于寒松，隋佳辰，代佳宇，宋戰(zhàn)昀*，鄭 言，楊 倩，王向輝，張 健，李敏思

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林 長(zhǎng)春 130062；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

核酸適配體技術(shù)在食品重金屬檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

于寒松1，隋佳辰1，代佳宇1，宋戰(zhàn)昀2，*，鄭 言1，楊 倩1，王向輝1，張 健1，李敏思3

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局，吉林 長(zhǎng)春 130062；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

近年來食品中重金屬超標(biāo)對(duì)人們健康構(gòu)成了威脅，所以對(duì)食品中重金屬檢測(cè)技術(shù)的開發(fā)成為了重要研究?jī)?nèi)容。雖然傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)對(duì)重金屬進(jìn)行了高選擇性和高靈敏度的檢測(cè)，但是仍需要一種簡(jiǎn)單、快速、有效、成本低廉的方法用于食品安全領(lǐng)域的快速檢測(cè)。核酸適配體為一段單鏈DNA或者RNA序列，是經(jīng)體外篩選技術(shù)篩選出的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的寡聚核苷酸片段。核酸適配體具有靶分子廣、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，因而被廣泛用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。本文綜述近年來核酸適配體技術(shù)對(duì)食品中Hg2+、As3+、Pb2+的檢測(cè)，并對(duì)核酸適體技術(shù)在食品重金屬檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

重金屬；核酸適配體；配體指數(shù)級(jí)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)；檢測(cè)

食品安全問題是21世紀(jì)重大的民生問題，它關(guān)系到人們的生活質(zhì)量與衛(wèi)生安全，關(guān)系到社會(huì)的和諧與穩(wěn)定。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，現(xiàn)代工業(yè)化進(jìn)程的加快，重金屬污染問題已經(jīng)對(duì)生態(tài)環(huán)境、農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，尤其對(duì)食品安全的影響日益加?。?］。重金屬是指比重＞5的金屬，約有45 種，如汞、銅、鉛、鎘、鐵、鋅、錳、鈣、鉻等。從食品安全方面考慮，目前最引人關(guān)注的是汞、鎘、鉛、鉻，以及類金屬砷等有顯著生物毒性的重金屬。Hg2+是一種可以在人體內(nèi)蓄積的高毒性的重金屬，并以天然態(tài)廣泛存在于自然界中，在魚類及貝類中常常以甲基汞的形式存在。Hg2+的危害主要是進(jìn)入人體后，在腦組織中逐漸積累，達(dá)到一定量時(shí)就會(huì)對(duì)腦組織造成損害，進(jìn)而侵害神經(jīng)系統(tǒng)，尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。其表現(xiàn)為說話不清、精神失常、運(yùn)動(dòng)失調(diào)，甲基汞還可侵害胎兒，使新生兒發(fā)生先天性疾病等。大型的汞中毒案例如“水俁病”事件嚴(yán)重影響人類的生命安全。因此，對(duì)Hg2+進(jìn)行特異性和高靈敏度檢測(cè)具有重要意義。砷，別名“砒霜”，是危害人們身體健康最嚴(yán)重的污染物之一，廣泛存在于自然界中。砷的攝入可能通過含砷的水直接攝入人體，或者通過含砷的農(nóng)作物或水產(chǎn)品等間接攝入人體。砷中毒分為急性和慢性兩種。急性砷中毒主要表現(xiàn)為胃腸炎癥狀，嚴(yán)重者可導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)麻痹而死亡，病人常有七竅流血的現(xiàn)象。慢性砷中毒癥狀除有一般的神經(jīng)衰弱癥候群外，還有皮膚色素沉著、過度角質(zhì)化、末梢神經(jīng)炎等。其中存在的4 種價(jià)態(tài)以As3+和As5+最為常見，水體中的無機(jī)砷尤其以As3+的毒性最高，是其他砷化合物毒性的60 倍。鉛是一種毒性較強(qiáng)的灰白色金屬，少量的鉛就會(huì)對(duì)人體造成非常大的傷害。鉛中毒是一種蓄積性中毒，具有持久性和高度積累性。鉛中毒后往往表現(xiàn)為智力低下、反應(yīng)遲鈍、貧血等慢性中毒癥狀。鉛對(duì)胎兒和幼兒生長(zhǎng)發(fā)育影響最大，這些嚴(yán)重的后果使得人們對(duì)鉛的檢測(cè)十分關(guān)注。

1　傳統(tǒng)重金屬檢測(cè)方法

目前，食品檢測(cè)中傳統(tǒng)的重金屬檢測(cè)方法主要有原子吸收光譜法、原子熒光光度法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜、流動(dòng)注射原子吸收和電感耦合等離子體質(zhì)譜等［2］。這些傳統(tǒng)的重金屬檢測(cè)方法雖然應(yīng)用比較成熟、靈敏度較高，但同時(shí)存在許多局限性，如：儀器價(jià)格昂貴、耗時(shí)長(zhǎng)、樣品處理復(fù)雜、攜帶不方便、無法連續(xù)監(jiān)測(cè)及現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定，需要專業(yè)人員進(jìn)行操作等，難以滿足簡(jiǎn)便、快速、實(shí)時(shí)檢測(cè)重金屬的實(shí)際需要［3］。表1列舉了幾種對(duì)重金屬離子Hg2+、As3+、Pb2+的常見傳統(tǒng)檢測(cè)方法。近些年雖發(fā)展了一些快速檢測(cè)重金屬的方法，如：酶分析法、試紙法、免疫分析法等快速檢測(cè)方法，但與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，大部分快速檢測(cè)方法只能對(duì)被檢物定性或半定量檢測(cè)，靈敏度和準(zhǔn)確性低于傳統(tǒng)檢測(cè)方法［4］。因此，尋求一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的重金屬離子檢測(cè)技術(shù)，仍然是人們不斷追求的目標(biāo)。

表1　傳統(tǒng)重金屬檢測(cè)方法Table 1 Traditional detection methods for heavy metals

2　核酸適配體重金屬檢測(cè)方法

1990年，Ellington［17］和Tuerk［18］等用配體指數(shù)級(jí)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)分別篩選出能與T4 DNA聚合酶和有機(jī)染料特異性結(jié)合的隨機(jī)寡核苷酸，并由Ellington和Szostak命名為核酸適配體（aptamer）［19］，經(jīng)過20 年的研究，它已發(fā)展成為一類廣受關(guān)注的新型識(shí)別分子。由于核酸適配體的高親和性與高特異性，被喻為“化學(xué)抗體”。目前分子生物檢測(cè)技術(shù)通常采用抗原與抗體相互作用的機(jī)理模式，但是源于蛋白受體的性質(zhì)和蛋白受體的合成，在多組分檢測(cè)和非常復(fù)雜的樣品分析中限制了抗體檢測(cè)技術(shù)的廣泛應(yīng)用。與之相比，核酸適配體檢測(cè)方法不僅靈敏度高、檢測(cè)性強(qiáng)，而且可以對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)快速檢測(cè)，目前已經(jīng)成為分子生物學(xué)、臨床診斷、醫(yī)學(xué)研究、環(huán)境監(jiān)測(cè)、快速檢疫等許多領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)。因此，核酸適配體檢測(cè)技術(shù)成為快速檢測(cè)重金屬的一種新的手段。核酸適配體是一類新的具有高選擇性的功能識(shí)別分子，它是通過SELEX技術(shù)體外篩選出來的能特異結(jié)合特定靶分子的寡聚核苷酸片段，具有合成容易、靶分子廣、特異性高、親和力強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)成本低廉、耗時(shí)短、準(zhǔn)確性高、易于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，與食品傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比非常適用于食品安全的快速檢測(cè)，在食品安全檢測(cè)中有著良好的應(yīng)用前景。表2列舉了幾種對(duì)重金屬Hg2+、As3+、Pb2+利用核酸適配體技術(shù)檢測(cè)的方法。隨著近年來現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展與SELEX技術(shù)的不斷創(chuàng)新，核酸適配體已經(jīng)得到了較為廣泛的發(fā)展，且已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到各項(xiàng)研究領(lǐng)域中，并發(fā)揮著重要的作用。目前，研究者們已經(jīng)對(duì)重金屬Hg2+、As3+、Pb2+等篩選出相關(guān)適配體，并對(duì)此進(jìn)行了進(jìn)一步的研究檢驗(yàn)。本文主要針對(duì)食品安全分析中核酸適配體技術(shù)對(duì)重金屬離子Hg2+、As3+、Pb2+檢測(cè)方面的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對(duì)其在食品中重金屬檢測(cè)的研究前景進(jìn)行展望。

表2　核酸適配體重金屬檢測(cè)方法Table 2 Aptamers detection methods for heavy metals

續(xù)表2

3　核酸適配體技術(shù)在食品重金屬檢測(cè)中的應(yīng)用

核酸適配體具有諸多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)吸引了眾多領(lǐng)域的研究者。利用核酸適配體作為高選擇性識(shí)別元件，研究者們?cè)谑称钒踩I(lǐng)域已經(jīng)建立了許多檢測(cè)重金屬的方法。作為受體分子，由于核酸適配體針對(duì)分析物是均等合成的產(chǎn)生過程，使它們可以廣泛應(yīng)用于多樣化的目標(biāo)分析物陣列中。下面主要以Hg2+、As3+和Pb2+為例，針對(duì)核酸適配體技術(shù)在食品中重金屬檢測(cè)的最新應(yīng)用研究進(jìn)展做如下綜述。

3.1在Hg2+檢測(cè)中的應(yīng)用

隨著人們對(duì)Hg2+的高度重視和不斷研究，以及SELEX篩選技術(shù)的不斷發(fā)展。目前，已經(jīng)篩選出了與Hg2+具有高特異性、高親合性結(jié)合的核酸適配體，并展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景。Liu Chiwei等［19］根據(jù)富含胸腺嘧啶（T）的ssDNA可與Hg2+特異性結(jié)合形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)這一特點(diǎn)，構(gòu)建了Hg2+的傳感器。此傳感器基于一種DNA-AuNPs作探針，通過T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的改變形成DNA-Hg2+的復(fù)合物從而改變ssDNA的狀態(tài)，AuNPs發(fā)生聚集、顏色發(fā)生改變，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)Hg2+濃度為0.5～5.0 μmol/L時(shí)，對(duì)Hg2+的檢出限為250 nmol/L。與之相比，Li Di等［32］根據(jù)同樣的原理，并在此基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建的傳感器具有更高的靈敏度，對(duì)Hg2+的檢出限為1 nmol/L。Xue Xuejia等［33］報(bào)道了一種用ssDNA修飾AuNPs，利用比色法檢測(cè)Hg2+的傳感器。在室溫條件下將Hg2+加入到到含有寡核苷酸-AuNPs探針的水溶液中，其中寡核苷酸與多個(gè)胸腺嘧啶（T-T）錯(cuò)配導(dǎo)致AuNPs聚集，進(jìn)而根據(jù)顏色變化檢測(cè)Hg2+。Lee等［34］根據(jù)AuNPs的分散度容易受到環(huán)境的影響，進(jìn)而產(chǎn)生顏色轉(zhuǎn)變的原理，實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的檢測(cè)。當(dāng)溶液中存在ssDNA時(shí)，ssDNA會(huì)吸附在AuNPs表面阻止AuNPs的聚集。當(dāng)Hg2+存在時(shí)，Hg2+與DNA-AuNPs探針形成T-Hg2+-T的配位絡(luò)合物，提高了雜交的DNA-AuNPs探針的解鏈溫度，引起了AuNPs的聚集，溶液由紅變藍(lán)。該方法具有很高的靈敏度和選擇性，可通過比色快速讀出。

Wang Hao等［20］基于Hg2+誘導(dǎo)富含胸腺嘧啶且用FAM標(biāo)記的ssDNA的構(gòu)象變化，ssDNA和dsDNA與AuNPs之間的靜電親和力的差異，再結(jié)合AuNPs建立的熒光機(jī)制Hg2+傳感器。其基本原理是：當(dāng)Hg2+不存在時(shí)，ssDNA通過靜電力吸附AuNPs表面，阻止其在高鹽濃度下的聚集。AuNPs對(duì)熒光染料有熒光淬滅作用，從而ssDNA中的熒光被淬滅。當(dāng)加入Hg2+時(shí)，Hg2+與ssDNA中的堿基（T）特異結(jié)合，從而使ssDNA變成dsDNA。因dsDNA與AuNPs結(jié)合力較弱，因而可以從AuNPs表面脫落下來，熒光得到恢復(fù)。該系統(tǒng)表現(xiàn)出的Hg2+動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍為9.6×10－8～6.4×10－6mol/L，此FAM-DNA-AuNPs傳感器對(duì)Hg2+檢出限為0.4 nmol/L。Ono等［21］根據(jù)“熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)彼此的距離小于一定范圍后，會(huì)發(fā)生熒光能量轉(zhuǎn)移，熒光物質(zhì)被淬滅”這一原理，建立了利用核酸適配體檢測(cè)Hg2+的熒光傳感器，其中把熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分別修飾到核酸適配體（富含胸腺嘧啶）的3'端和5'端。根據(jù)熒光強(qiáng)度和Hg2+濃度的變化實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg2+的檢測(cè)，檢測(cè)限到40 nmol/L。Jiang Zhiliang等［35］用ssDNA修飾10 nm的AuNPs，以獲得核酸適配體修飾納米金共振散射光譜探針（AuNPs-ssDNA），用于檢測(cè)Hg2+。在NaCl存在條件下，Hg2+與AuNPs-ssDNA相互作用T-Hg2+-T錯(cuò)配形成非常穩(wěn)定的雙鏈和釋放納米顆粒聚集到大納米金簇，引起共振散射強(qiáng)度在540 nm波長(zhǎng)處呈線性增強(qiáng)。根據(jù)以上原理，可以通過核酸適配體修飾納米金共振散射法實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的快速檢測(cè)，檢出限為0.7 nmol/L。吳繼魁等［22］利用胸腺嘧啶與Hg2+的高親合作用和電化學(xué)溶出技術(shù)相結(jié)合設(shè)計(jì)了一種具有高選擇性的Hg2+生物傳感器。將一段巰基（-SH）修飾的多胸腺嘧啶寡核苷酸（5'-SH-T15-3'）核酸序列（核酸適配體）通過Au-S鍵作用，組裝到金電極表面。然后用疏基乙醇封閉電極表面即得到多胸腺嘧啶寡核苷酸（polythymine oligonucleotide，PTO）/Au電極。利用電極上核酸適配體中的堿基T與Hg2+特異性結(jié)合，從而把Hg2+富集到電極表面，經(jīng)緩沖液洗滌后，在10 mmol/L氯酸鈉（pH 7.2，1 mol/L NaClO4）溶液中將Hg2+電化學(xué)還原成Hg，然后利用陽極溶出伏安掃描測(cè)定汞的氧化電流信號(hào)。以此實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+的檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)60 pmol/L。Liu Chiwei等［36］利用凝血酶結(jié)合核酸適配體作探針，供體的5'和3'末端分別用熒光素和淬滅劑做標(biāo)記。核酸適配體與鉛和汞分別形成G-四分體結(jié)構(gòu)和發(fā)卡結(jié)構(gòu)，通過熒光團(tuán)和淬滅劑之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致該熒光強(qiáng)度減小，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)鉛和汞的同時(shí)測(cè)定。據(jù)了解，這是一個(gè)以單一的核酸適配體為基礎(chǔ)的傳感器，可以同時(shí)檢測(cè)Hg2+和Pb2+的第一實(shí)例。Chung等［37］研發(fā)了一種表面增強(qiáng)拉曼光譜微滴傳感器。此方法基于微流體傳感器，利用表面增強(qiáng)拉曼散射光譜迅速且高靈敏度微量分析溶液中Hg2+。核酸適配體-改性的納米顆粒作為高功能的感測(cè)探針，Hg2+和核酸適配體-改性的納米粒子之間所有反應(yīng)的過程是在一專門設(shè)計(jì)的微滴信道中進(jìn)行。小水滴，包括樣品試劑被油相彼此分離并連續(xù)地沿著通道流入。此兩相液-液分割流動(dòng)系統(tǒng)由于包封液滴內(nèi)的局部試劑防止聚合膠體吸附到通道壁上，結(jié)果減少了停留時(shí)間分布。通過此方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg2+的檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)10 pmol/L。

3.2在As3+檢測(cè)中的應(yīng)用

近年來核酸適配體在分析化學(xué)領(lǐng)域中備受研究者們的關(guān)注，并被認(rèn)為是一種重要的重金屬檢測(cè)工具，目前已經(jīng)針對(duì)As3+篩選出了相應(yīng)的核酸適配體，但以核酸適配體技術(shù)檢測(cè)砷的文獻(xiàn)是罕見的。Kim等［23］篩選出一種核酸適配體，通過構(gòu)型轉(zhuǎn)換形成特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)用于綁定地下水中As3+和As5+，結(jié)合常數(shù)分別可達(dá)7 nmol/L和5 nmol/L。其中核酸適配體是由砷核酸適配體親和柱（把砷固定在親和性-凝膠樹脂上創(chuàng)建的親和柱）在體外篩選得到的。核酸適配體ARS-1到ARS-8通過表面等離子共振的定量分析，揭示了ARS-3核酸適配體具有最高的親和力，ARS-3與質(zhì)量濃度范圍為28.1～739.2 mg/L的As3+溶液溫育5 min之后可完全除去溶液中的As3+。Wu Yuangen等［24］通過核酸適配體和AuNPs作用，利用比色法實(shí)現(xiàn)對(duì)As3+的快速檢測(cè)。As3+與砷核酸適配體相互作用特異性結(jié)合，形成一個(gè)As3+-核酸適配體復(fù)合物，而帶有正電荷的聚二烯基丙二甲基氯化銨會(huì)導(dǎo)致帶負(fù)電荷的AuNPs的聚集，并導(dǎo)致明顯的顏色變化，這使得比色法檢測(cè)As3+具有較高的選擇性，檢測(cè)限為70 nmol/L。

2013年王法澤［25］基于氯化血紅素催化3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB），根據(jù)顯色比色法的原理檢測(cè)As3+。當(dāng)溶液中不含As3+時(shí)，核酸適配體通過堆積作用可以抑制氯化血紅素的催化活性，對(duì)底物TMB的催化能力減弱，溶液呈現(xiàn)藍(lán)色。當(dāng)溶液中含有As3+時(shí)，As3+可以與ssDNA特異性結(jié)合形成復(fù)合結(jié)構(gòu)，這種復(fù)合結(jié)構(gòu)會(huì)阻礙氯化血紅素與ssDNA的堆積作用，因此氯化血紅素催化活性得到恢復(fù)并逐漸增強(qiáng)，進(jìn)一步氧化TMB，溶液由藍(lán)色逐漸變?yōu)辄S色，以此建立了核酸適配體比色法檢測(cè)As3+。Wu Yuangen等［26-27］基于一種共振瑞利散射（resonance Rayleigh scattering，RRS）光譜法建立的一個(gè)核酸適配體生物傳感器，用于As3+的檢測(cè)。在As3+檢測(cè)之前，首先在結(jié)晶紫溶液中通過控制砷結(jié)合核酸適配體濃度，出現(xiàn)具有不同大小的納米顆粒，經(jīng)光子相關(guān)光譜法和掃描探針顯微鏡證實(shí)此結(jié)果。As3+的引入確實(shí)改變納米粒子的大小，且引起了310 nm波長(zhǎng)處的散射強(qiáng)度很大的變化。因此利用適當(dāng)大小的納米顆粒作為目標(biāo)識(shí)別元件，結(jié)合RRS光譜測(cè)定分析，一種有效的As3+檢測(cè)生物傳感器被開發(fā)出來。此生物傳感器的動(dòng)態(tài)范圍為0.1～200 μg/L，檢測(cè)限低至2.7 nmol/L。

3.3在Pb2+檢測(cè)中的應(yīng)用

近年來，基于核酸適配體技術(shù)的迅速發(fā)展，核酸適配體技術(shù)對(duì)Pb2+檢測(cè)方法的研究也引起人們極大的興趣。目前，核酸適配體已經(jīng)同許多技術(shù)和方法相結(jié)合以擴(kuò)展分析范圍或提高分析效果，如：比色法、熒光法、電化學(xué)法、共振散射光譜等方法。Liu Juewen等［28］基于脫氧核酶指導(dǎo)AuNPs的聚集設(shè)計(jì)了一種高靈敏度和高選擇性比色法檢測(cè)Pb2+的生物傳感器，這個(gè)概念可以成熟的應(yīng)用到設(shè)計(jì)核酸酶/納米傳感器。其中，關(guān)鍵的步驟是體外篩選，可以顯著擴(kuò)大納米材料的應(yīng)用范圍。此法比色法生物傳感器簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，靈敏度高達(dá)0.1 μmol/L。Wang Zidong等［38］利用DNA核酶調(diào)節(jié)未經(jīng)修飾AuNPs的聚集度，采用dsDNA對(duì)某些二價(jià)金屬離子具有催化活性，從而設(shè)計(jì)了比色法檢測(cè)Pb2+的生物傳感器，此類傳感器主要由AuNPs和核酸適配體組成。當(dāng)體系中不存在Pb2+時(shí)，隨著高濃度NaCl的加入使AuNPs溶液顏色由紅變藍(lán)。當(dāng)體系中引入Pb2+時(shí)，使已聚集的AuNPs重新分散，顏色由藍(lán)變回紅，以此建立比色法實(shí)現(xiàn)對(duì)Pb2+的檢測(cè)。Wei Hui等［29］報(bào)道了一個(gè)用無標(biāo)記17E脫氧核酶?jìng)鞲衅鲗?duì)Pb2+檢測(cè)的方法，此方法簡(jiǎn)單且靈敏度高。實(shí)驗(yàn)中使用未修飾的AuNPs，展開的ssDNA可以吸附在檸檬酸鹽上從而保護(hù)AuNPs，而dsDNA不能。通過此方法，在Pb2+存在條件下，由脫氧核酶的底物裂解可以通過AuNPs的顏色變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Pb2+檢測(cè)。此方法可以在20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)Pb2+的檢測(cè)，檢測(cè)限為500 nmol/L。

凌紹明等［30］利用核酸適配體修飾納米金作探針，利用共振散射光譜法快速檢測(cè)痕量Pb2+。在pH 7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液中和30 mmol/L NaCl存在下，核酸適配體-AuNPs穩(wěn)定而不聚集，其散射信號(hào)較弱。Pb2+與該探針中的核酸適配體形成非常穩(wěn)定的G-四分體結(jié)構(gòu)，并釋放出AuNPs。在NaCl作用下，AuNPs聚集形成較大的微粒，在552 nm波長(zhǎng)處的共振散射峰增強(qiáng)。Pb2+濃度越高，AuNPs微粒聚集體越多，共振散射峰強(qiáng)度越大，據(jù)此建立了核酸適配體納米金共振散射光譜法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Pb2+的靈敏檢測(cè)，檢出限為0.03 nmol/L Pb2+。莫志宏等［31］首先根據(jù)巰基能與金形成Au-S鍵原理，利用納米探針和G-四聯(lián)體比色法簡(jiǎn)便快速檢測(cè)Pb2+。他們選用的寡核苷酸3'端含有4 個(gè)連續(xù)的鳥嘌呤，用于與Pb2+形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，同時(shí)在核酸的5'端修飾巰基，可以將核酸修飾在AuNPs表面，這樣既可以提高AuNPs性能，又增強(qiáng)其抗干擾能力。當(dāng)溶液中添加Pb2+之后，修飾在AuNPs探針上的G寡核苷酸就會(huì)與Pb2+結(jié)合，形成穩(wěn)定的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致AuNPs探針凝聚變色，使溶液從紅色變成藍(lán)紫色，繼而建立了利用比色法來檢測(cè)Pb2+。這種方法展現(xiàn)了良好的選擇性，獲得了3.4 nmol/L的檢測(cè)限。

4　結(jié) 語

在食品安全領(lǐng)域中，傳統(tǒng)重金屬檢測(cè)方法雖然展現(xiàn)出了靈敏度高、準(zhǔn)確性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，但其同時(shí)存在許多不足，主要有以下4 點(diǎn)：第一，前處理耗時(shí)費(fèi)力；第二，儀器設(shè)備較大、較笨重，不利于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)快速檢測(cè)；第三，操作較困難，需專業(yè)技術(shù)人員培訓(xùn)；第四，成本較高。核酸適配體作為一種特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好和靶分子廣的分子識(shí)別探針，廣泛備受研究者們的關(guān)注。與傳統(tǒng)重金屬檢測(cè)方法相比較，主要有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：第一，靶分子廣、無免疫原性；第二，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短；第三，檢測(cè)成本低廉；第四，體積小，易于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；第五，精確識(shí)別、易體外合成與修飾；第六，被喻為“第四代化學(xué)抗體”，特異性高和親和力強(qiáng)，可替代單克隆抗體等。由于核酸適配體的諸多優(yōu)勢(shì)，在各檢測(cè)領(lǐng)域具有很強(qiáng)的發(fā)展?jié)撡|(zhì)，同時(shí)非常適合于食品應(yīng)急事件中的快速檢測(cè)。目前，雖然篩選出核酸適配體的重金屬離子只局限于Hg2+、Pb2+、As3+等少數(shù)幾個(gè)，但已實(shí)現(xiàn)核酸適配體對(duì)其簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)。

核酸適配體技術(shù)在食品安全領(lǐng)域也面臨著一些問題與挑戰(zhàn)。例如：食品中有毒有害物質(zhì)繁多，除了重金屬以外還有許多有害因子，這會(huì)大大影響核酸適配體對(duì)重金屬檢測(cè)的簡(jiǎn)便性和靈敏性。如何簡(jiǎn)單化食品中的前處理問題，也是核酸適配體技術(shù)對(duì)食品中重金屬檢測(cè)所要面臨的重大難題。本文主要對(duì)核酸適配體技術(shù)在食品中重金屬檢測(cè)的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。從上述文獻(xiàn)的調(diào)研情況來看，雖然核酸適配體技術(shù)近幾年取得了矚目的成果，但對(duì)于目前來講，核酸適配體技術(shù)的發(fā)展還處于初級(jí)階段，還有許多有待于開發(fā)和研究的內(nèi)容。今后應(yīng)在以下兩點(diǎn)做進(jìn)一步的深入研究：第一，核酸適配體的篩選過程比較繁瑣，且重復(fù)性高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，如何簡(jiǎn)單、快速、高效篩選獲得需要的核酸適配體是我們研究的熱點(diǎn)，也是我們需要面臨的一項(xiàng)巨大挑戰(zhàn)。第二，多數(shù)研究的核酸適配體只是針對(duì)一個(gè)目標(biāo)靶進(jìn)行檢測(cè)，如何一次性對(duì)多個(gè)分析物進(jìn)行同時(shí)高效、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)也是我們未來需要面對(duì)的一個(gè)重大挑戰(zhàn)?？傊谑称钒踩I(lǐng)域中核酸適配體技術(shù)對(duì)于重金屬的檢測(cè)還有待于進(jìn)一步的研究與深化。隨著科技的不斷發(fā)展與完善，必將有更多的技術(shù)和方法與核酸適配體相結(jié)合，核酸適配體技術(shù)也會(huì)越來越完善。相信不久的將來，核酸適配體必將在食品檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。

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Advances in the Application of Aptamers to Detect Heavy Metals in Foods

YU Hansong1， SUI Jiachen1， DAI Jiayu1， SONG Zhanyun2，*， ZHENG Yan1， YANG Qian1， WANG Xianghui1， ZHANG Jian1， LI Minsi3
（1. College of Food Science and Engineering， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China；2. Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Changchun 130062， China；3. College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China）

In recent years， excessive heavy metals in foods pose a threat to human health， so the development of techniques to detect heavy metals in foods has become an important research task. Although traditional techniques for heavy metal detection have high selectivity and high sensitivity， a simple， fast， effective and inexpensive method for rapid detection of food safety is still highly desired. Aptamers （aptamer） is a piece of single-stranded DNA or RNA sequence or oligonucleotide fragments obtained by in vitro selection （SELEX， systematic evolution of ligands by exponential enrichment）， which is specifically bound to protein or smaller molecules. As a target molecule with high sensitivity， high specificity and good stability， in recent years， it has been widely used in the fi eld of food safety detection. This article reviews the progress made in recent years in applying aptamer technology for the detection of heavy metals such as Hg2+， As3+and Pb2+in foods and future prospects are discussed.

heavy metal； aptamer； systematic evolution of ligands by exponential enrichment； detection

TS207.3

A

1002-6630（2015）15-0228-06

10.7506/spkx1002-6630-201515042

2014-10-15

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31001065）

于寒松（1979—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槎怪破芳庸?。E-mail：yuhansong@jluhp.edu.cn

宋戰(zhàn)昀（1976—），男，獸醫(yī)師，博士，研究方向?yàn)楹怂徇m配體。E-mail：zhanyun-song@163.com