expressed in the stratum corneum,granular and spinous layers in perilesional skin,and only in spinous and basal layers in normal control skin.The expression of DLD decreased in SAK lesions,and was observed only in the stratum corneum and spinous layer in a few cases of SAK.However,the full-thickness epidermis stained positive for DLD in perilesional skin,with the nuclei and cytoplasm both stained deep brown.ConclusionThe overexpression of FABP5 in SAK lesions may participate in dysdifferentiation of keratinocytes,while the down-regulation of DLD expression suggests an imbalance in energy metabolism.

Keratosis;Fatty acid-binding proteins;Dihydrolipoamide dehydrogenase;Symmetrical acrokeratoderma

Fan Yiming,Email:ymfan1963@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.12.004

廣東醫(yī)學(xué)院科技創(chuàng)新基金（STIF201103）

樊翌明，Email：ymfan1963@163.com

2015-05-27）

（本文編輯：顏艷）