王朵勤 唐慧 沈燕蕓 徐金華

慢性蕁麻疹患者血漿D二聚體、活化凝血因子Ⅶ及活化凝血因子Ⅻ水平的研究

王朵勤 唐慧 沈燕蕓 徐金華

目的 探討血漿D二聚體、活化凝血因子Ⅶ（FⅦa）及活化凝血因子Ⅻ（FⅫa）在慢性蕁麻疹（CU）患者中的表達(dá)及其與CU發(fā)病的關(guān)系。方法 對(duì)50例CU患者及50例健康對(duì)照用干式免疫散射色譜法檢測(cè)血漿D二聚體水平，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)FⅦa及FⅫa的水平，并結(jié)合患者病情嚴(yán)重程度情況進(jìn)行分析。對(duì)43例CU患者自體血漿皮膚試驗(yàn)（APST）及41例CU患者作自體血清皮膚試驗(yàn)（ASST）結(jié)果與其血漿D二聚體水平進(jìn)行比較。結(jié)果 CU患者血漿中D二聚體及FⅦa的水平均明顯高于健康對(duì)照組（P<0.05），前者升高水平與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)（P<0.05）；CU患者FⅫa水平與健康對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。APST（+）患者的 D 二聚體水平明顯高于 APST（-）患者（P<0.05），而 ASST（+）患者 D 二聚體水平與ASST（-）患者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 凝血機(jī)制與CU相關(guān)，外源性凝血途徑起著作用，針對(duì)凝血機(jī)制的研究對(duì)于CU的病情評(píng)估和臨床治療具有一定的意義。

蕁麻疹；因子Ⅶa；因子Ⅻa

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2013年6-12月，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科門診50例CU患者，男19例，女31例，年齡18～75歲，平均（37.67±13.37）歲。病程2個(gè)月至10年，另選擇50例體檢健康者為對(duì)照組，其中男18例、女 32例,年齡 22～74歲,平均（37.94 ± 13.17）歲，均P>0.05，兩組對(duì)象的性別和年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具可比性。CU患者的入組標(biāo)準(zhǔn)如下：①符合CU的診斷［1］；②排除了食物、藥物等明確過敏原；③排除寒冷性蕁麻疹，日光性蕁麻疹、人工蕁麻疹、膽堿能性蕁麻疹、接觸性蕁麻疹、水源性蕁麻疹、蕁麻疹性血管炎患者；④入組前3 d未使用抗組胺藥，治療前1個(gè)月內(nèi)未用過長效糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑；⑤非妊娠或哺乳，年齡18～75歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重心、肝、腎等器官疾病，惡性腫瘤，骨髓造血功能不良及系統(tǒng)性疾病。入選后行癥狀評(píng)分，并于皮損發(fā)作期采血。本研究獲得復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書。

二、主要儀器及試劑

D二聚體試劑盒購于挪威Axis-Sheild PoC AS公司，F(xiàn)Ⅶa及FⅫa測(cè)定ELISA試劑盒購于美國RB公司，酶標(biāo)儀型號(hào)為BioTek ELx808。

三、方法

1.標(biāo)本收集和處理：常規(guī)方法抽取靜脈外周血3.6 ml，放入消毒玻璃試管中（枸櫞酸鈉抗凝），600×g離心10 min，無菌分離血漿。取0.05 ml血漿或血清行APST/ASST，其余血漿或血清-20℃保存，待批量檢測(cè)。

2.檢測(cè)方法：D 二聚體、FⅦa、FⅫa：50 例 CU患者及50例健康對(duì)照行D二聚體、FⅦa及FⅫa的檢測(cè)。D二聚體檢測(cè)采用干式免疫散射色譜法，F(xiàn)Ⅶa及FⅫa的檢測(cè)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。APST及ASST：50例CU患者中43例行APST，41例行ASST。取自體血漿或血清0.05 ml在前臂屈側(cè)作皮內(nèi)注射，同時(shí)以等量生理氯化鈉溶液皮內(nèi)注射作為陰性對(duì)照，鹽酸組胺作為陽性對(duì)照，注射處相距至少5 cm。結(jié)果判定：20～30 min后由專人觀察結(jié)果，若注射處出現(xiàn)紅斑、風(fēng)團(tuán)反應(yīng)且風(fēng)團(tuán)直徑比對(duì)照大3 mm以上即為陽性。

3.癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)EAACI/GA（2）LEN/EDF/WAO 蕁麻疹指南［1］病情嚴(yán)重程度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：①風(fēng)團(tuán)數(shù)目：0分為無風(fēng)團(tuán)；1分為風(fēng)團(tuán)數(shù)<20個(gè)/24 h；2分為風(fēng)團(tuán)數(shù)20～50個(gè)/24 h；3分為風(fēng)團(tuán)數(shù) >50個(gè)/24 h或大片融合的風(fēng)團(tuán)；②瘙癢程度：0分為無瘙癢；1分為輕度瘙癢，有瘙癢但不引起患者煩惱；2分為中度瘙癢，引起患者煩惱但尚未影響患者日?；顒?dòng)或睡眠；3分為重度瘙癢，影響患者日常活動(dòng)或睡眠。連續(xù)評(píng)估1周，計(jì)算總分并計(jì)算每天平均分值。為方便比較，將0～2分/d定為輕度，3～4分/d定為重度，5～6分/d定為重度。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS16.0軟件，兩組間數(shù)據(jù)比較采用Mann-Whitney檢測(cè)，多組間數(shù)據(jù)比較采用Kruskal-Wallis檢測(cè)方法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、血漿D二聚體水平與病情嚴(yán)重程度關(guān)系

50例CU患者中，輕度18例（36%），中度21例（42%），重度11例（22%）。圖1所示，隨著血漿中D二聚體水平逐漸增高，CU患者病情評(píng)分也逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=18.493，P<0.05），檢測(cè)結(jié)果表明隨著CU患者血漿D二聚體水平增加，蕁麻疹病情加重。

二、CU患者血漿D二聚體、FⅦa因子和FⅫa因子檢測(cè)結(jié)果的比較

檢測(cè)結(jié)果如表1所示，50例CU患者D二聚體及FⅦa的平均水平均明顯高于健康對(duì)照（U=772.5、849.0，均P<0.05），而50例CU患者FⅫa因子水平較健康對(duì)照比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=1 038.5，P>0.05）。

圖1 血漿D二聚體水平與病情嚴(yán)重程度關(guān)系

表1 慢性蕁麻疹患者及健康對(duì)照D二聚體、FⅦa、FⅫa的檢測(cè)

表2 自體血漿皮膚試驗(yàn)（+）與自體血漿皮膚試驗(yàn)（-）患者D二聚體水平比較及自體血清皮膚試驗(yàn)（+）與自體血清皮膚試驗(yàn)（-）患者D二聚體水平比較

三、APST（+）患者與 APST（-）患者 D 二聚體水平比較及ASST（+）患者與ASST（-）患者D二聚體水平比較

43例CU患者中25例自體APST陽性，陽性率為58.14%，41例CU患者中14例ASST陽性，陽性率為34.15%。如表2所示，APST（+）患者血漿中D二聚體水平明顯高于 APST（-）患者（U=106，P<0.05）ASST（+）患者血漿中D二聚體水平與陰性組ASST（-）患者比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=184，P>0.05）。

討 論

CU病因尚不明確，其核心發(fā)病機(jī)制是肥大細(xì)胞活化脫顆粒從而引起平滑肌收縮、黏液分泌增加和血管通透性增加。2009年我們的課題組對(duì)30例CU的患者及30例健康對(duì)照進(jìn)行了FⅦa、凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物及D二聚體的檢測(cè)［4］，結(jié)果顯示，CU患者的FⅦa、TAT及D二聚體水平較健康對(duì)照明顯增高（P<0.001）證明了凝血機(jī)制的激活與CU的相關(guān)性。本研究擴(kuò)大樣本量并進(jìn)行FⅦa、APST和ASST的檢測(cè)，結(jié)果顯示，50例CU患者血漿中D二聚體、FⅦa較健康對(duì)照組有明顯升高，F(xiàn)Ⅻa水平與健康對(duì)照組相比，差異卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D二聚體是交聯(lián)后纖維蛋白被纖溶酶降解的特異標(biāo)志物之一，F(xiàn)Ⅶa、FⅫa分別是外源性凝血機(jī)制及內(nèi)源性凝血機(jī)制的標(biāo)志，證明凝血機(jī)制激活與慢性蕁麻疹相關(guān)，外源性凝血途徑主要參與了CU凝血機(jī)制的激活［5-6］。而在CU與D二聚體病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性中我們發(fā)現(xiàn)，中度及重度CU患者的D二聚體的水平明顯高于輕度CU患者，由此可見，凝血因子的水平與CU患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，血漿D二聚體水平的測(cè)定對(duì)于CU患者病情的評(píng)估具有一定價(jià)值。另外，CU患者APST的陽性率明顯高于ASST，與相關(guān)文獻(xiàn)一致［7-8］，血漿及血清中都含有自身免疫性抗體，除此之外，血漿中還含有參與凝血途徑的蛋白及凝血因子，而血清中卻沒有［9］，由此我們推測(cè)，APST的高陽性率與凝血因子相關(guān)聯(lián)。我們進(jìn)一步將 APST（+）及 APST（-）患者的D二聚體水平進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，APST（+）患者的 D 二聚體水平明顯高于APST（-）患者，而 ASST（+）患者 D 二聚體水平與ASST（-）患者D二聚體水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此可見，APST的陽性率明顯高于ASST，可能與前者存在凝血因子有關(guān)。

凝血機(jī)制與CU密切相關(guān)，但凝血機(jī)制與肥大細(xì)胞活化之間的關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。研究表明［10］，凝血酶可通過誘導(dǎo)蛋白酶激活受體1激活，導(dǎo)致肥大細(xì)胞黏附于纖維連接蛋白，進(jìn)一步誘發(fā)凝血機(jī)制和炎癥反應(yīng)。蛋白酶激活受體是G蛋白偶聯(lián)受體，包括4個(gè)成員-蛋白酶激活受體1～4［11］。另有學(xué)者［12］發(fā)現(xiàn)，蛋白酶激活受體2表達(dá)于人皮膚肥大細(xì)胞表面，蛋白酶激活受體2激動(dòng)劑可作用于相應(yīng)受體引起Ca2+內(nèi)流，刺激人皮膚肥大細(xì)胞組胺釋放，從而誘發(fā)蕁麻疹等變態(tài)反應(yīng)性疾病，而FⅦa是蛋白酶激活受體2激動(dòng)劑，因此我們推測(cè)凝血過程中，產(chǎn)生的凝血酶和FⅦa可分別作用于人皮膚肥大細(xì)胞表面蛋白酶激活受體1和2，分別引起肥大細(xì)胞粘附于纖維連接蛋白及Ca2+內(nèi)流，繼而誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺，引起或加重CU的發(fā)生。

綜上所述，凝血機(jī)制與CU密切相關(guān)，外源性凝血途徑起著重要的作用。血漿D二聚體水平的測(cè)定對(duì)于CU患者病情的評(píng)估具有一定價(jià)值。CU患者中APST陽性率明顯高于ASST，可能與凝血因子有一定關(guān)系。凝血因子可能是通過蛋白酶激活受體引起肥大細(xì)胞脫顆粒從而誘發(fā)CU的發(fā)生，針對(duì)凝血途徑、肥大細(xì)胞、蛋白酶激活受體的研究將為臨床上治療CU提供新的思路。

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Levels of plasma D-dimer,activated coagulation factorⅦandⅫin patients with chronic urticaria

Wang Duoqin*,Tang Hui,Shen Yanyun,Xu Jinhua.*Department of Dermatology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai 200040,China

Xu Jinhua,Email:xjhhuashan@yahoo.com

Objective To measure the levels of plasma D-dimer,activated coagulation factorⅦ（FⅦa）and activated clotting factorⅫ（FⅫa）in patients with chronic urticaria（CU）,and to investigate their relationship with the occurrence of CU.Methods Venous blood samples were collected from 50 patients with CU and 50 healthy human controls.Dry-column immune scattering chromatography was performed to detect the plasma level of D-dimer,and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）to measure the levels of FⅦa and FⅫa.In addition,autologous plasma skin test（APST）was conducted in 43 patients with CU,and autologous serum skin test（ASST）in 41 patients with CU.A correlation analysis was carried out between the above three parameters and disease severity as well as between the results of APST and ASST and plasma level of D-dimer.Results The levels of plasma D-dimer and FⅦa were significantly higher in patients with CU than in healthy human controls （bothP<0.05）,while no significant difference was found in FⅫa level between the two groups （P>0.05）.Moreover,the degree of increase in D-dimer plasma level was positively correlated with disease severity in the patients with CU.The plasma level of D-dimer was significantly higher in APST-positive patients than in APST-negative patients （P<0.05）,but not significantly different between ASST-positive and-negative patients （P>0.05）.Conclusions Coagulation mechanism,especially the extrinsic coagulation pathway,is related to the occurrence of CU.Studies on coagulation mechanism are beneficial to the evaluation of severity,and clinical treatment,of CU.

Urticaria;FactorⅦa;FactorⅫa

慢性蕁麻疹（CU）是指每天或幾乎每天都出現(xiàn)一過性的風(fēng)團(tuán)，病程 >6周［1］，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。研究表明［2］，35%～40%的CU患者血清中可檢測(cè)出抗 IgE高親和力受體ε鏈（抗 FcεRI），5%～10%的患者可檢出抗IgE自身抗體。自身血漿/血清皮膚試驗(yàn)（APST/ASST）是臨床篩查CU的常用方法。Asero等［3］將慢性蕁麻疹患者對(duì)APST和ASST的反應(yīng)相對(duì)比，用檸檬酸鈉抗凝血的APST陽性率高于ASST（86%與53%），提示凝血過程可能參與了CU皮損的發(fā)展。因此，凝血功能的異常與慢性蕁麻疹發(fā)病的關(guān)系成為近幾年研究熱點(diǎn)。本研究通過檢測(cè)CU患者及健康對(duì)照血漿中的D二聚體、活化凝血因子Ⅶ（FⅦa）、活化凝血因子Ⅻ（FⅫa）的水平，并結(jié)合患者病情嚴(yán)重程度情況進(jìn)行分析。對(duì)部分患者行APST及ASST并進(jìn)行比較，以探討CU與凝血機(jī)制的關(guān)系。

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.012

200040上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院（王朵勤、唐慧、沈燕蕓、徐金華）；上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院（徐金華）

徐金華，Email：xjhhuashan@yahoo.com

2014-04-09）

（本文編輯：吳曉初）