梁 鑫 成姝婷 王正榮** 何 煊 單旭東

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（成都 610041）； 2.四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院

·論 著·

Clock基因?qū)禹旙w酶的影響*

梁 鑫1成姝婷2王正榮2**何 煊2單旭東1

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（成都 610041）； 2.四川大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院

目的 研究雄鼠睪丸Clock基因沉默后，小鼠精子頂體酶的活性及功能。方法 在ICR小鼠睪丸內(nèi)注射Clock干擾質(zhì)粒干擾雄性小鼠睪丸節(jié)律基因Clock 的表達(dá)，研究：（1）進(jìn)行體外受精，觀察精子驅(qū)散卵丘顆粒細(xì)胞情況及受精率等；（2）檢測(cè)精子頂體內(nèi)頂體蛋白酶、透明質(zhì)酸酶活性及芳香基硫酸酯酶A（ASA）的含量。（3）將精子注射入卵母細(xì)胞，觀察受精卵及胚胎發(fā)育情況。結(jié)果 睪丸Clock 基因沉默后，精子驅(qū)散卵丘顆粒細(xì)胞時(shí)間延長(zhǎng)，受精率下降；精子頂體蛋白酶活性下降；透明質(zhì)酸酶活性和ASA含量無明顯變化；干擾組精子對(duì)卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育的影響小于未干擾組（P＜0.05）。結(jié)論 干擾睪丸Clock 基因表達(dá)后，影響精子頂體蛋白酶活性，從而影響雄性小鼠的生殖功能。

Clock 基因； 頂體蛋白酶； 精子； 不育，男性

近日節(jié)律基因廣泛存在于生物體內(nèi)，調(diào)控著機(jī)體的生命活動(dòng)。近來研究發(fā)現(xiàn)，近日節(jié)律的核心基因Clock與雄性的生殖密切相關(guān)。ClockΔ19/Δ19突變的雄性小鼠體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都提示生殖力下降［1］；干擾睪丸Clock 基因的表達(dá)引起小鼠胎仔數(shù)下降［2］。研究顯示，CLOCK蛋白限制性地表達(dá)在精子生成過程中圓形精子的頂體［3］，而精子頂體（特別是頂體內(nèi)水解酶）在受精過程中發(fā)揮重要作用。因此，本研究利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，限制性干擾小鼠睪丸Clock基因的表達(dá)，探討Clock基因?qū)π∈笊彻δ苡绊懙臋C(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

ICR小鼠，雄性8～10周齡，雌性4～6周齡，購(gòu)自四川省成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。使用標(biāo)準(zhǔn)小鼠籠具分籠飼養(yǎng)于光暗循環(huán)箱內(nèi)（光:暗=12h:12h），自由進(jìn)食和飲水，保持室溫為（24±1）℃。以隨機(jī)分組原則將小鼠分為兩組：（1）干擾組，注射Clock干擾質(zhì)粒于睪丸內(nèi)；（2）陰性對(duì)照組，注射武漢晶賽公司提供的通用陰性HK質(zhì)粒于睪丸內(nèi)。

（二） 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

主要試劑和材料：Clock干擾質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于OMEGA公司；孕馬血清促性腺激素（PMSG）和絨毛膜促性腺激素（HCG）購(gòu)自寧波市第二激素廠；各類培養(yǎng)皿及試管等購(gòu)于美國(guó)BD公司；巴斯德吸管購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司；Quinn's系列培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)SAGE公司；動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑In vivo-jetPEITM 為Poly Plus公司產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑、N-乙酰葡糖胺、透明質(zhì)酸為Sigma公司產(chǎn)品；芳基硫酸酯酶A（ASA）ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Unionhonest公司。

主要設(shè)備：英國(guó)Glaxcy二氧化碳培養(yǎng)箱，Nikon倒置顯微鏡，Nikon體視顯微鏡，超凈工作臺(tái)， GTL-16AL高速臺(tái)式離心機(jī)（南京大學(xué)生物技術(shù)開發(fā)公司），722分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀等。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）質(zhì)粒注射

用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。雄性小鼠乙醚麻醉后，將小鼠腹腔內(nèi)兩側(cè)睪丸推入已經(jīng)松弛的陰囊，固定后，用微量注射器分別將干擾質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒溶液20μL注射入干擾組和對(duì)照組小鼠的雙側(cè)睪丸。由于干擾質(zhì)粒的干擾效率在注射后的第三天達(dá)到高峰，同時(shí)小鼠的生精周期顯示，干擾效率達(dá)到高峰的精子從圓形精子到成熟精子需要15d，因此我們選擇在注射干擾質(zhì)粒的18d，手術(shù)法收集雄鼠精子。

（二） 體外受精

1. 雌鼠處理及卵母細(xì)胞獲得：腹腔注射雌鼠PMSG 10IU/只，間隔48h后，腹腔注射同批雌鼠HCG 10IU/只。注射HCG 15～16h后，頸脫臼法處死小鼠。仰臥小鼠，用酒精棉消毒鼠腹部，用剪刀在腹部剪開一小口后撕開皮膚，用剪刀剪開腹膜，更換剪刀和鑷子，找到子宮和輸卵管，在輸卵管和子宮交匯處剪斷輸卵管，將輸卵管放入裝有HEPES-HTF的培養(yǎng)皿中，同樣的方法處理小鼠的另一側(cè)。在解剖鏡下，用1mL注射器針頭撕開膨大的輸卵管壺腹部，釋放卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（OCCC），將OCCC移入含HTF的皿中沖洗后，移入預(yù)先已準(zhǔn)備好的卵培養(yǎng)皿中，設(shè)立干擾組和對(duì)照組，卵培養(yǎng)皿于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。

2. 精子收集：注射質(zhì)粒后18d，頸脫臼法處死雄鼠，仰臥小鼠，用酒精棉消毒小鼠腹部，用剪刀在腹部剪開一小口后撕開皮膚，用剪刀剪開腹膜，更換剪刀和鑷子，找到睪丸和附睪后，立即摘出附睪于準(zhǔn)備好的培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)液中洗一次，移入預(yù)平衡的培養(yǎng)液HTF（0.5～1mL，3037皿）中。用眼科剪將附睪剪成4～6塊，輕輕擠壓，將精液擠出，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育20～30min，使精子自由浮出。將初步孵育、分散好的精子懸液取出于離心管中，300×g，離心5min。吸出上清液，將底部沉淀加入0.5～1mL培養(yǎng)液底部，上游45min，吸出上清液，置培養(yǎng)箱中孵育約1h。

3. 體外受精及胚胎發(fā)育觀察：將孵育好的精子加入卵培養(yǎng)皿中，精子濃度1×106/mL。每隔3～5min，觀察干擾組和對(duì)照組精子脫顆粒細(xì)胞情況，直到卵丘顆粒細(xì)胞完全被驅(qū)散為止。精卵共孵育6h后，將受精卵洗數(shù)次，轉(zhuǎn)入已準(zhǔn)備好的生長(zhǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。第1天（受精當(dāng)天為0天），于受精后24h觀察干擾組和對(duì)照組卵裂情況，計(jì)算受精率。受精率=卵裂胚數(shù)/卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體數(shù)×100%。將分裂的胚胎置新卵裂液中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況。第3天更換新的囊胚培養(yǎng)液，進(jìn)行胚胎觀察后，繼續(xù)培養(yǎng)至第4天～第6天。分別記錄干擾組和對(duì)照組到達(dá)囊胚期的胚胎數(shù)和孵化胚胎數(shù)，計(jì)算囊胚生成率和胚胎孵化率。囊胚形成率=囊胚數(shù)/卵裂胚數(shù)×100%，胚胎孵化率=孵出胚胎數(shù)/囊胚總數(shù)×100%。

（三）頂體內(nèi)酶的檢測(cè)

1. 頂體酶活性檢測(cè)：特異性頂體酶活性的檢測(cè)采用Kennedy等［4］的方法。各取干擾組和對(duì)照組精子懸液約200～500μL，用2% formalin 100μL固定15 min后加入反應(yīng)液到測(cè)定管（T）、對(duì)照管（C）兩管；然后加入終止液到T、C兩管，T、C管再同時(shí)在24℃水中孵育至少1h；最后加入100μL終止液到T管，1 500×g，離心10min。雙蒸水調(diào)零后，用分光光度計(jì)（410nm波長(zhǎng)、0.5cm比色杯）分別測(cè)定T、C兩管的OD值。頂體酶活性（μIU/106）= ［（mean ODtest） -ODcontrol］ ×106/1 485×精子計(jì)數(shù)。

2. 透明質(zhì)酸酶活性檢測(cè)：透明質(zhì)酸酶活性采用Singer法測(cè)定［5］。精子懸液300×g，離心5min，調(diào)整精子濃度約108個(gè)/mL。取0.2mL精子懸液，加入1mL 0.15mol/L NaCl（1:5）稀釋。取1mL稀釋后懸液加入到0.1mL醋酸鹽緩沖液和0.1mL透明質(zhì)酸底物的混合物中，37℃恒溫孵育24h后，100℃加熱5min，進(jìn)一步冰水浴冷卻2～4min。再以500×g，離心5min后，取上清液，加入60μL的四硼酸鉀，100℃水浴5min，冰水浴冷卻2～4min。加入2mL的DMAB（二甲胺硼烷）混勻后，37℃水浴中孵育20min。將反應(yīng)混合物以1 500×g，離心10min，取上清液。在30min之內(nèi)測(cè)582nm處的吸光度。一個(gè)單位的透明質(zhì)酸酶的定義是37℃時(shí)1h內(nèi)產(chǎn)生1μmoL等量的N-乙酰葡糖胺（NAG）的釋放量。

3. 芳香基硫酸酯酶A（ASA）含量的測(cè)定［6］：測(cè)定采用ELISA法。將精子懸濁液350×g，離心10min，棄上清液后加入細(xì)胞裂解液，調(diào)整精子濃度為20×106/mL?；靹蚝?℃孵育5min，4℃、10 000×g，離心10min，取上清液。按照ASA ELISA 檢測(cè)試劑盒步驟測(cè)定樣本的ASA 含量。

（四）卵胞漿內(nèi)精子注射（ICSI）

1. 去除精子頂體：根據(jù)我院常規(guī)操作程序，采用密度梯度離心+上游法處理精液，即：先將正常組精子懸液于裝有40%和80%PureCeptionTM梯度液的離心管中離心（300×g，15min）后，棄上清液，將沉淀于精子洗滌液和受精液中分別洗滌。最后將洗滌后的沉淀混勻，小心轉(zhuǎn)入裝有0.5～1mL受精液的5mL試管底部，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱，傾斜45°，上游30min后收集高活力精子備用。經(jīng)過此方法處理后的精子，幾乎均為活動(dòng)精子。吸取約100μL處理后的精子懸液于1.5 mL離心管中，直接投入液氮1min，然后在37℃水浴中解凍。通過這個(gè)冷凍解凍程序，大部分精子將失去頂體［7］。

2. ICSI過程及受精卵觀察：將處理后的精子加入ICSI操作皿的PVP液滴或HEPES-HTF液滴中，在每個(gè)HEPES-HTF液滴加入一個(gè)卵子。將注射針轉(zhuǎn)入含精子的液滴中，精子制動(dòng)后，將精子以先尾后頭方式吸入顯微注射針內(nèi)，對(duì)處于MII期的成熟卵進(jìn)行顯微注射。將注射后的卵子在已平衡的受精液洗滌皿中沖洗后，移入培養(yǎng)皿微滴中，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。于5～7h后觀察有無第二極體及原核（PN），排出第二極體的卵認(rèn)為是活化的卵。ICSI后30h觀察受精卵發(fā)育是否出現(xiàn)異常。我們前期研究已顯示，注射5個(gè)精子時(shí)，頂體完整組與去頂體組相比較，卵母細(xì)胞異常率和原核形成率差異較顯著。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)注射5個(gè)精子，比較陰性質(zhì)粒頂體完整組（C）、陰性質(zhì)粒去頂體組（M），干擾質(zhì)粒頂體完整組（T）之間是否存在差異。

（五）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、干擾小鼠睪丸Clock基因?qū)芋w外受精過程及體外受精率和早期胚胎發(fā)育的影響

（一）干擾小鼠睪丸Clock基因?qū)域?qū)散卵丘顆粒細(xì)胞過程的影響

干擾組精子驅(qū)散卵丘顆粒細(xì)胞的時(shí)間延后于對(duì)照組（絕大部分卵丘顆粒細(xì)胞脫落時(shí)間延后2～10min不等，甚至更多時(shí)間），但隨著精卵孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，干擾組卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞最終也被完全驅(qū)散（圖1）。

圖1 精卵孵育相同時(shí)間兩組精子驅(qū)散卵丘顆粒細(xì)胞的程度精卵孵育約5min后，干擾組（A）卵母細(xì)胞外圍卵丘顆粒細(xì)胞沒有完全脫落（×200），而對(duì)照組（B）已完全脫落（×200）

（二）干擾小鼠睪丸Clock基因?qū)π∈缶芋w外受精及早期胚胎發(fā)育的影響

表1顯示，干擾組受精率和囊胚形成率下降，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05），但胚胎孵化率未受影響，兩者相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 干擾小鼠睪丸Clock基因?qū)π∈缶芋w外受精及早期胚胎發(fā)育的影響

二、頂體內(nèi)水解酶的檢測(cè)

（一）干擾小鼠睪丸Clock基因?qū)油该髻|(zhì)酸酶和芳香基硫酸酯酶A的影響

由表2可見，兩組透明質(zhì)酸酶的活性和兩組ASA含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 Clock干擾質(zhì)粒對(duì)小鼠精子透明質(zhì)酸酶和ASA的影響

（二）Clock干擾質(zhì)粒對(duì)小鼠精子頂體發(fā)育的影響

由表3可見，干擾組和對(duì)照組的精子完整頂體百分率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而頂體蛋白酶活性干擾組明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。

表3 Clock干擾質(zhì)粒對(duì)小鼠精子完整頂體百分率和頂體蛋白酶活性的影響

三、注射精子對(duì)卵母細(xì)胞及原核形成的影響

表4顯示，當(dāng)注射5個(gè)精子進(jìn)入卵母細(xì)胞時(shí)，陰性質(zhì)粒頂體完整組（C）、陰性質(zhì)粒去頂體組（M）與干擾質(zhì)粒頂體完整組（T）相比較，卵母細(xì)胞異常率和≥2PN率差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 注射精子對(duì)卵母細(xì)胞及原核形成的影響

討 論

近日節(jié)律是生命活動(dòng)的基本現(xiàn)象之一，它是由一系列近日節(jié)律基因及其表達(dá)產(chǎn)物構(gòu)成，彼此相互作用，調(diào)節(jié)生物體自身的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，近日節(jié)律核心基因Clock與生殖功能存在一定的關(guān)系［8］。2006年Dolatshad等發(fā)現(xiàn)ClockΔ19/Δ19突變的雄性小鼠與野生型比較生殖力下降20.59%［1］。ClockΔ19/Δ19突變的雄性小鼠能引起雌鼠的胎仔數(shù)減少［9］。我們前期利用RNA干擾技術(shù)，干攏小鼠Clock基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)：雌鼠的胎仔數(shù)明顯下降。小鼠睪丸組織的免疫組化顯示CLOCK蛋白限制性表達(dá)在精子生成過程中圓形精子的頂體，這種節(jié)律基因分離的表達(dá)模式造成睪丸缺乏近日節(jié)律。睪丸的主要功能是生成精子，精子的生成經(jīng)歷從精原細(xì)胞增殖分化形成精母細(xì)胞，最后形成精子的過程［10］，在整個(gè)過程中具有精確的時(shí)間調(diào)節(jié)。但是CLOCK蛋白高表達(dá)在圓形精子的頂體，引起我們的關(guān)注。

頂體是膜結(jié)合的帽狀結(jié)構(gòu)，它覆蓋于精子核表面，其功能在受精過程中起十分重要的作用。在圓形精子期，頂體囊泡逐漸融合，發(fā)育成形態(tài)完整的頂體［11］。當(dāng)精卵結(jié)合時(shí)，頂體內(nèi)的酶釋放出來，以溶解卵丘、放射冠和透明帶，幫助精子完成受精過程。到目前為止，我們知道CLOCK蛋白在細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的功能，而CLOCK蛋白的核外表達(dá)，并且表達(dá)在受精過程中十分重要和關(guān)鍵的頂體部位，提示Clock可能具有一種結(jié)構(gòu)上的非轉(zhuǎn)錄功能，值得我們作進(jìn)一步探索。

受精過程是一個(gè)非常復(fù)雜的生物過程，中間任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都可能導(dǎo)致受精失敗。頂體在受精過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，精子頂體功能缺陷、沒有頂體或頂體反應(yīng)對(duì)精子活力及穿透卵母細(xì)胞都會(huì)產(chǎn)生極大影響［12，13］。Mahutte等對(duì)人常規(guī)體外受精周期未受精卵進(jìn)行免疫熒光染色分析，發(fā)現(xiàn)56%～92%的未受精卵母細(xì)胞中找不到精子的染色質(zhì)，提示精子透明帶結(jié)合和穿透異常是體外受精失敗的常見原因［14］。Esfahani等認(rèn)為，頂體異常可導(dǎo)致體外受精的受精率顯著下降［15］，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，干擾組較對(duì)照組體外受精率明顯降低（P＜0.01），小鼠精子在受精過程中脫卵丘顆粒細(xì)胞的過程相比，對(duì)照組有延遲。在人類體外受精過程中，很多患者受精失敗是由于精子頂體功能的缺陷所致，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)：干擾雄性小鼠睪丸Clock基因表達(dá)后，影響精子頂體的功能，從而導(dǎo)致受精率下降，并延緩精子和卵母細(xì)胞受精的時(shí)間。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了頂體內(nèi)水解酶的變化，主要研究頂體蛋白酶與脫顆粒細(xì)胞酶（透明質(zhì)酸酶和ASA）的變化。頂體中含有頂體酶系統(tǒng)，它是一個(gè)復(fù)合酶系。頂體蛋白酶是精子頂體內(nèi)主要的酶類，在受精過程中發(fā)揮重要的作用。透明質(zhì)酸酶位于精子頂體后部［16］，主要作用是溶解卵丘顆粒細(xì)胞間透明質(zhì)酸，使卵丘細(xì)胞分散，精子得以通過這些細(xì)胞間隙［17］。ASA位于精子頭部表面的頂體嵴和頂體后區(qū)［18］。ASA在精子與透明帶結(jié)合及精卵質(zhì)膜結(jié)合的精卵識(shí)別中發(fā)揮了重要作用［19，20］。近年研究發(fā)現(xiàn)，ASA能特異性結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)驅(qū)散卵丘顆粒細(xì)胞起一定的作用。但ASA的這種功能和它的酶活性無關(guān)，卻與其精子頂體中酶的含量多少有關(guān)［21］。本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了頂體蛋白酶、透明質(zhì)酸酶的活性和ASA的含量。結(jié)果顯示：兩組小鼠精子頂體中的透明質(zhì)酸酶的活性和ASA的含量均無明顯差異，而頂體蛋白酶活性顯著下降。結(jié)合實(shí)驗(yàn)組小鼠精子對(duì)卵細(xì)胞脫顆粒細(xì)胞時(shí)間延遲的情況，我們分析干擾Clock基因后，主要影響精子的頂體蛋白酶活性，從而導(dǎo)致受精率下降。

為了進(jìn)一步研究Clock基因與頂體酶的關(guān)系，我們通過ICSI的方式，高度模擬精子頂體酶進(jìn)入卵母細(xì)胞后，對(duì)卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育的影響。已有研究顯示，頂體酶對(duì)卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)存在影響［22］。我們前期研究也證明，頂體內(nèi)水解酶對(duì)卵母細(xì)胞及胚胎發(fā)育存在一定的危害［23］。本研究將5個(gè)精子注射入卵母細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)干擾組對(duì)卵母細(xì)胞及原核形成影響小于陰性質(zhì)粒對(duì)照組，但其影響大于去頂體組。這進(jìn)一步證明，干擾Clock基因后，頂體內(nèi)部分水解酶受到一定程度的影響。

綜上所述，近日節(jié)律基因 Clock與精子頂體內(nèi)水解酶的形成有密切關(guān)系，具體影響機(jī)制還有待我們進(jìn)一步深入研究和探討。

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（2015-09-08收稿）

Infi uence of circadian Clock gene on acrosomal enzyme*

Liang Xin1，Cheng Shuting2，Wang Zhengrong2**，He Xuan2，Shan Xudong1
1.The Second Affi liated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610041， China；
2. College of Basic Medicine and Forensic Medicine，Sichuan University，
Corresponding author: Wang Zhengrong， E-mail: Lxin04@sohu.com

Objective To study the infi uence of knocking-down circadian gene Clock on acrosomal enzymes of male mice. Methods After injection of RNAi plasmid into mice testes ， the expression of circadian gene Clock in testis of mice was inhibited. in vitro fertilization （IVF） rate， acrosin， hyaluronidase activity and arylsulfatase A content in acrosome were measured to estimate the fertility of male mice. Results The RNAi plasmid reduced the fertility of male mice in vitro and decreased acrosin activity， but other enzymes were not changed obviously. During in vitro fertilization， the slight delay was observed only in the sperm of the test group dispersing granular cells. Conclusion Circadian gene Clock may be associated with the reproductive function in male mice.

Clock gene； acrosin； spermatozoa； infertility，male

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.11.001

R 339.2

資助: 四川省教育廳項(xiàng)目（14ZB0092）； 成都市科技項(xiàng)目（2014-HM01-00187-SF）； 成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金（ZRMS201344）

**通訊作者， E-mail: Lxin04@sohu.com