崔昱清，王復(fù)龍，崔保威，郭秀云，李君珂，劉世欣，劉森軒，彭增起，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

牛胰臟組織蛋白酶L的純化和酶學(xué)性質(zhì)

崔昱清1，2，王復(fù)龍1，2，崔保威1，2，郭秀云1，2，李君珂1，2，劉世欣1，2，劉森軒1，2，彭增起1，2，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

新鮮牛胰臟勻漿物經(jīng)酸化粗提后，再通過鹽析、柱層析等步驟純化，制備了0.58 mg純酶，純化倍數(shù)達(dá)530.54。經(jīng)凝膠電泳分析，該酶有2 個亞基，分子質(zhì)量為29.1 kD和18.9 kD。牛胰臟組織蛋白酶L的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，最適反應(yīng)pH值為6.5。巰基還原劑二硫蘇糖醇、L-半胱氨酸均明顯激活了該酶活性，10 μmol/L的N-（反式-環(huán)氧丁二?；?L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺（E-64）可完全抑制其活性。1 mmol/L的Zn2+對酶活性有明顯抑制作用。該純化酶可水解芐氧羰基-苯丙氨酰-精氨酰-甲基香豆素（Z-Phe-Arg-MCA），其Km值為3.52 μmol/L。

組織蛋白酶L；牛胰臟；純化；酶學(xué)特性

嫩度很早就被認(rèn)為是影響牛肉食用品質(zhì)的最重要因素。宰后成熟過程伴隨著肌肉蛋白降解，牛肉嫩度會得到明顯改善。目前研究表明，催化肌肉蛋白降解的酶類，主要是一些半胱氨酸類蛋白酶。其中，鈣離子激活中性蛋白酶（Ca2+-activated neutral proteinase）［1］被研究最多，后被命名為鈣激活酶（calpains）［2］。該酶被確認(rèn)在宰后成熟前期對嫩化具有重要貢獻(xiàn)［3］。組織蛋白酶（cathepsins）也被一些研究者認(rèn)為影響了宰后成熟過程中肉的嫩度。20世紀(jì)90年代初Johnson等［4］的研究表明，宰后第10天，牛肉組織蛋白酶B+L的活性與剪切力值負(fù)相關(guān)。隨后O'Halloran等［5］認(rèn)為當(dāng)宰后胴體pH值降至偏酸性范圍時，組織蛋白酶能夠從溶酶體中釋放出來，對肌肉中的蛋白進(jìn)行降解；而此時，鈣激活酶的活性已經(jīng)檢測不到［6-7］；另外，組織蛋白酶L能夠水解包括肌鈣蛋白（T、I、C）、伴肌動蛋白、肌聯(lián)蛋白、原肌球蛋白在內(nèi)的多種肌原纖維支架蛋白，而這些蛋白在宰后成熟過程中都有不同程度的降解［8-13］。然而，學(xué)術(shù)界對組織蛋白酶在宰后嫩化過程中的貢獻(xiàn)一直存在爭議，再加上比較成熟的鈣激活酶系統(tǒng)嫩化理論的誕生，致使對組織蛋白酶嫩化機(jī)理的研究出現(xiàn)10多年的停滯期。最近Wang Rongrong等［14］的研究發(fā)現(xiàn)，具有組織蛋白酶B、L活性的狹鱈肌肉組織提取物可使牛肉肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，破壞肌束膜的結(jié)構(gòu)，并伴隨有明膠形成。

目前組織蛋白酶L已從各類魚肉、魚肝胰臟、兔肝、兔腎臟以及人肝中得以分離純化和性質(zhì)鑒定［10，15-20］。牛胰臟組織蛋白酶L的研究在國內(nèi)外未見報道。本實驗對牛胰臟組織蛋白酶L進(jìn)行了分離純化，并研究了該酶的酶學(xué)特性，以期為進(jìn)一步闡述宰后牛肉蛋白的生化降解機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮牛胰臟取自黃牛宰殺放血后12 h之內(nèi)，置于4 ℃冰浴備用。

Bradford蛋白測定試劑盒 江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）、氯乙酸鈉、N-（反式-環(huán)氧丁二?；?L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺（E-64） 美國Sigma公司；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二硫蘇糖醇（dithiothreito，DTT）、低分子質(zhì)量蛋白Marker 北京索萊寶公司；熒光合成底物Z-Phe-Arg-MCA、Z-Arg-Arg-MCA和L-Arg-MCA日本Peptide公司；層析填料DEAE-Sephacel、Sephacryl S-100、SP Sepharose Fast Flow、Blue Sepharose Fast Flow、ConA Sepharose 4B 美國GE Healthcare公司；L-半胱氨酸（L-Cys）為國產(chǎn)生化純；甲醇、乙醇、乙酸、鹽酸、NaCl、Na2SO4、Na2HPO4、NaH2PO4、KH2PO4、CH3COONa、EDTA-Na2等均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

?KTA Prime Plus蛋白層析系統(tǒng) 美國GE Healthcare公司；SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；Allegra 64R高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman Coulter公司；蛋白電泳系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1組織蛋白酶活力測定

組織蛋白酶活性測定基本按照Barrett等［21］的方法，即分別以組織蛋白酶B、L的特異性熒光合成肽底物Z-Arg-Arg-MCA、Z-Phe-Arg-MCA，測定各純化步驟所得活性部分的肽水解活性，并檢測組織蛋白酶L的總酶活力、酶比活力等。

一個酶活力單位（U）定義為在反應(yīng)溫度40 ℃及反應(yīng)pH 5.5條件下，1 min內(nèi)能夠水解底物并釋放出1 nmol AMC所需的酶量（1 nmol AMC/min）。

蛋白質(zhì)濃度測定參照Bradford［22］的方法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.2組織蛋白酶L的純化制備

1.3.2.1濃縮粗酶液的制備

新鮮牛胰臟于4 ℃條件下去除脂肪和結(jié)締組織。取500 g切成小塊，加入4 倍體積提取緩沖液（25 mmol/L乙酸鈉緩沖液，pH 5.0，含5 mmol/L L-Cys、0.3 mmol/L PMSF，緩沖液A）勻漿1～2 min，10 000×g離心20 min得粗酶液。再用1 mol/L HCl將粗酶液pH值調(diào)至3.0，于30 ℃條件下處理10 min。然后用1 mol/L NaOH回調(diào)pH值至5.8～6.0，并立即10 000×g離心20 min。取上清液用80%硫酸銨充分鹽析，10 000×g離心并取沉淀。用透析緩沖液（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0，含5 mmol/L L-Cys，緩沖液B）充分透析，并用濃縮超濾管（配Amicon YM-10超濾膜，截留分子質(zhì)量為10 kD）于5 000×g離心濃縮至適當(dāng)體積。

1.3.2.2分離純化

濃縮粗酶液上樣到DEAE Sephacel陰離子交換柱（2.6 cm×20 cm），以0～1 mol/L NaCl梯度的磷酸鹽緩沖液洗脫；收集活性峰，超濾濃縮后上樣于Sephacryl S-100凝膠層析柱（2.6 cm×100 cm），以含0.2 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液洗脫；收集主要活性峰，透析、超濾濃縮后上樣于SP Sepharose FF陽離子交換柱（1.6 cm×10 cm）進(jìn)行層析，以0～1 mol/L NaCl梯度的磷酸鹽緩沖液洗脫；收集主要活性峰，用透析、超濾濃縮后上樣于Blue Sepharose FF染料親和層析柱（1.6 cm×10 cm），以含0～1 mol/L NaCl的乙酸鈉緩沖液洗脫；收集活性峰，透析、超濾濃縮，上樣于ConA Sepharose親和層析柱（1 cm×10 cm），以0～1 mol/L α-甲基-D-甘露糖苷（洗脫液）梯度的磷酸鹽緩沖液洗脫；收集活性峰（穿透峰），超濾濃縮，于－80 ℃貯藏備用。

鑒定采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）方法，具體參照文獻(xiàn)［14］。其中利用12.5%分離膠和4%濃縮膠，樣品進(jìn)入分離膠前采用80 V電壓，之后采用120 V電泳1.5 h左右。電泳膠用凝膠成像系統(tǒng)掃描，用Quantity One電泳圖像分析軟件分析蛋白分子質(zhì)量。

1.3.3酶學(xué)特性研究

1.3.3.1最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

按照1.3.1節(jié)酶活力測定方法，以Z-Phe-Arg-MCA為底物，在pH 6.0條件下，測定組織蛋白酶L在20～70 ℃范圍內(nèi)的肽水解活性，以測得最高酶活力為100%。此外，將組織蛋白酶L于pH 5.5條件下，在20～70 ℃范圍內(nèi)放置60 min，冷卻至4 ℃后測定其殘余酶活力，以測得最高酶活力為100%。

1.3.3.2最適反應(yīng)pH值和pH值穩(wěn)定性

分別配制pH 4.0～8.0的Mcilvaine's buffer。以Z-Phe-Arg-MCA為底物，測定組織蛋白酶L在不同pH值條件下的肽水解活性，以測得最高酶活力為100%。此外，20 ℃條件下將組織蛋白酶L處于上述不同pH值環(huán)境下放置60 min，回調(diào)pH值至5.5，測定其殘余酶活力，以測得最高酶活力為100%。

1.3.3.3巰基激活劑及抑制劑對組織蛋白酶L活性的影響

按照酶活力測定方法，在pH 5.5、40 ℃條件下，以Z-Phe-Arg-MCA為底物，測定不同濃度的巰基還原劑DTT和L-Cys，以及半胱氨酸蛋白酶專一不可逆抑制劑E-64對組織蛋白酶L肽水解活性影響（均以空白對照的酶活力作為100%）。

1.3.3.4金屬離子對組織蛋白酶L的影響

按照酶活力測定方法，在pH 5.5、40 ℃條件下，以Z-Phe-Arg-MCA為底物，測定濃度為1 mmol/L的Ca2+、Mg2+、Mn2+以及Zn2+對組織蛋白酶L肽水解活性影響（均以空白對照的酶活力作為100%）。

1.3.3.5組織蛋白酶L的底物專一性及動力學(xué)常數(shù)測定

分別以5～30 μmol/L的Z-Phe-Arg-MCA、20～200 μmol/L的Z-Arg-Arg-MCA及20～200 μmol/L的L-Arg-MCA作底物，于pH 5.5、40 ℃條件下，測定組織蛋白酶L的反應(yīng)初速率，利用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，測定牛胰臟組織蛋白酶L對熒光合成肽底物Z-Phe-Arg-MCA、Z-Arg-Arg-MCA和L-Arg-MCA的Km值和vmax。

2　結(jié)果與分析

2.1組織蛋白酶L的層析純化

圖1　牛胰臟組織蛋白酶L純化層析結(jié)果Fig.1 Purification of cathepsin L from bovine pancreas by ion exchange， get filtration and affinity chromatography

新鮮牛胰臟中的組織蛋白酶L經(jīng)粗分離、酸處理、鹽析及一系列層析，最終得到純化。層析洗脫曲線圖見圖1。本實驗從500 g牛胰臟中純化制備了0.58 mg組織蛋白酶L，純化倍數(shù)為530.54，酶活回收率為5.0%。純化情況見表1，其純化后的SDS-PAGE結(jié)果見圖2。牛胰臟組織蛋白酶L在29.1 kD和18.9 kD處出現(xiàn)了兩個條帶。該結(jié)果表明，牛胰臟組織蛋白酶L有分子質(zhì)量為29.1 kD和18.9 kD兩個亞基，其分子質(zhì)量略小于鯉魚肝胰臟組織蛋白酶L（30 kD和24 kD）［15］。

表1　牛胰臟組織蛋白酶L純化結(jié)果Table 1 Summary of purification procedures of cathepsin L from bovine pancreas

圖2　牛胰臟組織蛋白酶L的SDS-PAGEE結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE pattern of cathepsin L from bovine pancreas

2.2組織蛋白酶L的酶學(xué)特性

2.2.1最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性

由圖3可知，牛胰臟組織蛋白酶L的最適反應(yīng)溫度在40～50 ℃之間，與前人研究吻合［15］。其熱穩(wěn)定性隨溫度升高急劇下降，50 ℃時活性降一半，60 ℃幾乎無活性。

圖3　牛胰臟組織蛋白酶L的最適溫度和熱穩(wěn)定性Fig.3 Optimal temperature and heat stability of bovine pancreas cathepsin L

2.2.2最適pH值及pH值穩(wěn)定性

圖4　牛胰臟組織蛋白酶L的最適pH值和pH值穩(wěn)定性Fig.4 Optimal pH and pH stability of bovine pancreas cathepsin L

由圖4可知，牛胰臟組織蛋白酶L的最適反應(yīng)pH值為6.5，略高于鯉魚肝胰臟組織蛋白酶L（5.5～6.0）［15］。該酶在3.0～8.0的pH值范圍內(nèi)，均保持了70%以上的活力。

2.2.3巰基還原劑及抑制劑對組織蛋白酶L活性的影響

圖5　巰基還原劑和抑制劑對牛胰臟組織蛋白酶L的影響Fig.5 Effect of sulphydryl reducing agent and sulphydryl inhibitor on bovine pancreas cathepsin L

由圖5a可知，在2～20 mmol/L濃度范圍內(nèi)，2 種巰基還原劑都明顯激活了組織蛋白酶L的活性，其中DTT的激活作用最強(qiáng)。由圖5b可知，隨著E-64濃度升高，組織蛋白酶L活性逐漸降低，濃度達(dá)到10－5mol/L時，其活性被完全抑制。

2.2.4金屬離子對組織蛋白酶L的影響

表2　金屬離子對牛胰臟組織蛋白酶活性的影響Table 2 Effect of metal ion on the activity of bovine pancreas cathepsin L

由表2可知，Ca2+、Mg2+和Mn2+對組織蛋白酶L活性幾乎沒有影響，而Zn2+則較強(qiáng)烈地抑制其活性。該結(jié)果與前人研究基本一致［15-16］。

2.2.5組織蛋白酶L的底物專一性及動力學(xué)常數(shù)

經(jīng)測定，牛胰臟組織蛋白酶L對Z-Phe-Arg-MCA有較強(qiáng)水解活性，Km值為3.52 μmol/L，低于箭齒鰈肌肉組織蛋白酶L的8.2 μmol/L和鰱魚背肌組織蛋白酶L的9.5 μmol/L，表明其具有很強(qiáng)的底物親和力；vmax值達(dá)到500 U/mg，高于鰱魚背肌組織蛋白酶L的200 U/mg；而對組織蛋白酶B的專一性底物Z-Arg-Arg-MCA和組織蛋白酶H的專一性底物L(fēng)-Arg-MCA幾乎沒有水解活性。這與前人純化的組織蛋白酶L的特性相一致［10，15，23］。

3　結(jié) 論

牛胰臟組織蛋白酶L具有兩個亞基，分子質(zhì)量為29.1 kD和18.9 kD；其最適pH值在6.0～6.5之間，最適反應(yīng)溫度為50 ℃，在pH 4.0～8.0之間及40 ℃以下活性都能得到較好保持；巰基激活劑DTT和L-Cys可明顯激活該酶的活性，而10－5mol/L巰基蛋白酶抑制劑E-64可強(qiáng)烈抑制其活性；1 mmol/L的Zn2+則可明顯抑制其活性。牛胰臟組織蛋白酶L對其專一底物Z-Phe-Arg-MCA有較強(qiáng)水解活性，Km值為3.52 μmol/L，vmax值達(dá)到500 U/mg，不能水解組織蛋白酶B的專一底物Z-Arg-Arg-MCA和組織蛋白酶H專一底物L(fēng)-Arg-MCA。

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Purification and Characterization of Cathepsin L from Bovine Pancreas

CUI Yuqing1，2， WANG Fulong1，2， CUI Baowei1，2， GUO Xiuyun1，2， LI Junke1，2， LIU Shixin1，2， LIU Senxuan1，2， PENG Zengqi1，2，*
（1. College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China；2. Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition， Nanjing 210095， China）

In this study， 0.58 mg of purified enzyme was prepared from acidification and subsequent extraction of fresh bovine pancreas homogenate followed by purification through salting out and column chromatography. The purification fold was 530.54. The purified enzyme had two subunits with molecular weights of 18.9 and 29.1 kD， respectively on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）. The optimum reaction temperature for bovine pancreas cathepsin L was 50 ℃， and the optimum pH was 6.5. Its enzyme activity was efficiently activated by dithiothreitol （DTT） and L-cysteine（L-Cys）， while it could be completely inhibited by 10 μmol/L E-64 and evidently suppressed by 1 mmol/L Zn2+. The purified enzyme could hydrolyze Z-Phe-Arg-MCA with a Kmvalue of 3.52 μmol/L.

cathepsin L； bovine pancreas； purification； enzymatic characterization

TS201.2

A

1002-6630（2015）15-0142-05

10.7506/spkx1002-6630-201515026

2014-09-25

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉牛牦牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-38）

崔昱清（1988—），男，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。E-mail：2012108043@njau.edu.cn

彭增起（1956—），男，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品、水產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。E-mail：zqpeng@njau.edu.cn