徐建新 朱 濤 呂勝啟 方登攀

1.江漢大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科（武漢 430015）； 2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科

應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片飛行時間質(zhì)譜儀研究弱精子癥患者精漿差異蛋白表達(dá)

徐建新1朱 濤1呂勝啟2方登攀1

1.江漢大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科（武漢 430015）； 2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科

目的 應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究弱精子癥患者及正常生育男性精漿中的差異蛋白，發(fā)掘與弱精子癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物。方法 收集36例弱精子癥患者和28例正常生育男性的精液樣本，離心分離獲取精漿，用H50蛋白質(zhì)芯片結(jié)合蛋白質(zhì)芯片-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（SELDI-TOF-MS）對各組精漿樣本進(jìn)行檢測，獲取各樣本的蛋白質(zhì)指紋圖譜，比較各組間蛋白質(zhì)圖譜表達(dá)差異。結(jié)果 在相對分子質(zhì)量在1 000～50 000Da范圍內(nèi)，共檢測到239種有差異的蛋白峰，其中11種有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。弱精子癥組與正常生育男性精漿蛋白質(zhì)譜相比，弱精子癥組有8種差異蛋白質(zhì)表達(dá)降低（P＜0.05），其中M/Z為7867.33的蛋白質(zhì)有顯著差異性（P＜0.01）。3種差異蛋白質(zhì)M/Z為1247.54、1673.51、11158.2，較正常組表達(dá)增高，其中M/Z為1673.51的蛋白質(zhì)有顯著差異性（P＜0.01）。結(jié)論 弱精子癥患者其精漿蛋白質(zhì)群較正常生育男性精漿有顯著改變，這些蛋白質(zhì)的降低可能與精子活力受損有重要相關(guān)性，本研究對探究弱精子癥的病因及其臨床診療具有重要意義。

弱精子癥； 精液； 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析； 差異蛋白質(zhì)

弱精子癥是導(dǎo)致男性不育的重要因素之一，但發(fā)病原因及機(jī)制尚不十分清楚，目前，常規(guī)的檢測方法及技術(shù)水平尚不能從整體水平上系統(tǒng)地分析精漿中的蛋白質(zhì)組成及其生物學(xué)功能，很大程度上阻礙了弱精子癥臨床診斷和治療的進(jìn)展。我們應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（SELDI-TOF-MS）研究弱精子癥患者精漿的差異蛋白表達(dá)，并發(fā)掘與弱精子癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物，以期為弱精子癥的診療開辟新的途徑，也為以后臨床運(yùn)用提供理論和實踐基礎(chǔ)。

資料和方法

一、臨床資料

所有標(biāo)本均于2014年3月至2014年10月取自武漢大學(xué)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，用正常生育男性自愿者捐獻(xiàn)的精液標(biāo)本作為正常對照組，患者禁欲一周，囑患者通過手淫法獲取全部精液。待標(biāo)本完全液化后，按精子分析儀對標(biāo)本進(jìn)行檢測，記錄精液標(biāo)本的顏色、體積、液化時間、pH值、精子活力、精子計數(shù)及畸形率等。按WHO方法分析后，選取結(jié)果均正常者28例，為正常（N）組；其他弱精子癥患者的精漿標(biāo)本來自生殖醫(yī)學(xué)中心就診的門診患者，按WHO方法分析后，選取結(jié)果符合弱精子癥標(biāo)準(zhǔn)者36例，為弱精子癥（RJ）組。標(biāo)本來源人員平均年齡28歲，精液標(biāo)本放入無菌離心管中，以1 509×g，離心15 min；用光學(xué)顯微鏡鏡檢確認(rèn)精漿中無精子細(xì)胞存在，取上層精漿標(biāo)本1～3 mL裝入凍存管中，置入-80℃冰箱中冷凍保存。

二、研究方法

（一）精漿標(biāo)本處理

從-80℃冰箱中取出精漿樣本，置冰盒上融解；以16 785×g，4℃離心2min；取上清液備用；每個芯片點需要精漿50μL，將樣品上樣到芯片上。

（二）芯片處理

取出H50蛋白質(zhì)芯片，每個加樣點上加5μL的75%ACN溶液，蓋住芯片上的加樣點，放入濕盒2min，取出后移去ACN，每個芯片點用5μL HPLC H2O在芯片點上反復(fù)洗2次。將上樣用的的生物芯片處理器 （Bioprocessor） 洗滌若干次，再用去離子水洗滌，取出后晾干備用。用結(jié)合緩沖液（10%ACN, 250mol NaCl 加至1倍的PBS），每孔加上200μL，置振蕩器42×g，5min 后甩去孔中液體，再次加入緩沖液200μL，重復(fù)操作一次。

（三）上機(jī)檢測

取精液50μL上樣，置振蕩器（MS1 Minishaker）42×g，4℃震蕩1h。每孔加上結(jié)合緩沖液200μL。置振蕩器（MS1 Minishaker）42×g，5min 后甩去孔中液體，再次加入結(jié)合緩沖液200μL，重復(fù)操作一次，加入去離子水（HPLC grade）200μL， 迅速甩干，取80μL 100%乙腈，和1%的 TFA 80μL加入EAM（SPA）試管中，劇烈混勻3 min，靜置 5 min，以42 970×g，離心2 min，取上清后備用。取出芯片后，待微干后，在每個加樣孔上加SPA 0.5μL，待微干后，重復(fù)一次。待干后，即可上機(jī)測定。

三、蛋白質(zhì)指紋圖譜

利用TOF質(zhì)譜儀對制備好的樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，采用蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)PBSII-C型讀取數(shù)據(jù)，經(jīng)過優(yōu)化采用激光強(qiáng)度為180，加速源電壓為20000V，檢測器靈敏度為8，真空度為8.387e-007 Torr，掃描質(zhì)量范圍為1000～50000Da，收集次數(shù)為112次/每點。所有芯片按照上述條件檢測。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用Ciphergen ProteinChip Software 3.2.1軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件包對篩選符合正態(tài)分布的樣本進(jìn)行獨立樣本t檢驗分析，P＜0.05時有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

用H50蛋白質(zhì)芯片結(jié)合技術(shù)SELDI-TOF-MS對各組精漿樣本進(jìn)行檢測，捕獲各組標(biāo)本的蛋白質(zhì)指紋圖譜，對兩組精漿樣本進(jìn)行比較分析，顯示結(jié)果為：（1）弱精子癥組（RJ）組與正常（N）組精漿中的差異蛋白質(zhì)，見表1。（2）H50蛋白質(zhì)芯片篩選到的弱精子癥差異蛋白，見表2。（3）建新弱精子癥（RJ）組與正常（N）組的精漿差異蛋白指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖，見圖1～圖11。

在相對分子質(zhì)量在1 000～50 000Da范圍內(nèi)，共檢測到239種有差異的蛋白峰，其中11種有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。弱精子癥組與正常生育男性精漿蛋白質(zhì)譜相比，弱精子癥組有8種差異蛋白質(zhì)表達(dá)降低（P＜0.05），其中M/Z為7867.33的蛋白質(zhì)有顯著差異性（P＜0.01）。3種差異蛋白質(zhì)表達(dá)較正常組表達(dá)增高，M/Z為1247.54、1673.51、11158.2，其中M/Z為1673.51的蛋白質(zhì)有顯著差異性（P＜0.01）。

表1 弱精子癥（RJ）組與正常（N）組精漿中差異蛋白質(zhì)列表

M/Z：蛋白質(zhì)荷比； Mean-RJ弱精子癥組對應(yīng)峰高的平均值； SD-RJ弱精子癥組樣本標(biāo)準(zhǔn)差； Mean-N正常組對應(yīng)峰高的平均值； SD-N正常組樣本標(biāo)準(zhǔn)差

圖1 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z1247.54 ）

圖2 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z1435.49）

圖3 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z1673.51）

圖4 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z1951.38）

圖5 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z 3143.82）

圖6 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z 3815.13）

圖7 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z 5815.46）

圖8 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z 7867.33）

圖9 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z 8093.93）

圖10 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z 9715.10）

圖11 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z 11158.2）

表2 H50蛋白質(zhì)芯片篩選到的弱精子癥差異蛋白

討 論

弱精子癥是指精液參數(shù)中向前運(yùn)動的精子（a和b級）小于50%或a級運(yùn)動的精子小于25%的病癥，故又稱為精子活力低下。男性不育是嚴(yán)重的全球性的醫(yī)學(xué)及社會問題［1］，而弱精子癥是引起男性不育的重要疾病因素之一，文獻(xiàn)報道，因精子活力低下而導(dǎo)致的男性不育約占所有男性不育致病因素的50%［2］。目前已知，導(dǎo)致精子活力差的因素包括：精漿異常、生殖道感染、免疫因素、精索靜脈曲張、內(nèi)分泌因素、全身性疾?。?,4］。

精漿中的蛋白質(zhì)、電解質(zhì)、糖類、酶類及微量元素等作為精子重要的生存和活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，對精子受精能力的維持等起著關(guān)鍵性的作用，或由于某些因素導(dǎo)致精漿中蛋白質(zhì)含量的改變，精子的活力及受精能力將會受到嚴(yán)重影響［5］。對精漿中差異蛋白質(zhì)的研究分析，可以為精子的發(fā)育、運(yùn)動、受精能力等相關(guān)研究提供有利線索，而且還可為男性生殖系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制的完善及臨床診斷和治療提供幫助。因此，充分認(rèn)識精漿中的蛋白質(zhì)組特征，有助于探尋導(dǎo)致精子活力低下的原因。

蛋白質(zhì)芯片-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)是美國的Bill Hutchens和Tai Yung Yip在1993年提出的，SELDITOF-MS技術(shù)將芯片技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，在分析過程中不破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，是一種集蛋白質(zhì)樣品處理、檢測及統(tǒng)計分析于一體的具有高度并行性、微型化、高通量、自動化的檢測工具［6］。它彌補(bǔ)了二維電泳對低峰度、重復(fù)性差、低溶解度、低通量、操作復(fù)雜、小分子量蛋白質(zhì)和極大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)無法鑒別的不足，SELDI-TOF-MS鑒定蛋白快速而準(zhǔn)確，不需要對樣本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行提純，可以直接對樣本進(jìn)行分析，檢測樣本需要量少，可以對多樣本同時進(jìn)行檢測，進(jìn)一步提高了蛋白質(zhì)分離和鑒定蛋白質(zhì)功能的速度。目前，蛋白質(zhì)芯片-飛行時間質(zhì)譜技術(shù)已應(yīng)用于臨床研究，并且收到較好的效果，蛋白質(zhì)組學(xué)組織利用質(zhì)譜技術(shù)對人類體液中的精漿、尿液、眼淚進(jìn)行檢測，檢測出精漿中含有1303 種蛋白質(zhì)，通過質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)精漿、尿液、眼淚中約有190 種蛋白質(zhì)相同［7］。

在對弱精子癥的研究方面，SELDI-TOF-MS技術(shù)也初步展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。2006年楊歡等應(yīng)用SAX-2和H4蛋白質(zhì)芯片結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)檢測少精子癥患者的精漿，并與正常健康生育男性的精漿進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)了一種M/Z為11022.9的蛋白質(zhì)在少精子癥患者精漿中含量明顯降低，M/Z為16751.6的蛋白質(zhì)峰明顯增高［8］。有研究者通過分析不育男性的精子膜蛋白組成，發(fā)現(xiàn)了一條78KD的精子蛋白，利用精子蛋白及其抗體區(qū)別異常的精子，在臨床過程中診斷男性不育［9］。Liu等應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)分析了年輕及年老弱精子癥患者精液中PATE1蛋白質(zhì)的差異性，并認(rèn)為PATE1蛋白是進(jìn)一步探索弱精子癥的靶蛋白［10］。

我們采用SELDI-TOF-MS技術(shù)及選用H50蛋白質(zhì)芯片對弱精子癥患者和正常男性精漿蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測，建立弱精子癥（RJ）組與正常（N）組的精漿差異蛋白指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖，并發(fā)掘精漿中與弱精子癥精子發(fā)育、成熟、活力密切相關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物。結(jié)果證實弱精子癥組與正常組相比精漿中存在著差異蛋白質(zhì)，捕獲到的差異蛋白質(zhì)數(shù)有11種，有3種M/Z為1247.54、1673.51、11158.2的蛋白質(zhì)含量高于正常組，其中M/Z為1673.51的蛋白質(zhì)有顯著差異性（P＜0.01）；其余8種差異蛋白質(zhì)的含量均低于正常組，其中M/Z為7867.33的蛋白質(zhì)有顯著差異性（P＜0.01），說明精漿中這些蛋白質(zhì)的含量變化很可能與弱精子癥的發(fā)病機(jī)制存在著重要的相關(guān)性。其他學(xué)者也利用SELDI-TOF-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)了弱精子癥患者和正常男性精漿蛋白質(zhì)中一些差異蛋白質(zhì)，這些實驗結(jié)果均有助于擴(kuò)充蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,有助于對其發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步調(diào)查［11］。

通過蛋白質(zhì)芯片的大規(guī)模檢測，可以從弱精子癥患者的精漿中尋找到微量差異蛋白質(zhì)的變化，差異蛋白質(zhì)組成的精漿蛋白質(zhì)指紋圖譜的特征性變化為尋找弱精子癥的病因提供了線索，使用SELDI-TOF-MS技術(shù)進(jìn)行精漿中蛋白質(zhì)的檢測是非常好的選擇，為我們對精漿蛋白質(zhì)的研究提供了一個強(qiáng)有力的工具。

但是，因為SELDI-TOF-MS測得的是該種差異蛋白的質(zhì)荷比 ，該技術(shù)由于還不能直接給出差異蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能等信息，故無法明確具體蛋白質(zhì)信息。對所測得的差異蛋白進(jìn)行分離研究，并搜索相關(guān)數(shù)據(jù)庫能夠了解該差異蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，可以闡明該種差異蛋白的生物功能本質(zhì)，才能最終闡明弱精子癥的發(fā)病機(jī)制，并可望對于弱精子癥的診斷和治療提供新的思路。

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（2015-08-08收稿）

Differential protein profile analysis in seminal plasma of asthenospermia patients by SELDI-TOF-MS

Xu Jianxin1, Zhu Tao1, Lv Shengqi2, Fang Dengpan1
1. Department of Urology,Affi liated Hospital of JiangHan University, Wuhan 430015, China；2. Department of Urology, Renmin Hospital of Wuhan University

Objective To comparatively analyze differential protein profiles in seminal plasma between asthenospermia patients and normal fertility men, and fi nd out asthenospermia associated proteins. Methods Semen samples of 36 asthenospermia patients and 28 subjects with normal fertility were collected. Seminal plasma were further obtained by centrifugation. Protein profile of seminal plasma was detected by the H50 protein chip and surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-fi ight mass spectrometry. Results A total of 239 protein peaks with 1000-50000 Da were identifi ed, and 11 protein peaks showed signifi cant expression differences between asthenospermia patients and the healthy fertile males（P＜0.05）, of which 8 were downregulated compared with that of the healthy controls, the protein peak with M/Z 7867.33 had extremely signifi cant difference（P＜0.01）. Another 3 differentially expressed proteins with M/Z 1247.54,1673.51 and 11158.2 were obviously upregulated compared with that of healthy control, of which protein peak with M/Z 1673.51 had extremely signifi cant difference（P＜0.01）. Conclusion Protein profi les of seminal plasma of asthenospermia patients were signifi cantly different from those of normal fertility, and some down-regulated proteins might be correlated with the damage of sperm motility. This study is helpful for the etiology analysis and biomarks discovery of asthenospermia.

asthenozoospermia； semen； protein array analysis； different proteins

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.10.003

R 698.2