韓玉竹，鄧 釗，張 寶，游成真，叢 苑，李平蘭，*

（1.西南大學榮昌校區(qū)動物科學系，重慶 402460；2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學 院，北京 100083）

解淀粉芽孢桿菌H15產(chǎn)抗菌肽的發(fā)酵條件優(yōu)化和提取方法比較研究

韓玉竹1，2，鄧 釗2，張 寶2，游成真2，叢 苑2，李平蘭2，*

（1.西南大學榮昌校區(qū)動物科學系，重慶 402460；2.中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學 院，北京 100083）

以尖孢鐮刀菌為指示菌，無菌濾液抑菌圈直徑為考察指標，對解淀粉芽孢桿菌H15所產(chǎn)抗菌肽的發(fā)酵和提取條件進行優(yōu)化。獲得優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)基為L-1培養(yǎng)基，最佳培養(yǎng)條件為：接種量3%、初始pH 6.68、培養(yǎng)溫度30.79 ℃、培養(yǎng)時間48.61 h、轉(zhuǎn)速160 r/min。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵液抑菌圈直徑可高達25.21 mm，比優(yōu)化前（16.40 mm）提高了53.48%。以4 株玉米中攜帶的優(yōu)勢霉菌（草酸青霉、串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、黑曲霉）為指示菌，比較分析不同質(zhì)量濃度硫酸銨沉淀和鹽酸沉淀不同有機溶劑抽提對解淀粉芽孢桿菌H15抗菌肽提取的影響，結(jié)果均表明鹽酸沉淀丙酮抽提法獲得的抗菌肽活性最高。

抗菌肽；解淀粉芽孢桿菌；發(fā)酵條件；提取方法

霉菌侵染是玉米貯藏過程中的主要問題［1］，不僅會造成經(jīng)濟損失，而且霉菌代謝產(chǎn)生的真菌毒素及其他有毒代謝產(chǎn)物會嚴重危害人類健康［2］。目前，為保障糧食在儲藏過程不易發(fā)生霉變，傳統(tǒng)方法一般是在糧食表面噴灑化學防霉劑，暴露出很多安全問題。目前，尋找天然高效的生物類抗菌物質(zhì)已成為糧食防霉研究的熱點［3］。

芽孢桿菌（Bacillus spp.）生長迅速、營養(yǎng)要求簡單、抗逆性強，可以產(chǎn)生多肽類抗菌素以及具有溶菌作用的酶類，作為自然界中廣泛存在的非致病菌，絕大多數(shù)芽孢桿菌對人畜無害且不會造成環(huán)境污染。因此，芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物，是目前控制真菌病害最為安全有效和最具應(yīng)用前景的天然生物制劑，已應(yīng)用于植物病害生物防治和生鮮農(nóng)產(chǎn)品防腐保鮮的研究中，但在糧食防霉上的應(yīng)用探索較少［4］。

本實驗室前期對玉米中攜帶的霉菌種類進行分離鑒定［5］，并篩選出多株對霉菌生長及孢子萌發(fā)有強烈抑制作用的芽孢菌株，其分泌的抑菌物質(zhì)較糧食中使用的常規(guī)化學防腐劑更能有效地抑制玉米儲藏過程中的霉菌生長，保障糧食安全［6-7］。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）H15是前期實驗室篩選的具有較強拮抗糧食霉變真菌的菌株之一，并已明確產(chǎn)生抗菌肽是其拮抗病原真菌的主要機制之一。但抗菌肽的產(chǎn)量和活性受環(huán)境條件如溫度、發(fā)酵時間、培養(yǎng)基組成等的影響很大，因而，對其發(fā)酵條件的研究顯得十分重要［8］。同時抗菌肽的獲得會受到抗菌物質(zhì)提取方法的影響，選擇合適的提取方法，能節(jié)省原料簡化步驟，增加抗菌物質(zhì)的獲得量。本實驗以該菌株為研究對象，對其產(chǎn)抗菌肽發(fā)酵和提取條件進行優(yōu)化，獲得該菌代謝產(chǎn)抗菌肽的最適宜條件，以期為該菌株在工業(yè)上大量生產(chǎn)高活性的抗菌肽提供一定的實踐基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌種

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）H15，專利保藏用名ivfcaas0003，中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院應(yīng)用微生物研究室保藏菌種，專利保藏號為CGMCC 8230。

指示菌：4 株玉米中攜帶的優(yōu)勢霉菌［5，9］：草酸青霉（Penicillium oxalicum）ACCC 32576、串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）ACCC 36127、黑曲霉（Aspergillus niger）ACCC 30005、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）ACCC 37438，為中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院應(yīng)用微生物研究室保藏菌種。

1.2發(fā)酵上清液的制備

以NB培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，按3%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，三角瓶裝液量200 mL/500 mL，在30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，10 000 r/min離心10 min去除菌體細胞，用細菌濾器（0.22 μm）過濾，得到發(fā)酵液的無菌濾液，對其進行抑菌活性檢測。

1.3抑菌活性的測定

采用牛津杯雙層瓊脂平板擴散-抑菌圈法測定上清液的抑菌活性。具體為：以尖孢鐮刀菌為指示菌，將其在PDA斜面上活化，28 ℃培養(yǎng)7 d，加入滅菌水后刮取孢子，配制成濃度為106個/mL的孢子懸浮液。吸取1 mL孢子懸浮液至培養(yǎng)皿（直徑為90 mm）中，倒入20 mL冷卻到45 ℃的PDA培養(yǎng)基，搖勻，制成含菌平板。在滅菌的牛津杯里加入100 μL無菌濾液，置28 ℃恒溫培養(yǎng)，48 h后測量抑菌圈直徑。以孔中加入空白培養(yǎng)液為對照，每處理重復(fù)3 次。

1.4培養(yǎng)基的篩選

實驗選用5 種常用細菌培養(yǎng)基：NB培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL；LB培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL；BPY培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、NaCl 5.0 g、葡萄糖10.0 g，蒸餾水1 000 mL；NYD培養(yǎng)基：牛肉膏8.0 g、酵母膏3.0 g、葡萄糖1.0 g，蒸餾水1 000 mL；PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g，蒸餾水1 000 mL。

選用5 種解淀粉芽孢桿菌抗菌物質(zhì)發(fā)酵優(yōu)化后的培養(yǎng)基：YSB培養(yǎng)基：蔗糖20.0 g、酵母膏20.0 g、牛肉膏15 g、MgSO4·7H2O 0.06 g、FeSO4·7H2O 0.009 g，蒸餾水1 000 mL［10］；Landy培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g、L-谷氨酸鈉5.0 g、MgSO40.5 g、KCl 0.5 g、KH2PO41.0 g、FeSO40.15 mg、MnSO45.0 mg、CuSO40.16 mg，蒸餾水1 000 mL；Landy優(yōu)化培養(yǎng)基1（L-1）：葡萄糖42.0 g、L-谷氨酸鈉14.0 g、MgSO40.5 g、KCl 0.5 g、KH2PO41 g、FeSO40.15 mg、MnSO45.0 mg、CuSO40.16 mg，蒸餾水1 000 mL［11］；Landy優(yōu)化培養(yǎng)基2（L-2）：葡萄糖10.0 g、L-谷氨酸鈉5.0 g、MgSO40.5 g、KCl 0.78 g、KH2PO41.0 g、FeSO40.05 mg、MnSO45.0 mg、CuSO40.16 mg，蒸餾水1 000 mL［12］；Landy優(yōu)化培養(yǎng)基3（L-3）：葡萄糖8.13 g、L-谷氨酸鈉4.2 g、NH4NO36.14 g、MgSO40.5 g、KCl 0.5 g、KH2PO41.0 g、FeSO40.15 mg、MnSO44.87 mg、CaCl23.98 g、CuSO40.16 mg，蒸餾水1 000 mL［13］。

上述培養(yǎng)基pH值均為7.0～7.2。

1.5發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.5.1接種量對解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響

分別以0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、10%的接種量接種解淀粉芽孢桿菌H15，發(fā)酵初始pH值為7.0、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時間48 h。發(fā)酵結(jié)束后，取樣并測定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.5.2發(fā)酵初始pH值對解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響

以3%的接種量接種解淀粉芽孢桿菌H15，發(fā)酵初始pH值分別設(shè)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時間48 h。發(fā)酵結(jié)束后，取樣并測定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.5.3培養(yǎng)溫度對解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響

以3%接種量接種解淀粉芽孢桿菌H15，發(fā)酵初始pH 7.0，培養(yǎng)溫度分別設(shè)為20、25、30、35、40 ℃，培養(yǎng)時間48 h。發(fā)酵結(jié)束后，取樣并測定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.5.4培養(yǎng)時間對解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響

以3%接種量接種解淀粉芽孢桿菌H15、發(fā)酵初始pH 7.0、培養(yǎng)溫度30 ℃，分別在不同培養(yǎng)時間（0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60 h）取樣并測定發(fā)酵液的OD600nm值和抑菌活性。

1.5.5轉(zhuǎn)速對解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響

以3%接種量接種解淀粉芽孢桿菌H15、發(fā)酵初始pH 7.0、培養(yǎng)溫度30 ℃、培養(yǎng)時間48 h，轉(zhuǎn)速分別設(shè)為100、120、140、160、180、200 r/min，發(fā)酵結(jié)束后測定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.6響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取對抑菌活性影響最顯著的3 個因素（培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、初始pH值）為自變量，以無菌濾液的抑菌圈直徑為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合原理設(shè)計方法，設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面試驗，每組試驗重復(fù)3 次。

1.7模型的驗證

通過響應(yīng)面法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌H15產(chǎn)抗菌肽的發(fā)酵條件，并以優(yōu)化后的條件參數(shù)進行發(fā)酵試驗，比較模型預(yù)測值和試驗值，驗證模型的有效性。

1.8抗菌肽提取方法

1.8.1硫酸銨沉淀法

取100 mL發(fā)酵上清液，冰浴條件下，邊攪拌邊緩慢向上清中添加經(jīng)過研磨的硫酸銨粉末，使銨離子終質(zhì)量濃度分別達到20、30、40、50、60、70、80、90 g/100 mL，并放置4 ℃冰箱中過夜。10 000 r/min離心10 min，離心所得沉淀即為沉淀蛋白，分別向沉淀物中添加相同體積（發(fā)酵液濃縮5 倍）20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液使沉淀溶解后測定抑菌活性［14-16］。

1.8.2鹽酸沉淀有機溶劑抽提法

取發(fā)酵液100 mL冰浴條件下，邊攪拌邊緩慢向上清中添加6 mol/L HCl，調(diào)整pH值至2.0，在4 ℃條件下靜置過夜。沉淀的蛋白質(zhì)在10 000 r/min離心10 min，沉淀分別用5 倍體積的甲醇［17］、丙酮［18］、乙醇、正丁醇［19］、乙酸乙酯［20］抽提。抽提后10 000 r/min離心10 min，收集上清液，沉淀用同 種有機溶劑再次抽提，離心除去沉淀。合并兩次的抽提液，通風櫥內(nèi)風干有機溶劑后，即為粗提物。用相同體積（發(fā)酵液濃縮5 倍）20 mmol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液溶解后測定抑菌活性。

1.9數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.0進行單因素方差分析和差異顯著性分析，采用Design Expert 8.0.6.1進行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)抗菌肽培養(yǎng)基的篩選

圖1　不同培養(yǎng)基對發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.1 Effects of different media on the antifungal activity of fermented broth

由圖1可知，在同等發(fā)酵條件下，采用YSB和L-1培養(yǎng)基都可獲得相對較高活性的抗菌肽，兩者之間沒有顯著差異（P＜0.05）。其次為L-3、L-2、BPY培養(yǎng)基。但考慮到L-1培養(yǎng)基主要由谷氨酸鈉和無機鹽組成，成分相對簡單，后續(xù)抗菌物質(zhì)分離容易，成本低。因此，采用L-1培養(yǎng)基作為進一步試驗的發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.2發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1培養(yǎng)時間的影響

圖2　解淀粉芽孢桿菌H15的生長及抑菌活性曲線Fig.2 Growth and antifungal activity curves of B. amyloliquefaciens H15

由圖2可知，菌株H15在對數(shù)生長期（12 h）已產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，進入穩(wěn)定期后抗菌活性持續(xù)增加，48 h時分泌的抗菌物質(zhì)活性達到最大值。此后，抗菌物質(zhì)的活性下降。通常認為抗菌肽的產(chǎn)生與生長相關(guān)聯(lián)，有些抗菌肽在細胞開始生長時即可產(chǎn)生，而有些抗菌肽則在對數(shù)生長后期或穩(wěn)定期才會產(chǎn)生。該抗菌肽在生長到一定時間（48 h）后抑菌活性降低，這可能是由于菌體生長進入衰亡期，菌體發(fā)生自溶，釋放的蛋白酶降解了部分抗菌蛋白，使其活性降低。結(jié)果顯示，菌株H15產(chǎn)抗菌肽的最適培養(yǎng)時間為48 h。本試驗中，不同培養(yǎng)時間下，菌株H15所產(chǎn)抗菌肽的抑菌活性存在有顯著差異（P＜0.05），因而，選擇48 h作為下一步響應(yīng)面試驗的中心試驗點。

2.2.2接種量的影響

圖3　不同接種量對解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.3 Effect of inoculum amount on the antifungal activity of fermented broth of B. amyloliquefaciens H15

由圖3可知，接種量為3%時該發(fā)酵上清液的抑菌活性較高，但是方差分析結(jié)果顯示不同接種量對抗菌肽的合成影響并不顯著（P＞0.05），這可能是由于抗菌肽是細菌生長到一定階段，為適應(yīng)環(huán)境變化而產(chǎn)生的，它的合成是受菌體細胞群體感應(yīng)調(diào)節(jié)的。雖然試驗最開始采用了不同的接種量，但是在發(fā)酵48 h后，各處理菌體數(shù)量基本一致，抗菌肽的活性也差異不大。鑒于此，在后期的響應(yīng)面優(yōu)化試驗中未選擇接種量作為考察因素。

2.2.3初始pH值的影響

圖4　不同初始pH值對解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.4 Effect of initial pH on the antifungal activity of fermented broth of B. amyloliquefaciens H15

由圖4可知，發(fā)酵初始pH值對該菌株抑菌活性的影響較為顯著（P＜0.05），當發(fā)酵初始pH值在5.0～7.0范圍內(nèi)時，菌株H15抗菌肽的抑菌活性增加，當發(fā)酵初始pH值為7.0時抑菌圈直徑達到最大。之后，隨發(fā)酵初始pH值的繼續(xù)升高，抑菌活性呈逐漸下降趨勢。這可能是由于某些酸性或堿性條件使得抗菌肽的轉(zhuǎn)錄翻譯過程受阻。根據(jù)發(fā)酵上清液抑菌活性的測定結(jié)果，確定該菌株產(chǎn)生抗菌肽的最適初始pH值為7.0，并選擇初始pH 7.0作為下一步響應(yīng)面試驗的中心試驗點。

2.2.4培養(yǎng)溫度的影響

由圖5可知，不同的培養(yǎng)溫度對抗菌肽的活性有較大影響（P＜0.05）。隨著溫度的升高，發(fā)酵液的抑菌活性不斷增強，當溫度為30 ℃時，抑菌圈直徑達到最大（22.78 mm），然而，隨著溫度的繼續(xù)升高，發(fā)酵液的抑菌活性明顯下降。因此，確定菌株H15合成抗菌肽的最適溫度為30 ℃，并選擇其為下一步響應(yīng)面試驗的中心試驗點。

圖5　不同培養(yǎng)溫度對解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on the antifungal activity of fermented broth of B. amyloliquefaciens H15

2.2.5轉(zhuǎn)速的影響

圖6　不同轉(zhuǎn)速對解淀粉芽孢桿菌H15發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.6 Effect of rotational speed on the antifungal activity of fermented broth of B. amyloliquefaciens H15

由圖6可知，不同的轉(zhuǎn)速對抗菌肽的抑菌活性有顯著影響（P＜0.05）。隨著轉(zhuǎn)速的升高，發(fā)酵液的抑菌活性不斷增強，當轉(zhuǎn)速為160 r/min時，抑菌圈直徑達到最大，然而，隨著轉(zhuǎn)速的繼續(xù)升高，發(fā)酵液的抑菌活性下降。因此，確定菌株H15合成抗菌肽的最適轉(zhuǎn)速為160 r/min。

雖然轉(zhuǎn)速對抗菌肽的產(chǎn)生有影響，但沒有初始pH值、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度這3 個因素影響大，因此后期的響應(yīng)面優(yōu)化試驗中未選擇轉(zhuǎn)速作為考察因素。

2.3解淀粉芽孢桿菌H15產(chǎn)抗菌肽響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.3.1回歸模型的建立及方差分析

采用中心組合試驗設(shè)計，方案及結(jié)果見表1。用Design Expert 8.0.6.1軟件對表中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到解淀粉芽孢桿菌H15上清液的抑菌圈直徑（Y）對培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)時間（B）、初始pH值（C）的多項回歸方程：Y=－237.446 50+6.951 15A+1.519 52B+ 35.476 50C+2.5×10－4AB－0.070 5AC－0.026 875BC－0.105 44A2－0.013 861B2－2.393 50C2。2.3.2 回歸模型方差分析

表1　中心組合試驗方案及結(jié)果Table 1 Design and results of central composite tests

對上述回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表2?；貧w模型極顯著（P=0.004 9），失擬檢驗不顯著（P=0.397 9），說明未知因素對試驗結(jié)果干擾很小。同時，該模型的決定系數(shù)為R2=0.968 7，說明方程與實際的試驗數(shù)據(jù)擬合較好，較好地反映了無菌濾液的抑菌活性與培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、初始pH值的關(guān)系，因此可用該模型對解淀粉芽孢桿菌H15代謝產(chǎn)抗菌肽的培養(yǎng)條件進行分析和預(yù)測?；貧w方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性由F檢驗來判定，P值越小，則響應(yīng)變量的顯著程度越高。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知：模型一次項C極顯著，A、B不顯著；二次項A2、B2、C2均處于極顯著水平；交互項AB、AC、BC均不顯著。

表2　擬合二次多項式模型的方差分析Table 2 Analysis of variance （ANOVA） for the fitted quadratic polynomial model odel

2.3.3響應(yīng)曲面圖及其等高線圖

由回歸方程所作的響應(yīng)面立體分析圖及其等高線如圖7～9所示，它們分別反映了培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、初始pH值這3 個因素的兩兩交互作用對響應(yīng)值的影響。通過方程可知，二次項的系數(shù)均為負值，其所表征的拋物面開口向下，具有極大值點。利用Design Expert 8.0.6.1軟件分析，可得菌株H15的抑菌活性的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度30.79 ℃、培養(yǎng)時間48. 61 h、初始pH 6.68，在此條件下無菌濾液的抑菌圈直徑為25.17 mm。

圖7　培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對菌株H15發(fā)酵液抑菌活性影響的響應(yīng)面立體分析圖及等高線圖Fig.7 Response surface and conto ur plots for the effect of fermentation temperature and fermentation time on the antifungal activity of fermented broth

圖8　初始pH值和培養(yǎng)溫度對菌株H15發(fā)酵液抑菌活性影響的響應(yīng)面立體分析圖及等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of initial pH and fermentation temperature on the antifungal activity of fermented broth

圖9　初始pH值和培養(yǎng)時間對菌株H15發(fā)酵液抑菌活性影響的響應(yīng)面立體分析圖及等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of initial pH and fermentation time on the antifungal activity of fermented broth

2.3.4回歸模型的驗證

為了進一步驗證預(yù)測值，利用優(yōu)化后確定的培養(yǎng)條件進行3 次重復(fù)搖瓶實驗，無菌濾液的抑菌圈直徑平均值為25.21 mm，與預(yù)測值擬合率達99.25%，表明預(yù)測值和實際值有良好的擬合性，優(yōu)化模型可靠。優(yōu)化后抗菌肽的抑菌活性比優(yōu)化前（16.40 mm）提高了53.48%，說明本試驗所確定的優(yōu)化方案的設(shè)計合理有效，所獲得的培養(yǎng)條件能夠明顯提高發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)的活性。

2.4不同提取方法獲得抗菌肽對真菌的抑菌效果

圖10　不同提取方法獲得的抗菌肽對4 株玉米攜帶優(yōu)勢真菌的抑菌效果Fig.10 Inhibitory effects of antifungal peptides from different extraction methods on four dominant molds isolated from corn

目前解淀粉芽孢桿菌抗菌肽的提取方法主要有硫酸銨沉淀法和鹽酸沉淀有機溶劑抽提法。由圖10可知，以4 株玉米中攜帶的優(yōu)勢霉菌［草酸青霉（Penicillium oxalicum）、串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、黑曲霉（Aspergillus niger）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）］為指示菌，結(jié)果均表明，鹽酸沉淀有機溶劑抽提均要比硫酸銨沉淀法抗菌肽提取效果好，5 種有機溶劑比較，丙酮抽提效果最好，其次為乙醇，但它們之間沒有顯著性差異。

不同質(zhì)量 濃度的硫酸銨之間抑菌圈的大小差別不是很大，且抑菌效果不明顯。采用鹽酸沉淀有機溶劑抽提時，隨著pH值降低，發(fā)酵液中將出現(xiàn)大量的沉淀，當pH值降至2.0時沉淀量達到最大，沉淀分別用甲醇、丙酮、乙醇及乙酸乙酯和正丁醇抽提。不同有機溶劑抽提效果差距明顯，其中丙酮抽提效果最好，乙酸乙酯效果最弱。綜上所述，選擇丙酮作為提取溶劑。

3　討 論

芽孢桿菌次生代謝物的產(chǎn)生主要受培養(yǎng)基營養(yǎng)成分（碳、氮源和無機鹽）、發(fā)酵條件（溫度、pH值、發(fā)酵時間、接種量、通氣量等）和高度復(fù)雜的代謝調(diào)節(jié)機制的影響［10］。本研究比較了5 種常用細菌培養(yǎng)基和5 種已報道芽孢桿菌抗菌物質(zhì)發(fā)酵優(yōu)化后的培養(yǎng)基，對解淀粉芽孢桿菌H15菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同等發(fā)酵條件下，YSB和L-1培養(yǎng)基均可獲得相對較高活性的抗菌肽，顯著高于其他8 種培養(yǎng)基。但考慮到抗菌物質(zhì)的提取純化過程是一個不斷去除非活性物質(zhì)和逐漸濃縮活性物質(zhì)的過程。初始培養(yǎng)液中含有抗菌物質(zhì)的濃度越大，成分越簡單清楚，越利于提高純化物的得率，簡化后期的提取環(huán)節(jié)，降低生產(chǎn)成本，而且有利于純化物的鑒定和分析。YSB和L-1兩個高產(chǎn)抗菌肽培養(yǎng)基比較，L-1培養(yǎng)基主要由谷氨酸鈉和無機鹽組成，成分相對簡單，成本低，后續(xù)抗菌物質(zhì)分離容易，該培養(yǎng)基具備了今后抗菌肽大量工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中應(yīng)用的先決條件。因此，采用L-1培養(yǎng)基作為進一步試驗的發(fā)酵培養(yǎng)基。

采用L-1培養(yǎng)基對解淀粉芽孢桿菌H15產(chǎn)抗菌肽的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。本研究首先應(yīng)用單因素試驗，對影響解淀粉芽孢桿菌H15產(chǎn)抗菌肽的諸多因素進行了評價，篩選出了影響發(fā)酵產(chǎn)抗菌肽的主要內(nèi)在因素（培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和初始pH值）。進一步在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)曲面法對主要影響因子進行優(yōu)化和評價，建立解淀粉芽孢桿菌H15菌株發(fā)酵產(chǎn)抗菌肽的二次多項式回歸模型，并利用統(tǒng)計學方法對該模型進行了顯著性檢驗。通過對該模型進行求導(dǎo)和解矩陣可知，在各因素分別為培養(yǎng)時間48.61 h、培養(yǎng)溫度30.79 ℃、初始pH 6.68、轉(zhuǎn)速160 r/min、接種量3%時，可獲得最高活性的抑菌物質(zhì)，預(yù)測值為25.17 mm。在此條件下再進行驗證實驗，得到發(fā)酵液抑菌圈直徑25.21 mm，與預(yù)測值擬合率達99.25%，比優(yōu)化前（16.40 mm）提高了53.48%。說明本試驗所確定的優(yōu)化方案的設(shè)計合理有效，所獲得的培養(yǎng)條件能夠明顯提高發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的活性。

目前國內(nèi)外關(guān)于芽孢桿菌抗菌肽的研究多數(shù)集中于提高其發(fā)酵產(chǎn)量方面，而如何將高產(chǎn)量的抗菌物質(zhì)從培養(yǎng)基質(zhì)中高效提取出來鮮有報道。復(fù)雜基質(zhì)共存下微量活性物質(zhì)的高效提取仍是困擾資源高效利用的瓶頸問題。因此，本研究選取4 株玉米中攜帶的優(yōu)勢霉菌［草酸青霉（Penicillium oxalicum）、串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、黑曲霉（Aspergillus niger）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）］為指示菌，對目前報道的適合芽孢桿菌抗菌物質(zhì)的提取方法，主要有硫酸銨沉淀法和鹽酸沉淀有機溶劑法，進行比較分析。結(jié)果均表明，鹽酸沉淀有機溶劑抽提均要比硫酸銨沉淀法抗菌肽提取效果好，5 種有機溶劑（甲醇、丙酮、乙醇、乙酸乙酯和正丁醇）比較，丙酮抽提效果最好。這些發(fā)酵和提取工藝優(yōu)化結(jié)果對將來研究利用該菌的活性物質(zhì)具有一定指導(dǎo)意義。

［1］ JIN S. Mold growth in maize storage as affected by compound factors：different levels of maize weevils， broken corn and foreign materials，and moisture contents［J］. Journal of Asia-Pacific Entomology， 2001，4（1）： 17-21.

［2］ ROCHAA M E B， FREIRE F C O， MAIA F E F， et al. Mycotoxins and their effects on human and animal health［J］. Food Control， 2014，36： 159-165.

［3］ 蔡靜平. 儲糧微生物活性及其應(yīng)用的研究［J］. 中國糧油學報， 2004，19（4）： 76-79.

［4］ 洪鵬， 安國棟， 胡美英， 等. 解淀粉芽孢桿菌防治果蔬采后病害研究進展［J］. 中國農(nóng)學通報， 2013， 29（12）： 168-173.

［5］ 杜奕君， 叢苑， 李平蘭. 玉米致腐霉菌的分離、鑒定及其生物學特性［J］. 中國農(nóng)業(yè)大學學報， 2013， 18（5）： 90-95.

［6］ 李平蘭， 叢苑， 杜奕君， 等. 一種抗霉菌芽孢桿菌菌株及其抗菌產(chǎn)物在玉米儲藏中的應(yīng)用： 中國， ZL201310263918.0［P］. 2014-07-23.

［7］ 叢苑. 玉米霉菌快速檢測技術(shù)及控制研究［D］. 北京： 中國農(nóng)業(yè)大學， 2013.

［8］ AKPA E， JACQUES P， WATHELET B， et al. Influence of culture conditions on lipopeptide production by Bacillus subtilis［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology， 2001， 93： 551-561.

［9］ 安美玉， 王福興， 劉煒， 等. 尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schl）在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生毒素條件的研究［J］. 哈爾濱醫(yī)科大學學報，1980（2）： 32-36.

［10］ 葉云峰， 黎起秦， 袁高慶， 等. 枯草芽孢桿菌B47菌株高產(chǎn)抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化［J］. 微生物學通報， 2011， 38（9）：1339-1346.

［11］ 方傳記， 陸兆新， 孫力軍， 等. 淀粉液化芽孢桿菌抗菌脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2008， 41（2）： 533-539.

［12］ 孫力軍. 植物內(nèi)生菌Bacillus amyloliquefaciens ES-2的分離篩選及其抗菌物質(zhì)的研究［D］. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學， 2006.

［13］ 沈娟， 陸兆新， 別小妹， 等. Bacillus sp. fmbJ224發(fā)酵產(chǎn)新型抗菌肽培養(yǎng)基的優(yōu)化研究［J］. 生物工程學報， 2005， 21（4）： 609-614.

［14］ XIN Zhao， ZHI Jiangzhou， YE Han， et al. Isolation and identification of antifungal peptides from Bacillus BH072， a novel bacterium isolated from honey［J］. Microbiological Research， 2013， 168： 598-606.

［15］ ZHAO Xiaoyan， ZHAO Xiaomeng， WEI Yanmini， et al. Isolation and identification of a novel antifungal protein from a rhizobacterium Bacillus subtilis strain F3［J］. Journal of Phytopathology， 2013， 161：43-48.

［16］ CHEN Zhiteng， AO Jingqun， YANG Wenchuan， et al. Purification and characterization of a novel antifungal protein secreted by Penicillium chrysogenum from an Arctic sediment［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2013， 97： 10381-10390.

［17］ GONG Qingwei， ZHANG Chong， L? Fengxia， et al. Identification of bacillomycin D from Bacillus subtilis fmbJ and its inhibition effects against Aspergillus fl avus［J］. Food Control， 2014， 36： 8-14.

［18］ SLAVOKHOTOVA A A， ROGOZHIN E A， MUSOLYAMOV A K，et al. Novel antifungal a-hairpinin peptide from Stellaria media seeds： structure， biosynthesis， gene structure and evolution［J］. Plant Molecular Biology， 2014， 84： 189-202.

［19］ ZHAO Zhenzhen， WANG Qiushuo， WANG Kaimei， et al. Study of the antifungal activity of Bacillus vallismortis ZZ185 in vitro and identification of its antifungal components［J］. Bioresource Technology， 2010， 101： 292-297.

［20］ YUAN Bo， WANG Zhe， QIN Sheng， et al. Study of the anti-sapstain fungus activity of Bacillus amyloliquefaciens CGMCC 5569 associated with Ginkgo biloba and identification of its active components［J］. Bioresource Technology， 2012， 114： 536-541.

Optimization of Fermentation Conditions for Production of Antifungal Peptides by Bacillus amyloliquefaciens H15 and Comparison of Extraction Methods for Antifungal Peptides

HAN Yuzhu1，2， DENG Zhao2， ZHANG Bao2， YOU Chengzhen2， CONG Yuan2， LI Pinglan2，*
（1. Department of Animal Science， Rongchang Campus， Southwest University， Chongqing 402460， China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083， China）

Fermentation and extraction conditions for antifungal peptide production by Bacillus amyloliquefaciens H15 were optimized for larger diameters of inhibitory zones of Fusarium oxysporum ACCC 37438 when exposed to cell-free fermentation broths. Results showed that using L-1 medium， the optimal culture conditions were 3%， 6.68， 160 r/min，48.61 h and 30.79 ℃ for inoculum amount， initial pH， rotational speed， culture time and temperature， respectively， leading to an inhibitory zone diameter of 25.21 mm， which was 53.48% higher than that （16.40 mm） before optimization. In addition，extraction efficiencies of ammonia sulfate precipitation and hydrochloric acid precipitation followed by organic solvent extraction for the extraction of antifungal peptides from the fermentation broth were compared by using four dominant molds isolated from corn as the indicator strains. All the obtained results showed that hydrochloric acid precipitation and then acetone extraction yielded the highest antifungal activity.

antifungal peptides； Bacillus amyloliquefaciens； fermentation condition； extraction method

TQ920.6

A

1002-6630（2015）15-0135-07

10.7506/spkx1002-6630-201515025

2014-09-17

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303014）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012AA101609-7）；西南大學博士基金項目（2013Bsr06）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目（XDJK2015C121）

韓玉竹（1982—），女，講師，博士，研究方向為微生物活性代謝產(chǎn)物。E-mail：63214419@qq.com

李平蘭（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：lipinglan@cau.edu.cn