左　勇，傅　彬，葉碧霞，江　鵬，王小龍，楊小龍（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

一株綠色素產(chǎn)生菌的篩選及鑒定

左勇，傅彬，葉碧霞，江鵬，王小龍，楊小龍
（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢643000）

目的：從土壤中篩選綠色素產(chǎn)生菌株并對該菌株進(jìn)行鑒定。方法：采用平板法分離產(chǎn)綠色素菌株，利用形態(tài)、生理生化及分子生物學(xué)的方法對菌株進(jìn)行菌種鑒定。結(jié)果：從四川理工學(xué)院校園土壤中分離得到一株產(chǎn)綠色素的放線菌t9，在高氏一號培養(yǎng)基上，氣生菌絲為灰白色，基內(nèi)菌絲為綠色。該菌株基因序列與鼠灰鏈霉菌Streptomyces_murinus_NBRC_12799（T）相似度為99%，以Neighbor-Joining（N-J）法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)論：菌株t9的16S rDNA序列分析結(jié)果結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及生理生化鑒定，確定該菌株為鼠灰鏈霉菌屬（Streptomyces_murinu），并將其命名為Streptomyces_murinus t9。

綠色素，鏈霉菌，篩選

天然色素因其色澤自然、無毒、安全性高的特點，逐漸取代合成色素［1-3］。天然色素主要來自于植物組織、動物、礦物質(zhì)及微生物。與植物、動物及礦物色素相比，微生物色素具有提取成本低、原料不受季節(jié)和氣候限制的優(yōu)勢。相關(guān)文獻(xiàn)報道［4-7］，有些微生物色素不但可以作為食品添加劑，同時還具有抗癌的作用，如靈菌紅色素、紫色桿菌素、放線紫紅素等，因此開發(fā)微生物色素具有廣闊的市場前景和研究價值。

目前，有關(guān)文獻(xiàn)［8-12］對微生物產(chǎn)藍(lán)色素、紅色素、黃色素的報道較多，但對通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)綠色素的報道卻較少。因此，綠色素產(chǎn)生菌株的篩選及綠色素具有重要的研究價值。

本研究擬從不同土壤中進(jìn)行菌株篩選，通過分離純化，得到產(chǎn)綠色素菌株，然后進(jìn)行培養(yǎng)，分別采用形態(tài)學(xué)特性，生理生化特性以及分子生物學(xué)方法對其中產(chǎn)綠色素的菌株進(jìn)行鑒定，以期為生產(chǎn)綠色素的研究提供一定的指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

泥土來源土樣取自四川理工學(xué)院校園土壤（干燥的砂質(zhì)土壤）；rTaq酶、dNTPmixture、10×Pcrbuffer（free Mg2+）、MgCl2（25 mmol/L）、引物16F27/16R1492均購于TaKaRa公司；高氏一號培養(yǎng)基，察氏培養(yǎng)基，克氏培養(yǎng)基，甘油天門冬素培養(yǎng)基，燕麥營培養(yǎng)基，養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

D3024臺式高速微量（冷凍型）離心機大龍創(chuàng)新實驗儀器（北京）有限公司；BD-30生物顯微鏡深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司；GZ-250-HSH恒溫恒濕培養(yǎng)箱韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1培養(yǎng)基的配制選擇培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO40.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，K2Cr2O70.05 g，蒸餾水1 L，pH為7.2。碳源利用培養(yǎng)基［13］：各種碳源濃度均為1%。鑒定培養(yǎng)基：鏈霉菌標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基［13］。

1.2.2菌株的分離稱取10 g土樣（土樣采集后自然條件下放置1 d）加入到盛有90 mL（含1 g無水CaCO3）無菌蒸餾水的250 mL三角瓶中（放入適量玻璃珠），在150 r/min、30℃條件下振蕩30 min，靜置10 min后取1 mL上清液依次進(jìn)行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀釋，各取100 μL樣液涂布在平板上，同時做平行和空白對照，然后在28℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)5 d。挑取產(chǎn)綠色素的菌落（待其產(chǎn)生孢子后挑取孢子），接種到高氏一號平板上進(jìn)行劃線分離。將菌株多次純化后挑取單菌落接種到斜面上，4℃保藏。

1.2.3形態(tài)特征將篩選得到的菌株采用劃線的方式接種到高氏一號培養(yǎng)基上，28℃插片培養(yǎng)3、5、7、15 d后，通過光學(xué)顯微鏡分別觀察氣生菌絲及基內(nèi)菌絲發(fā)育情況。

1.2.4培養(yǎng)特性［13］將菌株分別接種到高氏一號、察氏、克氏、甘油天門冬素、燕麥、營養(yǎng)瓊脂、無機鹽瓊脂、酵母膏麥芽膏、土豆塊培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7、14、21、28 d后分別觀察并記錄氣生菌絲，基內(nèi)菌絲，可溶性色素以及生長情況。

1.2.5生理生化特性參照文獻(xiàn)［13-16］進(jìn)行生理生化特性鑒定，包括明膠液化、硝酸鹽還原、纖維素水解、產(chǎn)H2S、酪氨酸酶、淀粉水解實驗以及不同碳源的利用情況等。

1.2.6菌株DNA的提取、擴增及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

1.2.6.1鏈霉菌總DNA的提取菌株總DNA提取方法參照文獻(xiàn)［17］。

1.2.6.216S rDNA擴增擴增引物1（27 F）：AGAGTT TGATCCTGGCTCAG；引物2（1492R）：GGTTACCTTG TTACGACTT。PCR反應(yīng)體系（50 μL體系）：模板DNA 2μL，10×Pcrbuffer（free Mg2+），MgCl2（25 μmol/L）4 μL，引物（10 μmol/L）各0.5 μL，dNTP（2.5 μmol/L）4 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL（5 U/μL），加ddH2O 35 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，55℃復(fù)性1 min，72℃延伸1.5 min，35個循環(huán)，最后72℃溫育10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海杰李生物有限公司進(jìn)行克隆測序。將測得的基因序列去除掉雜峰的部分后拼接，在NCBI上進(jìn)行Blast比對，篩選相似度較高（＞97%）的16S rDNA序列，采用Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用ClustalX軟件進(jìn)行序列比對，MEGA5.05繪制發(fā)育樹。

2　結(jié)果及分析

2.1菌株分離結(jié)果

通過平板法從采集的75個土樣中篩選得到5株色素產(chǎn)生菌，分別命名為t8、t9、t10、t11、t12，結(jié)果見圖1。

圖1　色素產(chǎn)生菌株的固態(tài)培養(yǎng)特征Fig.1　The cultural characteristics of the bacteria produced pigment

2.2菌株的鑒定

2.2.1形態(tài)學(xué)特征將菌株t9通過劃線的方法接種到高氏一號培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5 d，觀察菌落形態(tài)后，再采用插片法培養(yǎng)7 d，通過顯微鏡觀察菌絲形態(tài)，結(jié)果見圖2。

圖2　鏈霉菌t9形態(tài)學(xué)特征Fig.2　The morphological of Streptomyces sp.t9

在高氏一號培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)5 d后，觀察到菌落較厚，有褶皺，孢子堆為灰白色。氣生菌絲初為白色，后深灰色，生孢子，基內(nèi)菌絲呈綠色。插片培養(yǎng)7 d后鏡檢觀察氣生菌絲直或彎曲，初為白色后為青色，末端有孢子絲，直或彎曲，孢子為圓形至橢圓形。通過形態(tài)學(xué)特征可以初步判定該菌株可能為鏈霉菌屬。

2.2.2菌株t9在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征將菌株t9接種到高氏一號、察氏、克氏、甘油天門冬素、燕麥、營養(yǎng)瓊脂等培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7、14、21、28 d后分別觀察并記錄氣生菌絲，基內(nèi)菌絲，可溶性色素以及生長情況，其培養(yǎng)特征見表1。

由表1可知，菌株t9在高氏一號培養(yǎng)基上，氣生菌絲為灰白色，基內(nèi)菌絲初為黃色后為綠色，產(chǎn)綠色可溶性色素。在甘油天門冬素、燕麥瓊脂、無機鹽瓊脂以及酵母膏麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基上均無可溶性色素產(chǎn)生。該菌株的培養(yǎng)特征結(jié)果與鼠灰鏈霉菌的培養(yǎng)特征一致，初步確定該菌株為鼠灰鏈霉菌屬。

2.2.3生理生化特性實驗將菌株t9接種到碳源利用培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d觀察生長情況，其結(jié)果見表2。

表1　菌株t9培養(yǎng)特征Table 1　The cultural characteristics of t9

表2　菌株t9碳源利用和生理生化特征Table 2　Utilization of carbon sources and their physiological and biochemical characteristics of the strain t9

由表2可知，該菌株能降解淀粉，能使硝酸鹽還原，能產(chǎn)生H2S，不能降解纖維素且不能使明膠液化。碳源利用結(jié)果表明，該菌株能很好的利用D-阿拉伯糖、葡萄糖、蔗糖、D-果糖、L-鼠李糖、甘油、D-海藻糖等大多數(shù)糖類，不能利用山梨醇、肌醇以及L-棉子糖等。通過菌株t9的碳源利用情況及生理生化實驗結(jié)果可確定該菌株為鼠灰鏈霉菌。

2.2.4菌株16S rDNA擴增以菌株t9的總DNA為模板，27F/1492R為引物進(jìn)行基因擴增并做陰性及陽性對照。結(jié)果見圖3。

圖3PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3　The electrophoresis of PCR products

由圖3可知，菌株t9的16S rDNA擴增后得到的DNA序列長度在1500 bp左右，陰性及陽性對照結(jié)果表明擴增正常。

2.2.5系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建菌株t9的16SrDNA測序后，結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast同源性比對，比對結(jié)果顯示與Streptomyces_murinus_NBRC_12799（T）相似度為99%，并在Genbank上登陸注冊，登陸號為KP231174。根據(jù)比對結(jié)果篩選出相似度較高（＞97%）的16SrDNA序列，采用Clustal軟件進(jìn)行序列比對，采用Neighbor-Joining（N-J）法利用MAGE5.05軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。

圖4　采用Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建的16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4　Phylogenetic tree drawn from neighbor-joining analysis based on the 16S rDNA sequence alignment

由圖4可知，菌株t9與Streptomyces_murinus_ NBRC_12799（T）處于同一聚類分支上，菌株t9屬于鼠灰鏈霉菌屬。

3　結(jié)論

從土壤中分離得到一株產(chǎn)綠色素的放線菌t9，通過對其形態(tài)學(xué)觀察、生理生化及分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為鼠灰鏈霉菌（Streptomyces_murinus），該菌株能夠產(chǎn)生兩種綠色素，胞外為黃綠色素，胞內(nèi)為色澤純正的綠色素。對于其產(chǎn)生的綠色素的性質(zhì)及安全性還有待進(jìn)一步研究。

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Isolation and identification of one strain of
stretomyces producing green pigment

ZUO Yong，F(xiàn)U Bin，YE Bi-xia，JIANG Peng，WANG Xiao-long，YANG Xiao-long
（College of Bioengineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，China）

Objective：In order to isolation and identification of strain of producing green pigment.Methods：The microbial strains of producing pigment were isolated from soil by method with plate coating，biochemical and morphological characteristics and 16S rDNA gene sequence analysation.Results：An actinomycete，named t9，was isolated from a soil sample in the College of Bioengineering，Sichuan University of Science and Engineering. It produced grayish-white aerial mycelium and green substrate mycelium on Gause’s synthetic agar.The results showed that the 16S rDNA gene sequence of the train t9 shared the identity 99%with that of Streptomyces_murinus_NBRC_12799（T），the phylogenetic tree was derived with NJ.Conclusion：The strain t9 was identified as Streptomyces_murinus from its morphological andcultural characteristics and the 16S rDNA gene sequence.

green pigments；streptomyces；screening

TS201.1

A

1002-0306（2015）20-0188-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.031

2014－12－19

左勇（1972-），男，碩士，教授，主要從事發(fā)酵工程方面的研究，E-mail：sgzuoyong@tom.com。

四川省教育廳成果轉(zhuǎn)化項目（11ZZ016）。