段小海 宋焱龍 胡 煒

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京100049)

谷胱甘肽(GSH)是細(xì)胞內(nèi)最重要的抗氧化和抵抗自由基的物質(zhì), 與許多生理生化反應(yīng)密切相關(guān),比如細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo), 外源物的代謝和硫醇二硫化轉(zhuǎn)換作用等。谷胱甘肽不僅保護(hù)細(xì)胞膜免受超氧化合物的攻擊, 同時(shí)維持含硫醇基團(tuán)蛋白質(zhì)的還原性,以維持它們正確的生物學(xué)功能, 當(dāng)細(xì)胞不能保持谷胱甘肽正常含量時(shí)其生物學(xué)功能會(huì)遭受不可逆的破壞[1]。細(xì)胞還原性的維持對(duì)于細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)以及表觀遺傳修飾都具有重要意義。胚胎發(fā)育過程中涉及一系列高度控制的細(xì)胞增殖和分化過程, 卻對(duì)各種內(nèi)源和外源氧化性物質(zhì)很敏感。許多的研究都證實(shí), GSH的濃度、GSH在細(xì)胞核的定位與細(xì)胞周期的調(diào)控、細(xì)胞分化密切相關(guān)[2]。最新的研究顯示GSH很有可能是一種新的內(nèi)分泌因子[3]。

生物體內(nèi)通過谷胱甘肽循環(huán)合成和分解谷胱甘肽, 參與谷胱甘肽循環(huán)的共有 6個(gè)酶, 其中參與谷胱甘肽合成的酶有5羥脯氨酸酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶、谷胱甘肽合成酶和轉(zhuǎn)肽酶, 參與谷胱甘肽分解的酶有谷氨酰環(huán)化轉(zhuǎn)移酶(GGCT)和谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)。GGCT最早于1972年在大鼠的組織勻漿中發(fā)現(xiàn)[4], 近年來發(fā)現(xiàn) GGCT在很多癌組織中有異常高表達(dá), 被認(rèn)為是一種癌癥標(biāo)記因子[5]。最近的研究表明, 與胞漿中的 GGCT比較, 在人類尿路上皮細(xì)胞, 附睪滋養(yǎng)層細(xì)胞, 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和黏液細(xì)胞的細(xì)胞核中的 GGCT, 分子量較小, 可能由選擇性剪切或翻譯后加工形成, 作者據(jù)此認(rèn)為定位于細(xì)胞核中的GGCT的功能值得深入研究[6]。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn), 性腺敗育的轉(zhuǎn)反義 sGnRH轉(zhuǎn)基因鯉(Cyprinus carpio )中, 腦部 GGCT的表達(dá)水平比對(duì)照鯉明顯升高[7]。GGT位于谷胱甘肽循環(huán)過程中GGCT的上游, 與GGCT共同參與GSH分解代謝。GGT突變型小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的生殖發(fā)育異常, 研究結(jié)果證實(shí) GGT對(duì)維持小鼠的生殖發(fā)育系統(tǒng)中半胱氨酸的正常水平具有非常重要的意義[8]。以上結(jié)果均提示GGCT可能除了作為癌癥標(biāo)記因子外, 還具有不為人所知的重要生物學(xué)功能。本研究采用 MO技術(shù)在斑馬魚早期胚胎中抑制 GGCT的表達(dá), 同時(shí)通過化學(xué)阻斷劑阻斷谷胱甘肽循環(huán)中GGCT上游的γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)和下游的5羥脯氨酸酶, 探索了GGCT在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中的功能。

在人類的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn), 谷氨酰胺循環(huán)過程中的酶缺陷, 會(huì)造成智力低下學(xué)習(xí)障礙等缺陷[9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)有 10%—30%的谷胱甘肽合成酶缺陷患兒在新生兒期內(nèi)死亡, 存活下來的一般患有嚴(yán)重的智力發(fā)育遲鈍[10]。斑馬魚具有體外發(fā)育、胚胎透明等特點(diǎn),本研究將為建立斑馬魚相關(guān)疾病模型, 研究和治療GSH代謝異常引起的相關(guān)疾病提供新的思路和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用 AB系斑馬魚來自本實(shí)驗(yàn)室, 按斑馬魚手冊(cè)養(yǎng)殖規(guī)范飼養(yǎng)[11]。魚房恒溫 28.5℃, 光照和熄燈的時(shí)間為12h︰12h。用于全胚胎原位雜交的斑馬魚胚胎經(jīng)過脫膜處理, 在受精 10h后使用0.3 mmol/L 的 1-苯基-2-硫脲(1-phenyl-2-thiourea)抑制黑色素形成。

1.2 MO、mRNA和化學(xué)阻斷劑的顯微注射

在本研究中使用的 GGCT-MO及其 5-missmatch 對(duì)照均購(gòu)自Gene Tools公司, GGCT-MO設(shè)計(jì)為針對(duì)ggct基因ATG區(qū)阻斷該基因的翻譯過程, 其序列為 5′-AGCTGAGGATCATCCAGGAGCTCAT-3′,5-miss-match MO 的序列為 5′-AGCTCACGATCAT GCAGCACCTCAT-3′。谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)化學(xué)阻斷劑異惡唑醋酸(Acivicin)購(gòu)于LKT Laboratories公司[12], 5羥脯氨酸酶(5-oxoprolinase)阻斷劑2-咪唑-4-羧酸乙酯(2-Imidazolidone-4-carboxylate)購(gòu)于 Sigma公司[13]。構(gòu)建CMV驅(qū)動(dòng)ggct基因CDS區(qū)融合綠色熒光蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒。構(gòu)建 PCS2-ggct表達(dá)質(zhì)粒, 線性化后用SP6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)轉(zhuǎn)錄出ggct-mRNA。向斑馬魚受精卵注射ggct-GFP質(zhì)粒, 共注射質(zhì)粒和GGCT-MO, 質(zhì)粒和5-miss-match MO檢測(cè)MO的有效性; 注射MO, 5-miss-match MO, 共注射MO和ggct mRNA觀察胚胎表型和用于原位雜交檢驗(yàn); 注射異惡唑醋酸, 2-咪唑-4-羧酸乙酯觀察胚胎表型。以上化合物均于1細(xì)胞期顯微注射于斑馬魚受精卵, 注射濃度為0.5 nmol/μL, 注射量為2 nL/egg。

1.3 全胚胎原位雜交

收集野生型, 注射 MOs化合物, 以及 MO 與ggct mRNA共注射受精后10h、36h與48h斑馬魚胚胎, 于4%多聚甲醛-PBS溶液4℃固定過夜, 實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)已有文獻(xiàn)操作[14]。地高辛標(biāo)記的shha、fgf8、wnt8b探針, 通過斑馬魚腦 cDNA擴(kuò)增后加 XholⅠ和HindⅢ接頭連接于PCS2+載體內(nèi), HindⅢ線性化后使用DIG RNA Labeling Kit (Roche.Indianapols.In.)合成。雜交后的胚胎避光保存在甘油中。

1.4 總谷胱甘肽的含量分析

使用測(cè)定 DTNB 方法[15]測(cè)定胚胎樣品的谷胱甘肽含量。取GGCT-MO注射, 阻斷劑處理, 以及對(duì)照組受精后36h時(shí)斑馬魚胚胎各20尾, PBS洗一次,吸盡上清, 加入100 μL蛋白去除劑M溶液(GSH 和GSSG Assay Kit, 碧云天, 上海), 使用勻漿器充分勻漿, 混合后 4℃放置 5min, 4℃, 10000×g離心10min。通過谷胱甘肽還原酶把GSSG還原成GSH,而和生色底物DTNB反應(yīng)產(chǎn)生黃色的TNB和GSSG,從而通過測(cè)定A412就可以計(jì)算出總谷胱甘肽的量。用GSH清除試劑先清除樣品中的GSH, 然后利用上述反應(yīng)原理就可以測(cè)定出GSSG的含量。用總谷胱甘肽(GSSG+GSH)的量扣除 GSSG 的含量, 就可以計(jì)算出GSH的含量。

2 結(jié)果

2.1 GGCT-MO有效性檢測(cè)

本研究構(gòu)建了CMV驅(qū)動(dòng)ggct基因CDS區(qū)融合綠色熒光蛋白基因的表達(dá)質(zhì)粒與 GGCT-MO共注射斑馬魚胚胎的方法, 檢測(cè)GGCT-MO和其對(duì)照MO阻斷ggct基因翻譯的有效性。在斑馬魚受精卵發(fā)育10h時(shí), 于熒光顯微鏡下觀察到的結(jié)果如圖1所示, 單獨(dú)注射ggct綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒(圖1A)和質(zhì)粒與對(duì)照MO共注射(圖1C)時(shí)胚胎均正常表達(dá)綠色熒光, 而質(zhì)粒與 GGCT-MO共注射(圖 1B)時(shí)不能表達(dá)綠色熒光, 說明GGCT-MO能有效的抑制ggct翻譯的起始。

2.2 GGCT-MO注射對(duì)早期斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

向受精后處于1細(xì)胞期的斑馬魚胚胎顯微注射GGCT-MO, 比較野生型和注射 GGCT-MO與對(duì)照MO后的斑馬魚胚胎, 如圖2所示, GGCT-MO注射會(huì)導(dǎo)致33.33%的斑馬魚體型短小、體節(jié)發(fā)育異常和尾短彎曲(圖2A、圖3B)。53.88%的斑馬魚頭部發(fā)育緩慢(圖2B、圖3B)。12.97%的斑馬魚心血管系統(tǒng)出現(xiàn)多種形態(tài)改變, 包括卵黃水腫, 環(huán)心室水腫, 心臟畸形, 心臟線性化(圖 2C-D、圖 3B)。MO 敲降GGCT后斑馬魚早期胚胎發(fā)育的總畸形率為72.25%,死亡率為 9.09%(圖 3A)。ggct-mRNA與 GGCT-MO共注射, 斑馬魚早期胚胎發(fā)育的死亡率為 2.37%,總畸形比例為 32.6%(圖 3A); 其中體節(jié)畸形比例下降為3.6%, 腦發(fā)育畸形比例下降為30.25%, 未出現(xiàn)圍心腔水腫表型(圖3B)。

分別收集受精后發(fā)育10h、36h與48h的三個(gè)發(fā)育時(shí)期胚胎, 使用全胚胎原位雜交的方法(In situ hybridization)檢測(cè)腦部發(fā)育標(biāo)志因子 shha、fgf8、wnt8b的表達(dá)變化, 結(jié)果如圖4所示, GGCT-MO的注射影響這些因子的表達(dá), 注射GGCT-MO后shha和wnt8b表達(dá)量增多(圖4A-C、E-G、M-O), fgf8表達(dá)量減少(圖4I-K)。ggct-mRNA與GGCT-MO共注射胚胎在受精后36h和48h, 標(biāo)記基因fgf8和wnt8b的變化趨勢(shì)減弱(圖4K-L、O-P)。

圖1 GGCT-MO及對(duì)照MO的有效性檢測(cè)Fig. 1 Efficiency of GGCT-MO and control MO

圖2 MO注射斑馬魚早期胚胎產(chǎn)生的表型Fig. 2 Abnormal embryos caused by MO microinjection

圖3 MO與對(duì)照注射后斑馬魚胚胎的畸形比例Fig. 3 Abnormal embryos ratio caused by MOs and control injection

阻斷GGCT上游的g 谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和下游的 5羥脯氨酸酶, 同樣以顯微注射的方式處理斑馬魚胚胎。谷氨酰轉(zhuǎn)移酶阻斷劑處理斑馬魚胚胎發(fā)育緩慢, 79%的胚胎停留在bud時(shí)期之前(圖5B-C), 5羥脯氨酸酶處理斑馬魚胚胎出現(xiàn)圍心腔水腫(圖5E-F), 畸形率為62%。

2.4 MOs和化學(xué)阻斷劑注射胚胎的谷胱甘肽檢測(cè)

圖4 GGCT-MO注射影響腦發(fā)育相關(guān)因子的表達(dá)Fig. 4 GGCT-MO injection affects expression of some marker genes of brain development

圖5 化學(xué)阻斷劑處理后斑馬魚早期胚胎產(chǎn)生的表型Fig. 5 Abnormal embryos caused by chemical blockers microinjection

檢測(cè)GGCT-MO注射和阻斷劑處理斑馬魚胚胎的總谷胱甘肽含量(圖 6)和還原型谷胱甘肽含量(圖7), 結(jié)果表明MOs和化學(xué)阻斷劑處理胚胎的總谷胱甘肽含量均約為59.3 nmol/μL, 無明顯區(qū)別。GGCTMO注射和GGT的化學(xué)阻斷都能導(dǎo)致胚胎GSH含量的顯著減少(n=6, P<0.05), 野生型胚胎GSH含量為 57.96 nmol/μL, MO注射后胚胎的 GSH含量為55.73 nmol/μL, GGT阻斷后的胚胎 GSH 含量為55.75 nmol/μL, cMO注射和5羥脯氨酸酶阻斷的胚胎GSH含量為60 nmol/μL, 與野生型差異不顯著。

3 討論

3.1 敲降ggct影響斑馬魚背腹軸和腦部發(fā)育

圖6 MOs注射和阻斷劑處理胚胎的總谷胱甘肽含量Fig. 6 The total GSH/GSSG concentration of embryos treated with MOs and chemical blockers

圖7 MOs注射和阻斷劑處理胚胎的GSH含量(n=6, “*”P<0.05)Fig. 7 The GSH concentration of embryos treated with MOs and chemical blockers

敲降ggct表達(dá), 斑馬魚胚胎出現(xiàn)頭部發(fā)育緩慢,體節(jié)彎曲, 圍心腔水腫等異常發(fā)育表型。在胚胎發(fā)育的過程中, 各種細(xì)胞沿著前-后軸, 背-腹軸特化形成不同的組織和器官。軸的特化過程是各種基因相互作用的結(jié)果[16]。在敲降ggct導(dǎo)致的各種異常表型中, 腦部發(fā)育異常所占比例最高(53.88%), 據(jù)此我們選擇了控制腦部發(fā)育的標(biāo)記基因 shha、fgf8和wnt8b研究ggct敲降后的表達(dá)變化。shha表達(dá)于軀體中線, 控制頭部結(jié)構(gòu)和發(fā)育, 引導(dǎo)中樞神經(jīng)板形成, 并參與早期胚胎發(fā)育的多個(gè)過程[17]。fgf8是一種重要的纖維母細(xì)胞生成因子, 在腦部中集中表達(dá),抑制細(xì)胞背部化命運(yùn)[18]。wnt8b在腦部區(qū)域的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞背部化, 抑制腹部化命運(yùn)[19]。研究發(fā)現(xiàn),敲降ggct導(dǎo)致斑馬魚背部化因子wnt8b增加, 而抑制背部化的fgf8表達(dá)減少, shha表達(dá)量增加, 說明敲降ggct影響了斑馬魚早期胚胎的背腹軸形成及腦部發(fā)育。采用 ggct-mRNA與MO共注射, 發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎的死亡率由 9.09%下降為 2.37%, 總畸形率由72.25%下降為 32.6%, 其中腦部發(fā)育畸形胚胎比例由53.88%下降為30.25%, fgf8、shha、wnt8b表達(dá)的變化趨勢(shì)減弱, 證明注射 GGCT-MO對(duì)斑馬魚早期胚胎的背腹軸形成和腦部發(fā)育的影響是由ggct的敲降引起。

3.2 敲降ggct影響GSH的分解代謝

為了進(jìn)一步研究敲低 GGCT-MO后, 斑馬魚胚胎出現(xiàn)的異常發(fā)育表型以及腦部發(fā)育相關(guān)因子的表達(dá)變化是由于MO對(duì)ggct基因翻譯的阻斷引起, 而非由于 MO的毒性和非靶標(biāo)的效應(yīng)造成的結(jié)果, 我們使用化學(xué)阻斷劑阻斷谷胱甘肽循環(huán)過程中 GGCT上游的ggt基因和GGCT下游的5羥脯氨酸酶基因的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)阻斷 ggt基因的表達(dá)后出現(xiàn)斑馬魚胚胎發(fā)育停滯, 79%的胚胎停留在 bud時(shí)期之前, 且GSH含量明顯下降; 阻斷5羥脯氨酸酶基因62%的斑馬魚胚胎出現(xiàn)圍心腔水腫, GSH含量無明顯改變。GGT與 GGCT共同參與 GSH的分解代謝, 敲降GGCT胚胎GSH含量同樣明顯下降, 5羥脯氨酸酶分解5羥脯氨酸釋放谷氨酸用于GSH合成, 已有研究證實(shí)由于谷氨酸可以由其他途徑獲得, 阻斷 5羥脯氨酸酶不影響GSH循環(huán)[20], 說明阻斷5羥脯氨酸酶造成的圍心腔水腫可能由于氧化性損傷造成, 而敲降GGCT和阻斷GGT對(duì)斑馬魚早期胚胎發(fā)育遲緩和發(fā)育停滯可能通過影響 GSH的正常分解代謝而實(shí)現(xiàn)。

r谷氨酰環(huán)化轉(zhuǎn)移酶是谷胱甘肽循環(huán)過程中參與谷胱甘肽分解的關(guān)鍵酶, 近年來有研究提示GGCT可能具有重要的生物學(xué)功能, 但未見任何相關(guān)報(bào)道。本研究以斑馬魚為模型, 通過敲降ggct基因的表達(dá)并進(jìn)行拯救實(shí)驗(yàn), 采用化學(xué)阻斷劑阻斷谷胱甘肽循環(huán)等處理, 發(fā)現(xiàn)谷氨酰環(huán)化轉(zhuǎn)移酶在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中具有重要作用。