尹學(xué)哲，王玉嬌，尹基峰，金梅花，金 明，全吉淑，*

（1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

草蓯蓉提取物對HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

尹學(xué)哲1，王玉嬌2，尹基峰1，金梅花2，金 明2，全吉淑2，*

（1.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 延吉 133000；2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

目的：研究草蓯蓉乙醇提取物（Boschniakia rossica ethanol extract，BREE）對H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。方法：用H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，采用噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT）比色法檢測BREE對HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用；比色法測定培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）的釋放率，以及細(xì)胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）及丙二醛（malondialdelyde，MDA）水平；蛋白印跡法測定細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）總蛋白及其磷酸化形式的表達(dá)水平以及核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的核內(nèi)轉(zhuǎn)移。結(jié)果：BREE單獨(dú)處理時，在所測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對HepG2細(xì)胞增殖無顯著影響。與模型組相比，BREE能顯著提高氧化損傷細(xì)胞的存活率；降低氧化損傷細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、ALT和AST的釋放；降低細(xì)胞MDA水平，增高細(xì)胞SOD活性和GSH含量。氧化損傷發(fā)生的不同時期，ERK、JNK、p38 MAPK和NF-κB蛋白均有激活，而BREE在氧化損傷發(fā)生1 h時減少ERK激活和NF-κB核轉(zhuǎn)移，氧化損傷發(fā)生12 h時減少JNK蛋白激活。結(jié)論：BREE對H2O2所致HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用，此作用可能與其抑制ERK、JNK的活化和NF-κB的核內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

草蓯蓉；H2O2；氧化損傷；HepG2細(xì)胞

細(xì)胞內(nèi)氧化與抗氧化之間的平衡對細(xì)胞生存至關(guān)重要，氧化應(yīng)激水平的提高能夠損傷細(xì)胞甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡［1］。因此，自由基與多種疾病的關(guān)系已越來越引起人們的重視，自由基生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展使得探尋高效低毒的天然抗氧化劑成為生物化學(xué)和醫(yī)藥學(xué)科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［2］。草蓯蓉（Boschniakia rossica Fedtsch. et Flerov）又名不老草，為列當(dāng)科草蓯蓉屬多年生寄生性草本植物，是國家二類保護(hù)植物。草蓯蓉性味甘、酸、濕，全草入藥。具有補(bǔ)腎壯陽、滋補(bǔ)強(qiáng)身、潤腸止血、延年益壽的功效；用于治療腎虛陽痿、腰膝冷痛、膀胱炎、功能性子宮出血、腎炎以及腎臟和膀胱出血等疾?。?］。研究發(fā)現(xiàn)，草蓯蓉具有抗脂質(zhì)過氧化、增強(qiáng)免疫、抗炎及抗腫瘤等作用［3-5］，這與草蓯蓉醛、草蓯蓉酸、草蓯蓉堿、草蓯蓉內(nèi)酯、草蓯蓉納拉苷和多糖等多種活性成分有關(guān)［3-6］。本實(shí)驗(yàn)利用H2O2誘導(dǎo)人HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，檢測草蓯蓉提取物（Boschniakia rossica ethanol extract，BREE）對HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用，以期為草蓯蓉的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

草蓯蓉采自吉林省長白山，經(jīng)延邊大學(xué)藥學(xué)院劉勇鎮(zhèn)教授鑒定為草蓯蓉（Boschniakia rossica Fedtsch. et Flerov）。

人肝癌細(xì)胞HepG2 南京凱基生物有限公司；DMEM培養(yǎng)基、小牛血清 美國Gibco公司；噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT） 美國Sigma公司；小鼠細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）多克隆抗體、兔p-ERK多克隆抗體、兔c-Jun N末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）多克隆抗體、兔p-JNK多克隆抗體、兔p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）多克隆抗體、兔p-p38 MAPK多克隆抗體、兔核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）多克隆抗體 美國Abcam公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdelyde，MDA）及蛋白質(zhì)試劑盒 南京建成科技有限公司。

3-30K型離心機(jī) 美國Sigma公司；D 1320型超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；DYY-12型電泳儀、DYCP-31D型電泳槽、DYCZ-24DN型電泳儀北京六一儀器廠；Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽 美國Bio-Rad公司；UVP凝膠成像分析儀 美國UVP公司；RT-2100型酶標(biāo)儀深圳雷杜公司；S22PC型分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2方法

草蓯蓉用90%乙醇提取后，依次經(jīng)等體積石油醚、氯仿、乙酰乙酯和正丁醇萃取，減壓蒸餾即得BREE，得率約為13%［5］。主要成分有草蓯蓉多糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)13%）、草蓯蓉環(huán)烯醚萜（質(zhì)量分?jǐn)?shù)47%）和草蓯蓉苯丙烯醇苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)32%）。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)［7］

HepG2細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)，細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上，取對數(shù)生長期增殖活躍的細(xì)胞進(jìn)行分組。

1.2.3MTT法檢測BREE對HepG2細(xì)胞增殖的影響［8］

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以5×104個/mL的細(xì)胞濃度接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL。24 h后，加入BREE溶液100 μL，使其終質(zhì)量濃度分別為400、200、100、50、25、12.5 mg/L。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸凈培養(yǎng)液，加入5 g/L MTT溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，再加入200 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。振蕩10 min使甲臜結(jié)晶充分溶解后，在570 nm波長處檢測光密度（OD）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。另設(shè)空白孔，排除藥物干擾。

1.2.4MTT法檢測BREE對氧化損傷HepG2細(xì)胞存活率的影響

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為5 組：對照組、模型組及BREE高、中、低劑量組（質(zhì)量濃度分別為50、25、12.5 mg/L）。對照組換入正常培養(yǎng)液；模型組加入H2O2使其濃度為300 μmol/L；給藥組中加入BREE使其質(zhì)量濃度達(dá)到相應(yīng)值，2 h后再加入300 μmol/L H2O2建立細(xì)胞氧化損傷模型。損傷12 h后，每孔加入5 g/L MTT，4 h后終止培養(yǎng)，吸凈培養(yǎng)液，再加200 μL DMSO，振蕩10 min后，在570 nm波長處檢測OD值，重復(fù)3 次。另設(shè)空白孔（只加BREE）以排除藥物干擾。

1.2.5氧化損傷細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、ALT、AST的釋放［9］

頂層設(shè)計(jì)，統(tǒng)籌謀劃，必須準(zhǔn)確領(lǐng)會其內(nèi)容要點(diǎn)。水利改革發(fā)展頂層設(shè)計(jì)，明確了以建立防洪抗旱減災(zāi)體系、水資源合理配置和高效利用體系、水資源保護(hù)和河湖健康保障體系、有利于水利科學(xué)發(fā)展的制度體系等四大體系為目標(biāo)，以水利規(guī)劃、法律法規(guī)、政策措施為支撐的總體框架。這個框架科學(xué)確定水利改革發(fā)展系統(tǒng)的長遠(yuǎn)目標(biāo)、建設(shè)任務(wù)、投資規(guī)模，有計(jì)劃、有步驟、分階段、分層次推進(jìn)，讓水利改革發(fā)展這張宏偉藍(lán)圖付諸實(shí)踐時更加科學(xué)、規(guī)范，更具有可操作性。

對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞按以上方法分組，用H2O2損傷細(xì)胞1、4、12 h。收集上清液，按試劑盒說明書步驟測定上清液中LDH、ALT、AST活性。

1.2.6氧化損傷細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH、MDA水平以及ERK、JNK、p38 MAPK和NF-κB蛋白活化的測定

細(xì)胞處理在6 孔板內(nèi)進(jìn)行，用H2O2損傷細(xì)胞1、4、12 h后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，收集1×107個細(xì)胞用冷磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）清洗，破碎細(xì)胞，離心取上清液，按試劑盒說明書步驟測定細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH、MDA水平［9］。提取蛋白質(zhì)，上10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）后轉(zhuǎn)膜，再用二抗體偶聯(lián)物進(jìn)行免疫檢測，發(fā)光底物顯跡法顯跡，于UVP凝膠成像分析儀中采集圖像并進(jìn)行分析［10-11］。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果與分析

2.1BREE對HepG2細(xì)胞增殖的影響

圖1　BREE對HepG2細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of BREE on the proliferation of HepG2 cells

MTT實(shí)驗(yàn)是檢測活細(xì)胞數(shù)量的常用方法。由圖1可知，HepG2細(xì)胞在不同質(zhì)量濃度BREE作用下，細(xì)胞增殖稍有變化。質(zhì)量濃度高時，BREE具有一定的細(xì)胞毒作用，但質(zhì)量濃度在12.5～50 mg/L范圍時，其細(xì)胞活力與對照組（BREE質(zhì)量濃度為0 mg/L）相比沒有顯著性差異。說明質(zhì)量濃度小于50 mg/L時，BREE對HepG2細(xì)胞增殖沒有影響，不顯示細(xì)胞毒作用。

2.2BREE對氧化損傷HepG2細(xì)胞存活率的影響

圖2　BREE對氧化損傷HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of BREE on cell viability of HepG2 with H2O2-induced damage

H2O2能夠促進(jìn)自由基的生成，引發(fā)生物膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞的損傷、壞死和凋亡。如圖2所示，與對照組比較，模型組的細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05），經(jīng)不同劑量BREE保護(hù)后細(xì)胞存活率由54%分別增加到71%、77%和81%（P＜0.05）。

2.3BREE對氧化損傷HepG2細(xì)胞ALT、AST、LDH釋放的影響

圖3　BREE對氧化損傷HepG2細(xì)胞ALT（a）、AST（b）、LDH（cc）釋放的影響Fig.3 Effect of BREE on hepatic ALT （a）， AST （b） and LDH （c） release in HepG2 cells with H2O2-induced oxidative damage

細(xì)胞在氧化損傷過程中會將細(xì)胞內(nèi)的ALT、AST、LDH等胞內(nèi)酶釋放到培養(yǎng)基中，所以培養(yǎng)上清中ALT、AST、LDH活性大小可反映細(xì)胞的死亡或損傷程度。對照組、模型組和給藥組培養(yǎng)液中ALT、AST、LDH活性檢測結(jié)果如圖3所示。對照組培養(yǎng)液中ALT、AST、LDH活性較低，而模型組培養(yǎng)液ALT、AST、LDH活性與對照組比較顯著升高（P＜0.05）；BREE組培養(yǎng)液ALT、AST、LDH活性與模型組比較降低（P＜0.05），表明BREE可有效降低H2O2對HepG2細(xì)胞造成的氧化應(yīng)激損傷。

2.4BREE對氧化損傷HepG2細(xì)胞中SOD、GSH、MDA水平的影響

圖4　BREE對氧化損傷HepG2細(xì)胞SOD（a）、GSH（b）、MDA（cc）水平的影響Fig.4 Effect of BREE on SOD （a）， GSH （b） and MDA （c） in HepG2 cells with H2O2-induced oxidative damage

為對抗氧化應(yīng)激引起的各種損傷，有氧生物在進(jìn)化過程中發(fā)展了多種抗氧化防御機(jī)制，包括各種抗氧化酶，如SOD等，可與GSH等內(nèi)源性抗氧化劑一起能有效清除體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物，使機(jī)體免受自由基的損害［12］。而MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，細(xì)胞中MDA含量多少可反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷程度［2，13］。如圖4所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞MDA水平均顯著升高（P＜0.05），GSH水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，給藥組中的MDA水平均明顯降低（P＜0.05），給藥組中的GSH水平均明顯升高（P＜0.05）。氧化損傷4、12 h時，模型組中的SOD活性與對照組比較顯著降低（P＜0.05）；給藥組中的SOD活性與模型組比較顯著升高（P＜0.05）。但氧化損傷時間只為1 h時，模型組SOD水平略有升高趨勢，這可能與細(xì)胞氧化損傷初期時氧化應(yīng)激增高引起的SOD活力的代償性升高相關(guān)。

2.5BREE對氧化損傷HepG2細(xì)胞中MAPK和NF-κB蛋白激活的影響

圖5　BREE對氧化損傷HepG2細(xì)胞中MAPK和NNFF--κB蛋白激活的影響Fig.5 Effect of BREE on the activation of MAPK and NF-κB in HepG2 cells with H2O2-induced oxidative damage

如圖5所示，氧化損傷1 h時，與對照組比較，模型組中的ERK蛋白活化水平增高（P＜0.05）；與模型組比較，50 mg/L BREE組ERK蛋白活化水平降低（P＜0.05）。氧化損傷12 h時，與對照組比較，模型組中的JNK和p38 MAPK蛋白活化水平增高（P＜0.05）；而50 mg/L BREE降低JNK活化水平（P＜0.05），但不改變p38 MAPK蛋白活化水平。氧化損傷時，與對照組比較，模型組肝細(xì)胞核中NF-κB蛋白水平均增高（P＜0.05）；氧化損傷1 h和4 h時，50 mg/L BREE組肝細(xì)胞核中NF-κB蛋白水平降低（P＜0.05），而氧化損傷至12 h時，50 mg/L BREE組肝細(xì)胞核中NF-κB蛋白水平升高（P＜0.05）。

3　討 論

H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化損傷，氧化應(yīng)激是其重要損傷機(jī)制。細(xì)胞受到損傷后，細(xì)胞內(nèi)生成大量活性自由基，引發(fā)細(xì)胞膜上脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成終產(chǎn)物MDA；受損的細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，胞內(nèi)酶（ALT、AST、LDH等）大量外釋；脂質(zhì)過氧化生成的自由基又與氧接觸，進(jìn)而引起一系列的自由基鏈反應(yīng)。為平衡氧化還原狀態(tài)，大量損耗了細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化劑（如GSH等），最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［13-15］。因此，當(dāng)肝細(xì)胞受到H2O2損傷時，細(xì)胞活力（存活率）、轉(zhuǎn)氨酶和LDH釋放率、MDA生成量、GSH含量、SOD活性變化顯著。本研究結(jié)果表明，草蓯蓉提取物能顯著提高損傷肝細(xì)胞活力；降低損傷細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH、ALT和AST的釋放；降低損傷細(xì)胞中MDA水平，增高細(xì)胞中SOD活性和GSH含量。

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要有ERK、JNK及p38 MAPK激酶途徑［16］。人們普遍認(rèn)為，ERK為“細(xì)胞生存”通路，而JNK和p38 MAPK則為“細(xì)胞死亡（壞死和凋亡）”通路［17-18］。胞外刺激，如激素、細(xì)胞因子等都能引起肝細(xì)胞MAPK通路的激活，并磷酸化其下游的相關(guān)蛋白，從而完成細(xì)胞對胞外刺激的反應(yīng)與反饋調(diào)節(jié)［19］。而JNK和p38 MAPK通路選擇性地對環(huán)境中各種理化及炎性因子所致的應(yīng)激起反應(yīng)。JNK信號通路是由多條調(diào)控細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑構(gòu)成的一個復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，存在協(xié)同和拮抗的現(xiàn)象［20-21］。p38 MAPK信號通路目前關(guān)注最多的是調(diào)控炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)NF-κB的活化表達(dá)，在炎癥性疾病中起著關(guān)鍵作用［22］。NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路則是炎癥反應(yīng)中被激活最頻繁的通路之一，調(diào)控大部分炎癥因子的生成及釋放［23-25］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氧化損傷發(fā)生時，ERK、JNK、p38 MAPK和NF-κB蛋白均有不同程度的激活，而BREE在損傷發(fā)生的不同時期減少ERK、JNK的激活和NF-κB的核轉(zhuǎn)移。此結(jié)果與以往報道類似［10-11，26］。但文獻(xiàn)報道JNK和p38 MAPK激活也是H2O2刺激后發(fā)生的細(xì)胞內(nèi)早期事件之一［10-11］，其中H2O2誘導(dǎo)的HEK293T細(xì)胞中p38 MAPK磷酸化表現(xiàn)為雙階段反應(yīng)，15 min達(dá)到高峰并持續(xù)120 min左右［10］。由此可見，MAPK激活在不同細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中表現(xiàn)不盡相同。此外，李國平等［27］報道，氧化應(yīng)激作用于HepG2細(xì)胞后12 h開始發(fā)生細(xì)胞凋亡。本研究在氧化損傷12 h時觀察到BREE降低JNK磷酸化同時增高NF-κB p65的核轉(zhuǎn)移，這可能與其抗細(xì)胞凋亡作用有關(guān)。研究表明，NF-κB從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核，然后在細(xì)胞凋亡抑制蛋白、Bcl-2家族、TRAF1、TRAF-2、c-FLIP等作用下發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用［26］。發(fā)生氧化應(yīng)激損傷時NF-κB和JNK之間的關(guān)聯(lián)、以及細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系需進(jìn)一步研究。

綜上所述，草蓯蓉提取物對H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，此作用可能與其抑制ERK、JNK的活化和NF-κB的核內(nèi)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

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Protective Effect of Boschniakia rossica Extract on Oxidative Damage in HepG2 Cells

YIN Xuezhe1， WANG Yujiao2， YIN Jifeng1， JIN Meihua2， JIN Ming2， QUAN Jishu2，*
（1. Yanbian University Hospital， Yanji 133000， China； 2. Medical College， Yanbian University， Yanji 133002， China）

Objective： The protective role of ethanol extract of Boschniakia rossica （BREE） against cellular oxidative injury induced by hydrogen peroxide （H2O2） in HepG2 cell line was investigated. Methods： MTT assay was used to e valuate the cell proliferation of HepG2 cells. The activities of lactate dehydrogenase （LDH）， alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， malondialdelyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD） and reduced glutathione （GSH） were measured by the spectrophotometric method. The total protein expression and the phospharylation of extracellular signalregulated kinase （ERK）， c-Jun N-terminal kinase （JNK）， p38 mitogen-activated protein kinase （p38 MAPK）， and nuclear translocation of nuclear factor-κB （NF-κB） were determined by the Western blotting method. Results： BREE had no toxic effect on cultured HepG2 cells at the tested concen trations. In HepG2 cells with H2O2-induced oxidative damage， BREE increased cell viability， reduce LDH， ALT and AST leakage， inhibited MDA formation， and increased SOD and GSH levels. At the different stages of oxidative damage， ERK， JNK， p38 MAPK and NF-κB proteins were activated； however， the administration of BREE suppressed the ERK activation and NF-κB nuclear translocation at 1 h， and JNK activation at 12 h. Conclusion： BREE can function as an antioxidant to prevent cellular injury induced by H2O2in cultured HepG2 cells， maybe via the suppression of ERK and JNK activation and NF-κB nuclear translocation.

Boschniakia rossica； hydrogen peroxide （H2O2）； oxidative damage； HepG2 cell

S565.1；Q593.1

A

1002-6630（2015）15-0173-06

10.7506/spkx1002-6630-201515032

2014-09-30

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目（81160539）

尹學(xué)哲（1962—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。E-mail：yinxz@ybu.edu.cn

全吉淑（1968—），女，教授，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。E-mail：quanjs@ybu.edu.cn