陳言峰

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東佛山528231)

遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)隸屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、愛(ài)德華氏菌屬(Edwardsiella)，是水產(chǎn)動(dòng)物重要的致病菌之一。目前，遲緩愛(ài)德華菌已引起多種魚(yú)類(lèi)的病害［1-5］，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雜交鱧是采用斑鱧(♀)和烏鱧(♂)雜交所得的子一代，具有生長(zhǎng)速度快、養(yǎng)殖周期短、病害少、成活率高、可攝食人工配合飼料等特點(diǎn)［6-7］，且肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富。近年來(lái)，雜交鱧的人工養(yǎng)殖發(fā)展迅猛，已成為我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖品種［8］。

血液是魚(yú)體內(nèi)的一種重要體液。當(dāng)魚(yú)體受到致病因子的影響時(shí)，其產(chǎn)生的病理變化會(huì)通過(guò)血液學(xué)變化反映出來(lái)，因此血液指標(biāo)可用于評(píng)價(jià)魚(yú)類(lèi)的健康狀況［9］。同時(shí)，血液指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化也反映了魚(yú)體病理學(xué)變化的過(guò)程。然而，目前對(duì)魚(yú)類(lèi)感染遲緩愛(ài)德華氏菌后血液指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化的研究很少。筆者通過(guò)對(duì)感染遲緩愛(ài)德華氏菌后雜交鱧血清指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析，旨在從血液方面探討遲緩愛(ài)德華氏菌的致病機(jī)理以及患病雜交鱧血液成份的變化規(guī)律，并為今后該疾病的診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 遲緩愛(ài)德華氏菌菌株ZS201364-1由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室于2013年從患病雜交鱧體內(nèi)分離并保存［10］。200尾健康的雜交鱧，體質(zhì)量為(497±23)g，購(gòu)于佛山市三水區(qū)某雜交鱧養(yǎng)殖場(chǎng)。將200尾雜交鱧分2組(感染組和對(duì)照組)暫養(yǎng)于養(yǎng)殖池，每組100尾。每天換水1次，投餌2次，水溫25～28℃，暫養(yǎng)2周無(wú)異常后開(kāi)始試驗(yàn)。

1.2 人工感染 將試驗(yàn)菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)24 d，用無(wú)菌生理鹽水洗脫，稀釋至濃度7.5×104cfu/ml備用。將感染組的魚(yú)按照0.5 ml/尾的劑量進(jìn)行腹腔注射，對(duì)照組的魚(yú)則按照相同的劑量注射無(wú)菌生理鹽水。

1.3 血清生化指標(biāo)的測(cè)定 在感染后的第1、2、3、4、5天的同一時(shí)間點(diǎn)分別從感染組和對(duì)照組各取10條魚(yú)，尾靜脈采血，每尾魚(yú)采血5 ml，分裝于2 ml離心管中，靜置2 h后離心(3000 r/min離心10 min)分離血清，在-80℃下保存至生化指標(biāo)測(cè)定。

使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中總蛋白、球蛋白、尿素氮、總膽紅素、血糖、尿酸、尿素氮、肌酐、鈣離子的濃度以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、淀粉酶的活力。酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶活力的測(cè)定則根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。酚氧化酶活力的測(cè)定參照文獻(xiàn)［11］中的方法進(jìn)行，將 200 μl(0.1 mol/L，pH 6.0)磷酸鹽緩沖液與10 μl的0.01 mol/L的L-dopa及10 μl血清于室溫下混勻，振蕩4次，間隔4 min讀取490 nm處的吸光值，酶活力為以試驗(yàn)條件下每分鐘OD490增加0.001定義為一個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與分析

2.1 感染遲緩愛(ài)德華菌后雜交鱧總蛋白、球蛋白、總膽紅素和血糖濃度的變化

2.1.1 總蛋白。從圖1A可以看出，人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后不同時(shí)間點(diǎn)的感染組雜交鱧血清總蛋白濃度的平均值逐漸升高，在第4天達(dá)到最高值，第5天降低，且第4天的感染組球蛋白濃度顯著高于第1、2、5天(P﹤0.05)。第4天，感染組總蛋白濃度顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.1.2 球蛋白。從圖1B可以看出，人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后不同時(shí)間點(diǎn)的感染組雜交鱧血清球蛋白濃度的平均值逐漸升高，在第4天達(dá)到最高值，第5天降低，且第4天的感染組球蛋白濃度顯著高于第1、2、3天(P＜0.05)。但是與對(duì)照組相比，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的感染組球蛋白濃度均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

2.1.3 總膽紅素。從圖1C可以看出，人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后感染組雜交鱧血清總膽紅素濃度的平均值在1～2 d升高，在第2天達(dá)到最高值，隨后逐漸降低至接近對(duì)照組的水平，且第2天感染組總膽紅素濃度顯著高于第1、4、5天(P＜0.05)。第2、3天，感染組總膽紅素濃度顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.1.4 血糖。從圖1D可以看出，人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后，第2、3天感染組血糖濃度顯著高于第1天(P＜0.05)，而第4、5天感染組血糖濃度又顯著高于第1、2、3天(P＜0.05)。同一時(shí)間點(diǎn)的感染組血糖濃度與對(duì)照組相比均存在顯著差異(P＜0.05)。

2.2 感染遲緩愛(ài)德華氏菌后雜交鱧血清尿酸、尿素氮、肌酐和鈣離子濃度的變化

2.2.1 尿酸。從圖2A可以看出，人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后，第1、2天感染組雜交鱧血清尿酸濃度基本持平，從第3天開(kāi)始升高，在第4天達(dá)到最高值，第5天有所降低，且第4天感染組尿酸濃度顯著高于第5天(P＜0.05)，而與第1～3天無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。第4天，感染組尿酸濃度顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.2.2 尿素氮。從圖2B可以看出，人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后，1～5 d盡管感染組雜交鱧血清尿素氮濃度的平均值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但不同時(shí)間點(diǎn)的感染組之間以及同一時(shí)間點(diǎn)的感染組與對(duì)照組之間均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

2.2.3 肌酐。從圖2C可以看出，人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后，感染組雜交鱧血清肌酐濃度的平均值在1～3 d升高，在第3天達(dá)到最高值，隨后降低至接近對(duì)照組的水平，且第3天感染組總膽紅素濃度顯著高于第1、2、4天(P＜0.05)。第3天，感染組肌酐濃度顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.2.4 鈣離子。從圖2D可以看出，人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后，感染組雜交鱧血清鈣離子濃度的平均值在1～3 d升高，在第3天達(dá)到最高值，隨后逐漸降低，且第3天感染組鈣離子濃度顯著高于第1、5天(P＜0.05)。第2、3天，感染組鈣離子濃度顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.3 感染遲緩愛(ài)德華氏菌后雜交鱧血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、淀粉酶和超氧化物歧化酶活力的變化

2.3.1 谷丙轉(zhuǎn)氨酶。從圖3A可以看出，人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后，第1、2天的感染組雜交鱧血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力基本持平，從第3天開(kāi)始升高，在第4天時(shí)達(dá)到最高值，第5天時(shí)降低至接近對(duì)照組的水平，且第4天感染組谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)。第4天，感染組谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.3.2 谷草轉(zhuǎn)氨酶。從圖3B可以看出，人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后，感染組雜交鱧血清谷草轉(zhuǎn)氨酶活力的平均值在1～3 d升高，在第3天達(dá)到最高值，隨后降低至接近對(duì)照組的水平，且第3天感染組谷草轉(zhuǎn)氨酶活力顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)。第2、3天，感染組谷草轉(zhuǎn)氨酶活力顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.3.3 淀粉酶。從圖3C可以看出，人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后，1～5 d內(nèi)感染組雜交鱧血清淀粉酶活力的平均值呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)。第5天，感染組淀粉酶活力顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)，且此時(shí)感染組淀粉酶活力顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.3.4 超氧化物歧化酶。從圖3D可以看出，人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后，1～5 d內(nèi)感染組雜交鱧血清超氧化物歧化酶活力的平均值呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。第5天，感染組超氧化物歧化酶活力顯著低于第2、3、4天(P＜0.05)，且此時(shí)感染組淀粉酶活力顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.4 感染遲緩愛(ài)德華氏菌后雜交鱧血清酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、溶菌酶、酚氧化酶活力的變化

2.4.1 酸性磷酸酶。從圖4A可以看出，人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后，感染組雜交鱧血清酸性磷酸酶活力在第2天降至最低值，隨后升高至接近對(duì)照組水平。第2天，感染組酸性磷酸酶活力顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)，且此時(shí)感染組酸性磷酸酶活力顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.4.2 堿性磷酸酶。從圖4B可以看出，人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后，感染組雜交鱧血清堿性磷酸酶活力的平均值在1～3 d逐漸升高，在第3天達(dá)到最高值，隨后逐漸降低，且第3天感染組堿性磷酸酶活力顯著高于第1、2、5天(P＜0.05)。第3天，感染組堿性磷酸酶活力顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

2.4.3 溶菌酶。從圖4C可以看出，人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后，不同時(shí)間點(diǎn)的感染組雜交鱧血清溶菌酶活力的平均值逐漸升高，在第4天達(dá)到最高值，第5天降低，且第3、4天的感染組溶菌酶活力顯著高于第1、2、5天(P＜0.05)。同一時(shí)間點(diǎn)的感染組溶菌酶活力與對(duì)照組相比，均存在顯著差異(P＜0.05)。

2.4.4 酚氧化酶。從圖4D可以看出，人工感染遲緩愛(ài)德華氏菌后，第1、2天的感染組雜交鱧血清酚氧化酶活力基本持平，在第3天升高，隨后逐漸降低。第3天感染組酚氧化酶活力顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)，且此時(shí)感染組酚氧化酶活力顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

3 討論

3.1 遲緩愛(ài)德華氏菌引發(fā)的魚(yú)類(lèi)組織病理學(xué) Miyazaki等［12］報(bào)道感染遲緩愛(ài)德華氏菌后鰻鱺的組織病理學(xué)可能會(huì)存在2種不同的類(lèi)型:①肝臟型，其病理特征是肝臟為主要病灶，腎臟僅發(fā)現(xiàn)輕微的增生浸潤(rùn)反應(yīng);②腎臟型，即腎臟為主要病灶。郭瓊林等［13］在研究鰻鱺感染遲緩愛(ài)德華氏菌后的組織病理學(xué)時(shí)，未發(fā)現(xiàn)單純的腎臟型，而是肝臟型和肝腎混合型。秦蕾等［14］則發(fā)現(xiàn)遲緩愛(ài)德華氏菌感染大菱鲆時(shí)，以腎臟病理變化最為明顯，除此以外肝臟、脾臟、腸和鰓等器官組織也發(fā)生不同程度的病變。上述結(jié)果可能是由于不同菌株的毒力、感染方式和魚(yú)的品種不同所導(dǎo)致。

3.2 由魚(yú)類(lèi)器官組織病變引發(fā)血清生化指標(biāo)的異常 魚(yú)類(lèi)的肝臟是合成蛋白質(zhì)的重要場(chǎng)所，一旦肝臟受損則蛋白質(zhì)產(chǎn)量將會(huì)下降［15］，但該研究中發(fā)現(xiàn)感染組總蛋白濃度有升高的趨勢(shì)，這與陳寅兒等［16］的研究結(jié)果一致，其病理變化的機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。另外，盡管感染組的球蛋白濃度在前4 d有逐漸升高的趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比并無(wú)顯著性差異，這與徐曉津等［17］的研究結(jié)果不一致。據(jù)此推測(cè)，可能是由于患病后魚(yú)體嚴(yán)重脫水、血液濃縮所致［18］。這表明雜交鱧感染遲緩愛(ài)德華氏菌后對(duì)其球蛋白影響較小。

該研究中感染組雜交鱧的血糖水平顯著降低，據(jù)此推測(cè)遲緩愛(ài)德華氏菌對(duì)雜交鱧的肝造成了明顯的損害，肝功能下降可導(dǎo)致其糖原分解能力降低，從而引起血糖水平下降。膽紅素大部分來(lái)自衰老紅細(xì)胞裂解而釋放出的血紅蛋白，當(dāng)肝細(xì)胞有異常時(shí)會(huì)引起高膽紅素血癥［19］。該研究中感染后第2、3天總膽紅素濃度顯著高于對(duì)照組，也從側(cè)面反映了雜交鱧肝臟的病變。

谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶是重要的細(xì)胞內(nèi)酶，主要分布于機(jī)體的肝臟，是肝臟功能的重要指標(biāo)，在正常情況下這些酶在血清中活性低且相對(duì)恒定，但當(dāng)肝臟發(fā)生損傷時(shí)，血清內(nèi)這2種酶的活性將升高［20］。該研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。該研究還發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶活力在感染后第3天也呈現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，這與張永嘉等［15］報(bào)道的患有網(wǎng)箱養(yǎng)殖綜合癥的羅非魚(yú)和陳寅兒等［16］報(bào)道的患溶藻弧菌病的鱸魚(yú)血液中堿性磷酸酶活力升高一致。據(jù)此推測(cè)，可能是臟細(xì)胞受損后其胞膜的通透性發(fā)生變化導(dǎo)致堿性磷酸酶漏出，從而引起血清中該酶的濃度升高。

高尿酸癥是一種代謝性疾病，是由于嘌呤代謝紊亂產(chǎn)生過(guò)多尿酸或尿酸排泄減少，并在體內(nèi)蓄積所致。推測(cè)細(xì)菌侵入腎臟后引起損傷，導(dǎo)致腎功能紊亂。血液中尿素氮的水平反映了肝臟和腎臟的功能［21］。尿素主要是在肝臟內(nèi)合成，由腎臟排泄。血液尿素氮可以比較準(zhǔn)確反映動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝情況，蛋白質(zhì)代謝良好時(shí)，血液尿素氮濃度較低［22］。感染組尿素氮與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，表明遲緩愛(ài)德華氏菌感染對(duì)雜交鱧血清的尿素氮水平影響不大。

關(guān)于魚(yú)類(lèi)感染病原菌后其血清淀粉酶活力的變化，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。于美芝等［23］曾報(bào)道十二指腸憩室、腸梗阻、潰瘍引起血液淀粉酶活力升高的病例。據(jù)此推測(cè)，可能是遲緩愛(ài)德華氏菌感染后對(duì)腸產(chǎn)生了一定的損傷，導(dǎo)致腸功能紊亂，從而引起淀粉酶活力升高。

Ozaki［18］認(rèn)為肌酐是肌酸的代謝產(chǎn)物，若肌酐在血清中含量明顯增加，則表明肌肉組織受損嚴(yán)重。該研究中第3天感染組肌酐濃度顯著高于對(duì)照組，推測(cè)魚(yú)體的肌肉組織發(fā)生了代謝障礙，產(chǎn)生病變。

鈣的主要生理功能之一是激活各類(lèi)酶的活性。感染組鈣離子濃度在第2、3天高于對(duì)照組，這與徐曉津等［17］的研究結(jié)果具有一定的一致性。據(jù)此推測(cè)，可能是由病原菌感染引起魚(yú)體免疫反應(yīng)增加，需要激活更多有關(guān)免酶活性造成的。

超氧化物歧化酶是魚(yú)體清除體內(nèi)自由基的主要酶類(lèi)，也是機(jī)體防御過(guò)氧化損傷系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一［24］。當(dāng)感染遲緩愛(ài)德華氏菌后，在病原菌的誘導(dǎo)下產(chǎn)生了部分自由基，超氧化物歧化酶活力伴隨著自由基的增多也隨之升高，以清除過(guò)量的自由基，因此在感染后出現(xiàn)了該酶的活力略升高的現(xiàn)象，而雜交鱧在清除病原菌過(guò)程中又會(huì)產(chǎn)生部分自由基，當(dāng)清除自由基對(duì)酶的消耗超過(guò)了雜交鱧的生產(chǎn)能力時(shí)，酶活力將會(huì)下降。

酸性磷酸酶是一類(lèi)在酸性條件下催化水解磷酸單酯的水解酶，是溶酶體的標(biāo)志酶，酸性磷酸酶與溶酶體生理功能的正常發(fā)揮密切相關(guān)［25］。溶酶體的基本功能是對(duì)生物大分子的強(qiáng)烈消化作用，以維持細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)［26］。某些宿主可以識(shí)別并吞噬入侵的病毒或細(xì)菌，在溶酶體作用下將其殺死并進(jìn)一步降解。此時(shí)，包括酸性磷酸酶在內(nèi)的溶酶體中的各種水解酶活力和含量都會(huì)明顯改變［27］。該研究中感染組雜交鱧的酸性磷酸酶活力在第2天顯著低于對(duì)照組，據(jù)此推測(cè)血細(xì)胞釋放的酸性磷酸酶參與了病原菌的清除，導(dǎo)致其活力降低。

溶菌酶是魚(yú)類(lèi)體液免疫因子之一，它產(chǎn)生于嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并被分泌到血液及粘液中發(fā)揮溶菌效應(yīng)［28］。酚氧化酶是甲殼動(dòng)物防御系統(tǒng)的重要組成部分，在識(shí)別異物、促進(jìn)血細(xì)胞吞噬、產(chǎn)生殺滅和排除異物等免疫功能方面發(fā)揮重要的作用［29-30］。該研究中溶菌酶與酚氧化酶活力的變化也證實(shí)了這一點(diǎn)。

3.3 遲緩愛(ài)德華氏菌感染后雜交鱧血清指標(biāo)的總體變化 魚(yú)類(lèi)感染病原菌后血清指標(biāo)的變化，可能與不同菌株的毒力、注射的菌液濃度、不同魚(yú)的品種對(duì)該菌的抵抗能力、同種魚(yú)不同個(gè)體的差異、養(yǎng)殖水體的主要理化因子如水溫等有關(guān)。在該研究的試驗(yàn)條件下，遲緩愛(ài)德華氏菌進(jìn)入雜交鱧體內(nèi)后，對(duì)其器官組織產(chǎn)生一定的損傷，此時(shí)血清指標(biāo)發(fā)生異常的變化，然而伴隨著魚(yú)體不斷分泌抗菌物質(zhì)，逐漸消除體內(nèi)的病原菌，最終血清指標(biāo)又恢復(fù)至對(duì)照組水平。

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