劉東旭，時(shí) 坤，李健明，曾范利，劉 菲，杜 銳

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

5株水貂阿留申病毒的分離與鑒定

劉東旭，時(shí) 坤，李健明，曾范利，劉 菲，杜 銳

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

為給水貂阿留申病疫苗的研制奠定基礎(chǔ)，對(duì)疑似感染阿留申病死亡的水貂內(nèi)臟處理后，接種貓腎傳代細(xì)胞（CRFK）分離病毒，并對(duì)分離的毒株進(jìn)行PCR鑒定及動(dòng)物回歸試驗(yàn)。與此同時(shí)，首次應(yīng)用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（IPMA）對(duì)所分離的水貂阿留申病毒進(jìn)行TCID50的測(cè)定。結(jié)果成功分離并鑒定出5株水貂阿留申病毒株，分別命名為ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-ZJ3、ADV-QD2、ADV-QD3，各分離株的TCID50分別為105.7TCID50/ml、105.0TCID50/ml、104.6TCID50/mL、105.2TCID50/mL、104.1TCID50/mL。動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)顯示，所分離的病毒對(duì)水貂具有致病性，為水貂阿留申病毒強(qiáng)毒株。

水貂阿留申病毒；分離；鑒定；免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)

水貂阿留申病又稱漿細(xì)胞增多癥，是由阿留申病毒引起的水貂自身免疫系統(tǒng)紊亂性疾病。自1946年首次檢測(cè)到該病以來，世界各地水貂養(yǎng)殖場(chǎng)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)該病，并給水貂養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失［1］。由于該病毒的致病機(jī)理比較特殊（形成抗原抗體復(fù)合物），迄今為止尚未研制出安全有效的預(yù)防制劑。因此水貂阿留申病疫苗的研制，一直是動(dòng)物醫(yī)學(xué)界很棘手的問題。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)疑似感染阿留申病毒致死的水貂內(nèi)臟進(jìn)行研磨，通過貓腎傳代細(xì)胞系（CRFK） 對(duì)病毒分離培養(yǎng)，并通過PCR和動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)對(duì)所分離出的病毒進(jìn)行鑒定，以便為深入研究水貂阿留申病毒奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌種、質(zhì)粒和細(xì)胞。PCR克隆載體pMD18-T與感受態(tài)細(xì)胞JM109，購(gòu)自TaKaRa公司。貓腎傳代細(xì)胞（CRFK），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。水貂阿留申病陰性水貂，購(gòu)自黑龍江帽兒山水貂養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2主要試劑。UNIQ-10柱式病毒基因組抽提試劑盒，購(gòu)于上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；蛋白酶K、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000、Ex Taq酶、dNTP，購(gòu)于大連寶生物工程公司；DNA凝膠回收試劑盒、溴化乙啶（EB）、瓊脂糖、瓊脂粉，購(gòu)于維特潔公司；MEM液體培養(yǎng)基、胎牛血清，購(gòu)于Hyclone公司。

1.2方法

1.2.1病料的采集及處理。2012年11月，從黑龍江、吉林、遼寧和山東等地的數(shù)十家水貂養(yǎng)殖場(chǎng)，采集疑似感染阿留申病死亡的水貂內(nèi)臟372份。對(duì)采集的內(nèi)臟，加入MEM液體培養(yǎng)基后研磨和離心，收集上清。經(jīng)0. 22 μm的濾膜過濾后，-40℃保存，用于病毒細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2.2病毒分離及TCID50的測(cè)定。按常規(guī)細(xì)胞傳代方法，對(duì)所有采集的病料進(jìn)行病毒分離［2］。取1 mL處理后的病料上清，接種長(zhǎng)滿單層的CRFK細(xì)胞，吸附2～6 h后，再加入9 mL的維持液，在31.7 ℃、5% CO2的條件下，培養(yǎng)5～6天，反復(fù)凍融3次，收獲培養(yǎng)物重新接種細(xì)胞，進(jìn)行病毒盲傳。三代后，-70℃低溫保存。應(yīng)用免疫過氧化物酶實(shí)驗(yàn)對(duì)所分離的病毒進(jìn)行鑒定和TCID50的測(cè)定。CRFK細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，消化并接種于96孔板中，與此同時(shí)，將分離的病毒從10-1開始做10倍連續(xù)稀釋，接種于96孔板中。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，棄去培養(yǎng)液，用PBS（PH7.2，100 μL/孔）洗滌一次后，用無(wú)水乙醇（含3%雙氧水）4℃固定45 min。再用PBS洗滌三次后，每孔加入50 μL水貂阿留申病陽(yáng)性血清（1:100倍稀釋），37℃孵育1 h。棄去板中液體，三次洗滌后，每孔加入50 μL HPR標(biāo)記的兔抗IgG（Sangon，1：4 000倍稀釋），37 ℃孵育1 h。洗滌后，每孔加入新鮮配置的DAB液200 μL，在避光處顯色5 min。棄去上清，用蒸餾水洗滌后，每孔加入Harris-蘇木素液200 μL復(fù)染2 min。純水洗滌5 min后，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.3病毒電鏡觀察。將CRFK細(xì)胞第9代細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后，3 000 r/min 離心20 min，取上清液，經(jīng)2%磷鎢酸負(fù)染后，進(jìn)行電鏡觀察。

1.2.4病毒PCR鑒定及序列分析。應(yīng)用UNIQ-10柱式病毒基因組抽提試劑盒，按照說明書提取病毒DNA。根據(jù)Qie等［3］1996年設(shè)計(jì)的一對(duì)ADV特異性引物對(duì)所分離的毒株進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增693 bp的目的片段，引物序列如下：上游P1：5'-CTTGTCACGCTACTAGAATGGT 3'，下游P2：5'-AGCTTAAGGTTAGTTTACATGGTTTACT 3'。反應(yīng)體系為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃變性0.5 min，50 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸l min，40個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后72 ℃繼續(xù)延伸7 min，最后置4 ℃保存。PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體連接并轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選，選取陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定及測(cè)序。

1.2.5動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)。將18只120日齡非免疫健康水貂（經(jīng)多次對(duì)流免疫電泳檢測(cè)為陰性）隨機(jī)分成6組，每組3只，第1～5組水貂每只腹腔接種細(xì)胞培養(yǎng)分離的病毒液3 mL（104.0TCID50/mL），第6組每只腹腔接種3 mL生理鹽水，做為空白對(duì)照。接種后隔離飼養(yǎng)，每天觀察臨床癥狀，檢查其體溫、呼吸、精神、食欲與糞尿等情況，連續(xù)觀察60天。

2　結(jié)果

2.1病毒的TCID50的測(cè)定

將病貂內(nèi)臟研磨接種CRFK細(xì)胞后，應(yīng)用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。顯微鏡下觀察可見，接種病毒的細(xì)胞特定部位被染成棕色或棕黃色，細(xì)胞邊界清楚、結(jié)構(gòu)清晰（圖1a）。而陰性對(duì)照染色淡且無(wú)規(guī)律（不是在細(xì)胞的特定位置或存在于細(xì)胞間隙，見圖1b）。本實(shí)驗(yàn)選取可傳至第9代的5株分離病毒，測(cè)得細(xì)胞培養(yǎng)物的病毒含量分別為：105.7TCID50/mL、105.0TCID50/mL、104.6TCID50/ mL、105.2TCID50/mL、104.1TCID50/mL，并分別命名為ADV-DL124、ADV-DL125、ADV-ZJ3、ADVQD2、ADV-QD3。

圖1a 接種病毒后的細(xì)胞染色結(jié)果

圖1b 正常細(xì)胞染色結(jié)果

2.2病毒電鏡觀察結(jié)果

對(duì)分離的病毒進(jìn)行電鏡觀察，可見病毒呈倒六邊形、無(wú)囊膜，大小在20～26 nm的病毒樣粒子（圖2）。

圖2　 ADV-DA125分離病毒電鏡觀察結(jié)果

2.3病毒的PCR鑒定及序列分析

以提取的病毒DNA為模板，根據(jù)GenBank上ADV-U株基因序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到693 bp片段（圖3），與預(yù)期結(jié)果相符，進(jìn)一步證實(shí)了所分離的病毒為ADV。

圖3　 PCR檢測(cè)結(jié)果

將PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，分析分離毒株與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照毒株ADV-G相應(yīng)片段的核酸同源性分別為98.8 %、94.7 %、92.8 %、94.1 %和93.5 %，與強(qiáng)毒參考株ADV-Utah的同源性分別為94.4 %、98.3 %、96.7 %、95.1 %和94.8 %（圖4）。由于該擴(kuò)增片段包含約40個(gè)核苷酸的超變區(qū)，此同源性足以說明擴(kuò)增產(chǎn)物具有良好的特異性，確定為ADV 的DNA特異性片段。

圖4　 5株分離株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)毒株相對(duì)應(yīng)基因片段的同源性分析

2.4水貂攻毒發(fā)病實(shí)驗(yàn)

將5株分離病毒，分別腹腔接種第1～5組水貂，3 mL/只，第6組腹腔接種等量的生理鹽水，連續(xù)隔離觀察60天。接種病毒組水貂均表現(xiàn)出消瘦、皮毛無(wú)光澤、拒食、狂飲，有些表現(xiàn)抽搐、痙攣、步態(tài)蹣跚、共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀（圖5-1）。其中ADV-DL124、ADV-DL125兩接種組發(fā)病較為明顯，表現(xiàn)為：前期暴躁，后精神沉郁，隨即出現(xiàn)抽搐、痙攣等癥狀。5個(gè)病毒接種組發(fā)病率均為100%。對(duì)照組均飲食正常，健康狀況良好（圖5-2）。對(duì)接種病毒的水貂解剖后觀察組織器官病變，可見腎、肝、脾、淋巴結(jié)腫大出血，胃腸道出血（圖5-3），對(duì)流免疫電泳檢測(cè)及PCR鑒定結(jié)果均為陽(yáng)性。對(duì)照組無(wú)明顯病變說明所分離的病毒對(duì)水貂具有致病性，為水貂阿留申病毒強(qiáng)毒株。

圖5　-1 水貂阿留申病發(fā)病水貂

圖5　-2 健康水貂

圖 5-3 水貂阿留申病發(fā)病水貂內(nèi)臟

3　討論

水貂阿留申病毒從強(qiáng)致病力毒株ADV-U到ADV-K、ADV-Pullman、ADV TR、ADV SL3等不同地區(qū)的分離毒株，在宿主的選擇和致病力等方面，均存在一定的差異（Gottschalck E等和Aasted B等）［4-5］。ADV-G是ADV-U適應(yīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)后失去致病力的實(shí)驗(yàn)室株，可以在細(xì)胞內(nèi)任意復(fù)制（Van Dawen S等）［6］，但對(duì)成年水貂無(wú)致病性。ADV-SL3是唯一的既易于在體外培養(yǎng)又具有致病力的毒株（Bloom ME等）［7］，其它強(qiáng)毒株的體外細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)制能力都較弱。目前細(xì)胞培養(yǎng)方法仍是水貂阿留申病毒分離、鑒定的最常用方法，但往往由于阿留申病毒在傳代細(xì)胞上不產(chǎn)生或產(chǎn)生不明顯的CPE，致使給病毒TCID50的測(cè)定帶來一定的困難。

IPMA 是通過將標(biāo)記酶的抗體（抗原）與抗原（抗體）相結(jié)合，形成酶標(biāo)抗體-抗原復(fù)合物。復(fù)合物上的酶，在遇到相應(yīng)的底物時(shí)催化底物分解，使供氫體被氧化而生成有色物質(zhì)（韋選民等）［8］。該方法具有特異強(qiáng)、敏感高、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，并在豬圓環(huán)病毒的檢測(cè)中已得到應(yīng)用（劉長(zhǎng)明等和郭全海等）［9-10］?；谪i圓環(huán)病毒與水貂阿留申病毒相似，同樣不產(chǎn)生CPE，因此本實(shí)驗(yàn)嘗試應(yīng)用IPMA對(duì)所分離的水貂阿留申病毒進(jìn)行檢測(cè)及TCID50的測(cè)定，為該病毒的生物學(xué)特性研究提供了可行的技術(shù)方法。

研究表明，水貂阿留申病細(xì)胞滅活疫苗具有一定的免疫保護(hù)效果，但由于ADV感染水貂后，水貂體內(nèi)不產(chǎn)生或只產(chǎn)生少量的中和抗體，而產(chǎn)生的多數(shù)抗體不僅不能中和病毒的毒力，反而通過介導(dǎo)抗體依賴性增強(qiáng)作用，有助于ADV對(duì)靶細(xì)胞的侵染。再有，病毒抗原與抗體形成的復(fù)合物（Immune Complex，IC）可導(dǎo)致IC沉積并引發(fā)腎小球腎炎和動(dòng)脈炎。正是由于水貂阿留申病這種復(fù)雜的致病機(jī)理和免疫機(jī)理，迄今為止尚未開發(fā)出有效防治水貂阿留申病的疫苗。本實(shí)驗(yàn)對(duì)疑似水貂阿留申病死亡病貂內(nèi)臟處理后接種CRFK細(xì)胞分離病毒，并對(duì)分離的毒株進(jìn)行PCR鑒定及動(dòng)物回歸試驗(yàn)，成功分離并鑒定出5株ADV毒株，為水貂阿留申病疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

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［2］ 梁冬瑩. ADV分離株全基因序列測(cè)定及VP2抗原表位區(qū)的表達(dá)與應(yīng)用［D］. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2007年.

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［7］ Bloom M E，Alexandersen S，Perryman S，et al. Nucleotide sequence and genomic organization of Aleutian mink disease parvovirus（ADV）：Sequence comparisons between a nonpathogenic and a pathogenic strain of ADV［J］. J Virol，1988，62（8）：2903-2915.

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［10］郭全海，劉秀玲. 免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2 型方法的建立［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012，6（11）：122-123.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Isolation and Identif cation of Five Strains of Aleutian DiseaseViruses in Mink

Liu Dongxu，Shi Kun，Li Jianming，Zeng Fanli，Liu Fei，Du Rui
（College of Chinese Medicine Material，Jilin Agricultural University，Changchun，Jilin 130118）

In order to lay foundation for the development of Aleutian disease vaccine，the CRFK cells were used to isolate the ADV with viscera samples collected from the dead minks which was suspected ADV infection sampled. The isolated strains were identified by PCR and regression experiments on animal. At the same time，Immunoperoxidase monolayer assay（IPMA）was used to detect the median tissue culture infective doses（TCID50）of isolated strains in the first time. Five strains of ADV（ADV-DL124，ADV-DL125，ADV-ZJ3，ADV-QD2，ADV-QD3）were isolated whose TCID50 were 105.7 TCID50/mL，105.0 TCID50/mL，104.6 TCID50/mL，105.2 TCID50/mL，and 104.1 TCID50/mL，respectively. These results of regression experiments on animal indicated that the isolated virus were the virulent strains of AD virus.

ADV；isolation；identification；IPMA

S851.3

A

1005-944X（2015）12-0073-05

杜 銳