梁業(yè)飛，周有望，陶文

(1.廣西壯族自治區(qū)欽州市第一人民醫(yī)院藥劑科，欽州 535001;2.廣西壯族自治區(qū)百色市人民醫(yī)院藥學(xué)部，百色533000;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530023)

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂、自由基毒素等多種致病因子引起的機體代謝紊亂，導(dǎo)致多器官的慢性損傷和功能障礙，嚴(yán)重影響患者的身體健康，甚至危及生命。膽汁酸是膽汁的主要成分，不僅參與機體脂質(zhì)的乳化吸收，而且還作為重要的內(nèi)分泌信號因子，在機體的糖代謝、脂代謝以及能量代謝中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[1-2]。消膽胺(cholestyramine)是一種高分子量季胺類陰離子交換樹脂，可與膽汁酸結(jié)合形成絡(luò)合物從大便排出，減少膽汁酸的重吸收，改善膽汁酸循環(huán)[3]。阿嗪米特(azintamide)為一種促進(jìn)膽汁分泌藥物，它可以增加膽汁的液體量，增加膽汁中固體成分的分泌[4]。筆者在本研究通過糖尿病小鼠模型實驗探討消膽胺和阿嗪米特聯(lián)合用藥對糖尿病膽汁酸代謝的影響，從分子水平對膽汁酸代謝相關(guān)基因進(jìn)行研究，旨在為糖尿病的治療提供新思路和新途徑。

1 材料與方法

1.1 動物 健康清潔級C57BL/6J雄性小鼠，體質(zhì)量20～25 g，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2011-0012，均飼養(yǎng)于通風(fēng)良好，室溫(24±2)℃，12 h光照周期，自由進(jìn)食。

1.2 試藥與材料 消膽胺購自南京厚生藥業(yè)有限公司;阿嗪米特購自揚州一洋制藥有限公司;逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司;全自動膽汁酸檢測試劑盒購自北京戴格諾斯生物科技有限公司，批號:20130627;RNeasy Mini?kit試劑盒(批號:20130303)、High Capacity cDNA Reverse Transcription?kit試劑盒(批號:20130805)均購自QIAGEN公司;兔抗人膽固醇7α羥化酶(Cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7A1)多抗、羊抗人膽固醇 27α 羥化酶(Cholesterol 27α-hydroxylase，CYP27A1)多抗、兔抗鼠β-actin多抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗，均購自Santa Cruz公司;牛血清清蛋白(bovine serum albumin，BSA)購自Sigma公司;其他試劑為分析純。

1.3 動物分組及糖尿病小鼠模型構(gòu)建 健康清潔級C57BL/6J雄性小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。將實驗小鼠隨機分為4組。正常對照組:以普通飼料喂養(yǎng)8周，禁食過夜，繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)4周;模型對照組:以高脂高糖飼料(含酪蛋白23.6%，蔗糖20.4%，豬油20.9%)喂養(yǎng)8周，禁食過夜，取成模小鼠繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周;消膽胺組:與模型對照組同種飼料喂養(yǎng)8周，禁食過夜，取成模小鼠添加3%消膽胺的高脂高糖飼料繼續(xù)喂養(yǎng)4周;聯(lián)合治療組:與模型對照組同種飼料喂養(yǎng)8周，禁食過夜，取成模小鼠添加3%消膽胺及1%阿嗪米特的高脂高糖飼料繼續(xù)喂養(yǎng)4周。

1.4 糖尿病小鼠成模標(biāo)準(zhǔn)及空腹血糖的測定 所有小鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，禁食過夜測定空腹血糖。為考察是否建模成功，所有小鼠在普通飼料/高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后，禁食過夜測定空腹血糖。糖尿病小鼠成模標(biāo)準(zhǔn):空腹血糖＞11.0mmol·L－1。選取符合成模標(biāo)準(zhǔn)的小鼠，繼續(xù)按組別喂養(yǎng)4周，禁食過夜測定空腹血糖。

1.5 大便、肝臟、血液中膽汁酸濃度的測定 實驗小鼠在普通飼料/高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后，收集小鼠的大便樣本，進(jìn)行大便膽汁酸濃度測定，之后各組在給藥/不給藥狀態(tài)下分別喂養(yǎng)4周，在處死前收集小鼠的大便樣本。大便樣本冷凍干燥呈粉末狀，65℃恒溫條件下，90%乙醇提純大便膽汁酸兩次，1h。離心后，將上清液在氮氣條件下干燥，并再溶解于90%乙醇中，作為大便中膽汁酸濃度測定樣本;在麻醉狀態(tài)下，開腹后在十二指腸上方橫斷膽總管，插入硬膜外導(dǎo)管結(jié)扎固定，收集膽汁1h，作為肝臟中膽汁酸濃度測定樣本;股動脈采血，3000 r·min－1分離血清，作為血液中膽汁酸濃度測定樣本。采用全自動膽汁酸檢測試劑盒進(jìn)行膽汁酸濃度測定。

1.6 膽汁酸代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)分析 將喂養(yǎng)12周的小鼠處死，迅速提取小鼠肝臟組織于液氮中凍存。冰浴條件下，用RNeasy Mini?kit試劑盒提取肝組織總 RNA，然后利用 High Capacity cDNA Reverse Transcription?kit試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。預(yù)設(shè)引物和Taqman?探針，在 lightcycler?480實時熒光定量 PCR系統(tǒng)中，對膽汁酸經(jīng)典合成途徑的限速酶-CYP7A1基因、膽汁酸的核受體法尼醇 X受體(Farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)基因、替代合成途徑的限速酶-CYP27A1基因進(jìn)行定量。β-actin基因作為內(nèi)參對照。

1.7 Western bolt檢測肝組織 CYP7A1、CYP27A1 蛋白的表達(dá) 肝臟組織100 mg加入預(yù)冷的RIPA裂解液1mL，冰浴勻漿，8000 r·min－1(有效離心半徑8 cm)離心10 min，收集上清液備用，取1 mg·mL－1BSA制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度估算肝臟上清液的蛋白含量。上樣，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，電泳結(jié)束后，將目的蛋白所在凝膠剪下并電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜。用含5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)浸泡緩慢搖動4℃封閉過夜。封閉結(jié)束后，加入兔抗人CYP7A1多抗、羊抗人CYP27A1多抗和兔抗鼠β-actin多抗溶液孵育，搖床輕搖1～2 h。洗滌緩沖液TBST洗3次，再加入HRP標(biāo)記羊抗兔二抗溶液，搖床輕搖1～2 h。TBST洗滌后，曝光，顯色，檢測雜交信號。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()來表示，分類變量使用卡方檢驗，連續(xù)變量采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病小鼠空腹血糖的測定 結(jié)果見表1。正常對照組:小鼠在普通飼料喂養(yǎng)12周前后血糖變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.76，P ＞0.05);模型對照組:高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周前后血糖顯著增加(t=3.18，P＜0.01)，表明糖尿病小鼠模型構(gòu)建成功。消膽胺組:在高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后，血糖明顯增加(t=3.03，P＜0.01)，后添加消膽胺喂養(yǎng)4周后，小鼠血糖顯著降低(t=2.54，P ＜0.05);聯(lián)合治療組:在高脂高糖飼料喂養(yǎng)8 周后，血糖明顯增加(t=2.97，P ＜0.01)，后添加消膽胺聯(lián)合阿嗪米特喂養(yǎng)4周后，小鼠血糖顯著降低(t=3.35，P ＜0.01);可見消膽胺聯(lián)合阿嗪米特對糖尿病小鼠血糖控制具有正向協(xié)同作用。

2.2 大便、肝臟、血液中膽汁酸濃度的測定 實驗小鼠在普通飼料/高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后，高脂高糖飼料喂養(yǎng)的小鼠大便膽汁酸濃度較普通飼料喂養(yǎng)的小鼠有所增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.74，P＞0.05)。之后各組在給藥/不給藥狀態(tài)下分別喂養(yǎng)4周后，由圖1可知，經(jīng)過消膽胺和阿嗪米特治療，小鼠大便中膽汁酸濃度顯著增加(t=2.64，P ＜0.05)，可見阿嗪米特可以協(xié)同消膽胺促進(jìn)大便中膽汁酸的排出;血液中膽汁酸濃度顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.61，P＜0.01);肝臟中膽汁酸濃度增高(t=3.01，P ＜0.05，t=7.90，P ＜0.01)，說明通過用藥，使肝臟合成的膽汁酸濃度增加，阿嗪米特進(jìn)一步促進(jìn)了膽汁酸的合成，有利于減少肝膽固醇的沉積，這可能是對膽固醇合成增加的一種適應(yīng)性調(diào)節(jié)。

表1 4組小鼠空腹血糖的測定Tab.1 Determination of fasting blood-glucose in four groups of micemmol·L －1，

表1 4組小鼠空腹血糖的測定Tab.1 Determination of fasting blood-glucose in four groups of micemmol·L －1，

與本組飼養(yǎng)2周時比較，*1 P＜0.01;與本組飼養(yǎng)8周時比較，*2 P ＜0.05，*3 P ＜0.01Compared with the same group at the 2nd week，*1 P ＜0.01;Compared with the same group at the 8th week，*2 P ＜0.05，*3 P ＜0.01

組別 小鼠數(shù) 飼養(yǎng)2周 飼養(yǎng)8周 飼養(yǎng)12周正常對照組20 6.10 ±0.35 6.11 ±0.21 6.23 ±0.85模型對照組 20 5.90 ±0.56 15.64 ±1.26*1 15.73 ±1.81消膽胺組 20 5.94 ±0.68 14.57 ±1.31*1 11.76 ±1.71*2聯(lián)合治療組 20 6.03 ±0.26 15.32 ±1.44*1 8.73 ±0.95*3

2.3 膽汁酸代謝相關(guān)基因mRNA定量分析 結(jié)果見圖2。消膽胺和阿嗪米特聯(lián)合治療條件下，膽汁酸的核受體 FXR基因 mRNA表達(dá)減少(t=3.62，P＜0.05)，CYP7A1基因 mRNA 表達(dá)明顯增加(t=2.68，P＜0.05)，CYP27A1基因 mRNA表達(dá)基本不變(t=0.93，P ＞0.05)，這表明，在消膽胺和阿嗪米特的聯(lián)合用藥條件下，抑制FXR基因的表達(dá)，從而激活CYP7A1基因的表達(dá)調(diào)控，可見消膽胺和阿嗪米特聯(lián)合治療對膽汁酸經(jīng)典合成途徑產(chǎn)生增強作用。

2.4 肝組織CYP7A1、CYP27A1蛋白表達(dá) 結(jié)果見圖3。Western blot結(jié)果可以看出，在消膽胺和阿嗪米特的聯(lián)合治療下，CYP7A1蛋白表達(dá)增加，CYP27A1蛋白表達(dá)無明顯變化。這與膽汁酸代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)結(jié)果一致，都說明消膽胺和阿嗪米特聯(lián)合治療對膽汁酸經(jīng)典合成途徑產(chǎn)生增強作用，而對膽汁酸替代合成途徑無顯著影響。

3 討論

近年來，隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和居民生活水平的提高，糖尿病發(fā)病率及患病率逐年增長，已成為繼心腦血管疾病及惡性腫瘤之后嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病[5]。糖尿病患者常伴隨膽固醇和膽汁酸水平增高和脂質(zhì)沉積，對膽固醇和膽汁酸代謝平衡產(chǎn)生影響[6]。膽汁酸是膽汁的主要成分，占膽汁總固體量50% ～70% ，也是膽固醇在肝內(nèi)的代謝產(chǎn)物，膽汁中膽汁酸/膽固醇比值下降是導(dǎo)致膽固醇過飽和狀態(tài)的重要因素[7]。膽汁酸不僅對脂類和脂溶性物質(zhì)的消化吸收以及調(diào)節(jié)膽固醇代謝起著重要作用，而且它還作為信號分子在糖代謝、脂代謝、能量代謝等方面發(fā)揮著重要的作用[8]。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.消膽胺組;D.聯(lián)合治療組;a.大便;b.血液;c.肝臟;與正常對照組比較，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01圖1 4組小鼠飼養(yǎng)12周后大便、血液和肝臟中膽汁酸濃度的柱狀圖A.normal control group;B.model control group;C.cholestyramine group;D.combination treatment group;a.feces;b.blood;c.liver;Compare with normal control group，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01Fig.1 Bile acid levels in feces，blood and liver of four groups of mice at the 12th week

A.正常對照組;B.模型對照組;C.消膽胺組;D.聯(lián)合治療組圖2 膽汁酸代謝相關(guān)基因mRNA定量分析柱狀圖A.normal control group;B.model control group;C.cholestyramine group;D.combination treatment groupFig.2 Quantitative analysis on mRNA expression related to bile acid metabolism

A.正常對照組;B.模型對照組;C.消膽胺組;D.聯(lián)合治療組圖3 4組肝組織CYP7A1和CYP27A1蛋白表達(dá)電泳圖A.normal control group;B.model control group;C.cholestyramine group;D.combination treatment groupFig.3 Protein expression of CYP7A1 and CYP27A1 in liver tissue of four groups

膽汁酸是機體膽固醇轉(zhuǎn)化排出體外的最主要形式，正常情況下膽汁酸主要在小腸下端被重吸收，只有很少的膽汁酸可以到達(dá)大腸，消膽胺可與膽汁酸螯合，阻礙膽汁酸的重吸收，增加隨大便排出的膽汁酸量，促進(jìn)膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化，從而降低體內(nèi)膽固醇含量[9]。然而，對于代謝紊亂的糖尿病患者單用消膽胺一種藥物療效往往不很滿意。糖尿病狀態(tài)下，肝臟膽固醇合成限速酶活性降低，肝內(nèi)膽固醇呈過飽和狀態(tài)，同時因內(nèi)臟自主神經(jīng)功能紊亂和微血管病變使膽囊收縮功能低下，膽囊排空延遲，膽汁流出不暢，造成膽汁郁積[10]。阿嗪米特為一強效的促進(jìn)膽汁分泌藥物，不僅影響肝臟的脂代謝，使肝臟合成膽汁酸的速率增強，改善膽固醇的過飽和狀態(tài)，而且可增加膽汁分泌量，特別是膽汁中固體成分的含量，增加胰酶活性[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，消膽胺可與膽汁酸結(jié)合形成絡(luò)合物從大便排出，減少膽汁酸的重吸收，從而增加大便中膽汁酸的濃度。另一方面，由于重吸收的膽汁酸減少，這也促進(jìn)肝臟消耗更多的膽固醇來合成新的膽汁酸，從而減少肝臟中膽固醇的瘀積。阿嗪米特與消膽胺協(xié)同治療，進(jìn)一步促進(jìn)膽汁酸的合成及分泌，這可能也是大便、肝臟、血液中膽汁酸濃度明顯增高的原因，聯(lián)合治療可獲得較滿意的療效。

肝通過“經(jīng)典途徑”和“替代途徑”合成膽汁酸。經(jīng)典途徑是主要途徑，膽汁酸是內(nèi)源性FXR配體，二者結(jié)合后抑制CYP7A1的表達(dá)。CYP7A1是膽汁酸經(jīng)典合成途徑的限速酶，其活性似乎與血漿膽固醇濃度成反比，CYP7A1的表達(dá)上調(diào)可以增加肝臟中膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化[12]。本研究結(jié)果表明，消膽胺在腸道與多種膽汁酸螯合，顯著影響膽汁酸的重吸收，導(dǎo)致FXR表達(dá)減少，CYP7A1的表達(dá)增加，使肝臟膽汁酸合成增加，消耗肝細(xì)胞內(nèi)的膽固醇，使膽固醇水平下降，在阿嗪米特協(xié)同作用下，進(jìn)一步促進(jìn)了CYP7A1表達(dá)。本研究還表明膽汁酸替代合成途徑的關(guān)鍵酶CYP27A1在用藥前后均未發(fā)生變化，說明膽汁酸合成增加是通過經(jīng)典途徑代謝增強引起。

綜上所述，深入研究膽汁酸及其信號通路，對于探討代謝相關(guān)性疾病如胰島素抵抗、2型糖尿病、高血壓、高脂血癥和動脈粥樣硬化等的發(fā)病機制和干預(yù)措施具有重要意義。消膽胺與阿嗪米特的聯(lián)合治療，探索其在膽汁酸代謝通路中所發(fā)揮的作用，不僅有利于豐富腸肝循環(huán)的研究內(nèi)容，深化對于代謝性疾病致病機制的了解，而且還尋找到新的治療途徑與靶點，為高膽固醇血癥、膽汁淤積肝病、糖尿病等疾病的治療提供了新的方向。

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