羅小虎，王 韌，王 莉，李永富，李亞男，周蘊(yùn)宇，朱麗君，陳正行*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

臭氧降解玉米中黃曲霉毒素B1效果及降解動(dòng)力學(xué)研究

羅小虎，王 韌，王 莉，李永富，李亞男，周蘊(yùn)宇，朱麗君，陳正行*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122）

玉米是我國(guó)重要的食品和飼料原料，當(dāng)收獲、加工和儲(chǔ)藏等措施不當(dāng)時(shí)，可能會(huì)造成黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）污染玉米這一突出問(wèn)題，AFB1已被國(guó)際癌癥機(jī)構(gòu)定為1級(jí)致癌物。盡管目前已建立了一些物理、化學(xué)和生物降解AFB1的方法，但高效、安全、經(jīng)濟(jì)的綠色降解方法仍很少。本研究以AFB1污染的玉米為試樣，研究臭氧對(duì)玉米中AFB1的降解效果。結(jié)果表明：AFB1降解率隨著臭氧質(zhì)量濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著提高；當(dāng)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.37%的玉米經(jīng)90 mg/L的臭氧處理40 min后，AFB1含量由77.6 μg/kg降低到21.42 μg/kg，降解率達(dá)72.4%。臭氧降解AFB1的動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明，臭氧降解AFB1符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。玉米中AFB1降解速率常數(shù)按以下次序遞減：k90mg/L＞k65mg/L＞k40mg/L。實(shí)驗(yàn)得到臭氧降解AFB1的動(dòng)力學(xué)方程、反應(yīng)速率常數(shù)、決定系數(shù)和半衰期，為最優(yōu)地控制臭氧降解AFB1的反應(yīng)條件奠定了理論和實(shí)踐基礎(chǔ)，也為臭氧降解AFB1污染玉米的應(yīng)用提供了技術(shù)保障。

黃曲霉毒素B1；玉米；臭氧；降解；動(dòng)力學(xué)

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFs）主要是由黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus par asiticus）產(chǎn)生的一類具有嚴(yán)重致癌、致畸和致突變的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的次級(jí)代謝產(chǎn)物的總稱。在已發(fā)現(xiàn)的20余種AFs中，又以黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）最常見(jiàn)且毒性最強(qiáng)。玉米是我國(guó)最重要的食品原料之一，在整個(gè)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有非常重要的地位，玉米不僅可作為食品原料，還經(jīng)常用來(lái)做小吃、酒精飲料和動(dòng)物飼料，長(zhǎng)期攝入AFB1污染的玉米及其制品，即使量非常低，也會(huì)對(duì)人和動(dòng)物造成嚴(yán)重的傷害。為此，我國(guó)非常重視控制玉米及其制品中AFB1含量，以減少對(duì)人和動(dòng)物的危害［1］。然而，盡管不斷改進(jìn)玉米的加工、干燥和儲(chǔ)藏措施，但目前AFB1的危害依然極其嚴(yán)重［2］。因此，除采取行之有效的措施防止AFB1污染玉 米之外，對(duì)已污染的玉米進(jìn)行安全有效的脫毒處理，對(duì)保證玉米安全性和減少經(jīng)濟(jì)損失具有重要意義。

盡管目前已建立了一些物理、化學(xué)和生物降解AFB1方法，但高效、安全的降解方法仍很少［3-4］。早在1997年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局就將臭氧作為一種普遍認(rèn)為安全的方法應(yīng)用于食品加工過(guò)程中，目前臭氧已在食品加工貯藏、果蔬保鮮、廢水處理等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［5-7］。而自20世紀(jì)60年代AFs被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，Dollear［8］和Dwarakan［9］等就較早利用臭氧降解花生粕和棉籽粕中AFs。此后，大量研究人員不斷研究臭氧對(duì)各種原料如玉米［10］、開(kāi)心果［11］、紅辣椒［12］、花生［13］和無(wú)花果［14］中AFs的降解效果，結(jié)果均表明臭氧對(duì)AFs具有良好降解效果。國(guó)內(nèi)外利用臭氧降解真菌毒素的研究主要集中在降解AFs上，特別是AFB1的降解［15-18］。這主要是由于臭氧容易通過(guò)親電作用破壞AFs終端呋喃環(huán)上的C8-C9鍵，且AFs一旦形成臭氧化產(chǎn)物后，再通過(guò)分子重排形成臭氧化衍生物如醛類、酮類和有機(jī)酸［19-20］。臭氧除能有效降解各類食品中AFs外，還有良好的消毒、脫色性能［21-22］，殺滅食品貯藏過(guò)程中的各種有害微生物和害蟲，如細(xì)菌、真菌、霉菌、病毒等［23-24］。因此，用臭氧降解食品中AFB1具有良好的應(yīng)用潛力。

本研究采用不同臭氧條件處理AFB1污染的玉米，以AFB1的降解率作為衡量臭氧處理效果的指標(biāo)。通過(guò)研究臭氧處理對(duì)玉米中AFB1的降解效果及降解規(guī)律，判定臭氧反應(yīng)速率的關(guān)鍵控制點(diǎn)，建立相應(yīng)的降解動(dòng)力學(xué)模型，優(yōu)化臭氧降解參數(shù)，為AFB1污染玉米臭氧降解方法的應(yīng)用提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

AFB1標(biāo)品（純度≥98.0%） 瑞士Alexis公司；AFs污染的玉米 湖南岳陽(yáng)市售；MycoSep 226#型固相萃取柱 美國(guó)Romer Labs公司；甲醇、乙腈（色譜純）美國(guó)Fisher Scientifi c公司；三氟乙酸、正己烷（分析純）國(guó)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀（帶有熒光檢測(cè)器、ZORBAX SB-C18柱） 美國(guó)Agilent公司；Simplicity UV超純水制備系統(tǒng) 法國(guó)Millipore公司；QJ-8003K-A臭氧發(fā)生器 青島國(guó)林實(shí)業(yè)股份有限公司；超聲波清洗儀昆山市超聲儀器有限公司；IDEAL-2000臭氧氣體濃度在線檢測(cè)儀 山東淄博愛(ài)迪爾測(cè)控技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

準(zhǔn)確稱量5.0 mg的AFB1標(biāo)品，溶于色譜純甲醇中，配成質(zhì)量濃度為100 mg/L的AFB1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液后，－18 ℃保存。將100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成20 mg/L的AFB1標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃保存，待用。

1.3.2臭氧降解AFB1

臭氧發(fā)生器的氧氣源由外接純氧氣提供，臭氧質(zhì)量濃度通過(guò)調(diào)整電壓和氧氣流量調(diào)節(jié)，臭氧氣體流速通過(guò)流量計(jì)調(diào)節(jié)。

將100 g玉米放入1 L玻璃反應(yīng)器，臭氧氣體經(jīng)玻璃導(dǎo)管通至反應(yīng)器底部，多余臭氧從頂部排出。為了讓原料和臭氧充分接觸，不斷將臭氧通入反應(yīng)器中，并每2.5 min將原料充分?jǐn)嚢杌靹蛞淮?。原料與臭氧的反應(yīng)在環(huán)境溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為75%，臭氧質(zhì)量濃度為0～90 mg/L，處理時(shí)間為0～40 min條件下完成。臭氧處理完原料后，靜置120 min后再裹入干凈的聚乙烯袋中，密封，4 ℃保存，待用。

1.3.3玉米中AFB1含量的測(cè)定

玉米中AFB1含量的測(cè)定方法根據(jù)GB/T 5009.23-2006《食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測(cè)定》做適當(dāng)調(diào)整。玉米樣品粉碎后過(guò)0.85 mm孔徑篩，取30 g樣品放入250 mL燒瓶，加3 g NaCl和100 mL乙腈-水（80∶20，V/V），150 r/min振蕩30 min，取上清液過(guò)濾，5 mL濾液過(guò)固相萃取柱，收集3 mL凈化液入棕色小瓶，60 ℃ N2吹干，200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸溶解樣品，立即蓋緊小瓶并渦旋15 s，40 ℃衍生化30 min，60 ℃ N2吹干，殘?jiān)?00 μL水-乙腈（85∶15，V/V）重新溶解，渦旋混合15 s，10 000 r/min離心5 min，取上清液放入小瓶，4 ℃保存。

液相色譜檢測(cè)條件：安捷倫1260液相系統(tǒng)，配自動(dòng)進(jìn)樣器，四元泵系統(tǒng)和熒光檢測(cè)器；熒光檢測(cè)器激發(fā)（λex）和發(fā)射（λem）波長(zhǎng)分別為360、440 nm；液相色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水-甲醇（65∶35，V/V）；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相流速：1.0 mL/min；色譜柱柱溫：30 ℃。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果與分析

2.1臭氧降解玉米中AFB1效果

圖1　臭氧處理對(duì)玉米中AAFFBB1降解效果Fig.1 Effect of ozone on degradation of AFB1in corn

如圖1所示，在臭氧處理前，水分含量為20.37%的玉米中AFB1含量分別為77.6 μg/kg，超過(guò)GB 13078-2001《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)飼用玉米中AFB150 μg/kg的限量要求。同時(shí)，圖1中顯示了不同臭氧質(zhì)量濃度和處理時(shí)間對(duì)玉米中AFB1的降解效果，從圖1中看出，提高臭氧質(zhì)量濃度和延長(zhǎng)處理時(shí)間，AFB1的降解率都顯著升高（P＜0.05）。這個(gè)結(jié)果與Akbas［11］、Inan［12］和de Alencar［13］等的研究結(jié)果是一致的，即隨著臭氧質(zhì)量濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，紅辣椒、花生和開(kāi)心果中AFB1降解率顯著提高。而Proctor等［25］發(fā)現(xiàn)臭氧濃度一定，處理時(shí)間和溫度不同條件下花生中AFB1的降解率達(dá)77%。上述結(jié)果均表明，臭氧對(duì)不同原料中AFB1都有良好的降解效果。另外，從玉米中AFB1的降解效果看，90 mg/L臭氧處理水分含量為20.37%的玉米40 min，AFB1的含量從77.6 μg/kg降低到21.42 μg/kg，降解率達(dá)72.4%，AFB1含量遠(yuǎn)低于中國(guó)飼用玉米限量標(biāo)準(zhǔn)（50 μg/kg）。

2.2臭氧對(duì)玉米中不同初始含量AFB1降解效果

圖2 臭氧處理對(duì)玉米中不同初始含量AAFFBB1的降解效果Fig.2 Effect of ozone on degradation of AFB1at different initial contents in corn

圖2為90 mg/L的臭氧對(duì)玉米中不同初始含量的AFB1降解過(guò)程的影響。圖2中3 條不同初始含量AFB1的降解曲線趨于一致，說(shuō)明當(dāng)AFB1初始含量分別為77.6、38.8、19.4 μg/kg時(shí)，90 mg/L的臭氧處理對(duì)玉米中AFB1降解率差異影響較小。由此可知，在本實(shí)驗(yàn)選擇的AFB1含量范圍內(nèi)，AFB1初始含量對(duì)臭氧降解AFB1效果無(wú)顯著影響。

2.3臭氧降解AFB1的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型

臭氧降解AFB1的化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)主要是研究臭氧降解AFB1的反應(yīng)速率及其所遵循的規(guī)律，以及各因素對(duì)反應(yīng)速率的影響，從而給接下來(lái)的研究提供反應(yīng)的條件；探討能夠解釋臭氧反應(yīng)速率規(guī)律的可能機(jī)理，為最優(yōu)地控制臭氧降解AFB1反應(yīng)提供理論依據(jù)，找出決定臭氧反應(yīng)速率的關(guān)鍵，使臭氧降解AFB1的反應(yīng)能按照所需要的方向進(jìn)行，并得到研究所希望的結(jié)果。

從一定程度上來(lái)說(shuō)，臭氧降解AFB1的化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究比單純的優(yōu)化降解條件更重要，這是因?yàn)樗粌H討論化學(xué)反應(yīng)的可能性，而且研究需要多長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到預(yù)期的目標(biāo)，即如何使可能性變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。但是，臭氧降解AFB1的化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)理論研究還不完善，本實(shí)驗(yàn)將對(duì)這一研究做一個(gè)初步探討。在此，研究假設(shè)臭氧與AFB1反應(yīng)符合一級(jí)反應(yīng)，設(shè)反應(yīng)為A→P，則其速率方程為：

將上面表達(dá)式用定積分形式表示，得到：

因?yàn)閗A為常數(shù)，進(jìn)行不定積分后可得：

即：

式中：c（A，0）為t=0時(shí)反應(yīng)物A的初始濃度；c（A，t）為反應(yīng)進(jìn)行到t時(shí)刻反應(yīng)物A的濃度；t為反應(yīng)時(shí)間；kA為反應(yīng)平衡常數(shù)。

式（3）、（4）為一級(jí)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程，該方程也可替換成指數(shù)形式，即：

由式（5）可以看出，反應(yīng)物的濃度隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)指數(shù)減小，只有當(dāng)t=∞時(shí)，才有c（A，t）=0。該一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程具有如下特征：

由式（3）可以看出，ln c（A，t）對(duì)t作圖為一直線，該直線斜率為－kA，截距為ln c（A，0）。

式中：kA為反應(yīng)速率常數(shù)，其量綱是t－1，單位為s－1（或min－1、h－1等）。

由式（4）可得，當(dāng)c（A，t）=c（A，0）/2時(shí)，即反應(yīng)物A消耗一半所需要的時(shí)間（稱為反應(yīng)物A的半衰期）t（1/2，A）= ln2/kA=0.693 1/kA，與反應(yīng)物A的初始濃度無(wú)關(guān)。

圖3　玉米中AAFFBB1臭氧降解動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Kinetic curves of AFB1degradation in corn by ozone

圖4　玉米中不同AAFFBB1含量的臭氧降解動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 Kinetic curves of degradation of AFB1at different initial contents in corn by ozone

由圖3、4可知，各質(zhì)量濃度臭氧降解AFB1的動(dòng)力學(xué)方程曲線擬合良好，符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)具有的3 項(xiàng)特征（圖3），而臭氧降解不同初始含量AFB1的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)也屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)（圖4）。

2.4不同條件下AFB1的降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)

表1　臭氧降解玉米中AAFFBB1動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters for degradation of AFB1in corn by ozonee

表2　臭氧降解不同初始含量AAFFBB1動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters for degradation of AFB1at different initiall contents by ozoonnee

表1、2列出了不同條件下AFB1降解的動(dòng)力學(xué)方程、決定系數(shù)、反應(yīng)速率、半衰期和顯著性分析結(jié)果。結(jié)果顯示，動(dòng)力學(xué)方程擬合效果較好（除臭氧質(zhì)量濃度為40 mg/L以外，R2均大于0.98）。表1中為不同質(zhì)量濃度臭氧降解玉米中AFB1的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，其中反應(yīng)速率常數(shù)（kA）按以下次序遞減：k90mg/L＞k65mg/L＞k40mg/L。從反應(yīng)速率常數(shù)可看出，隨著臭氧質(zhì)量濃度升高，AFB1降解速率加快；而從降解效果來(lái)看，隨著臭氧處理時(shí)間的延長(zhǎng)，AFB1含量降低，這也與前人的研究結(jié)果是一致的［15，26］。表2中結(jié)果顯示臭氧對(duì)不同初始含量AFB1的降解速率參數(shù)（kA）和半衰期（t1/2）沒(méi)有顯著影響，說(shuō)明臭氧對(duì)AFB1的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)。上述動(dòng)力學(xué)模型在改變一些臭氧處理AFB1污染的玉米條件下，仍能較好地幫助評(píng)估臭氧處理后玉米中AFB1的含量。

3　結(jié) 論

通過(guò)臭氧對(duì)玉米中AFB1降解的實(shí)驗(yàn)，研究了臭氧質(zhì)量濃度、處理時(shí)間等因素對(duì)AFB1降解效果的影響。質(zhì)量濃度為90 mg/L的臭氧處理水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.37%的玉米40 min后，AFB1含量由77.6 μg/kg降低到21.42 μg/kg，降解率為72.4%。上述研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了臭氧能快速有效地降解玉米中AFB1，且隨著臭氧質(zhì)量濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，AFB1的降解率顯著升高（P＜0.05）。

臭氧降解AFB1化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型結(jié)果表明，玉米中AFB1降解速率以如下順序遞減：k90mg/L＞k65mg/L＞k40mg/L。通過(guò)對(duì)臭氧降解AFB1的動(dòng)力學(xué)模擬，發(fā)現(xiàn)臭氧降解AFB1行為符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型。實(shí)驗(yàn)得到不同降解條件下臭氧降解AFB1的動(dòng)力學(xué)方程、決定系數(shù)、反應(yīng)速率常數(shù)、半衰期和顯著性分析結(jié)果，為最優(yōu)地控制臭氧降解AFB1反應(yīng)條件及臭氧降解AFB1對(duì)玉米品質(zhì)改變及安全性評(píng)價(jià)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐依據(jù)，也為接下來(lái)臭氧降解AFB1污染玉米技術(shù)的可行性奠定了基礎(chǔ)。

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Efficiency and Kinetics of Ozone Degradation of Aflatoxin B1in Corn

LUO Xiaohu， WANG Ren， WANG Li， LI Yongfu， LI Yanan， ZHOU Yunyu， ZHU Lijun， CHEN Zhengxing*
（National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology， State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology， Jiangnan University， Wuxi 214122， China）

As an important ingredient in feed and food， corn is prone to being contaminated by AFB1during harvesting，processing and storage. Although several physical， chemical and biological protocols have been established to degrade AFB1， effi cient， safe， economical and environmentally friendly methods remain scarce. In this study， the effi ciency of ozone degradation of AFB1in corn was explored. The results showed that with increasing ozone concentration and treatment time， the degradation rates of AFs in corn were evidently elevated. The AFB1contents in corn with a moisture content of 20.37% plummeted from 77.6 μg/kg to 21.42 μg/kg after 40 min of treatment with 90 mg/L ozone， viz.， the degradation rate was 72.4%. The degradation of AFs in different raw materials by ozone followed fi rst order kinetics. The degradation rate constants of AFB1in corn followed the descending order of k90mg/L＞ k65mg/L＞ k40mg/L. Kinetics parameters， such as kinetic equations， reaction rate constants， correlation coeffi cients and half-life periods， provided valuable evidence for controlling ozonation under optimum conditions and for clarifying the infl uence of ozonation on AFB1in corn. Hence， the fi ndings allow feasible application of ozonation in degrading AFB1in corn.

afl atoxin B1； corn； ozone； degradation； kinetics

TS201.6

A

1002-6630（2015）15-0045-05

10.7506/spkx1002-6630-201515010

2014-10-05

公益性行業(yè)（糧食）科研專項(xiàng)（201313005）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（JUSRP11510）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203037）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371874）；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD34B02）

羅小虎（1983—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)榧Z食質(zhì)量與安全。E-mail：xh06326@gmail.com

陳正行（1960—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榧Z食精深加工及安全。E-mail：zxchen_2008@126.com