萬會達

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

微波輔助酶催化甜菊苷的轉(zhuǎn)苷和水解

萬會達

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

分別研究了微波輔助α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)移酶（α-CGTase）催化甜菊苷（St）轉(zhuǎn)苷，和β-半乳糖苷酶催化St水解的反應(yīng)。實驗表明，微波能夠加速來源于Paenibacillus macerans JFB05-01的α-CGTase催化St轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，催化效率提高了21.7倍；但微波對β-半乳糖苷酶催化St的水解反應(yīng)的影響較小。α-CGTase的加酶量為1 000 U/g時，反應(yīng)1 min，St的轉(zhuǎn)化率高達71.6%，St-Glc 1的產(chǎn)率為23.7%。

微波；甜菊苷；轉(zhuǎn)苷；水解

甜菊糖是一類從甜葉菊葉子中提取的高甜度、低熱值甜味劑，是一種非常理想的蔗糖替代品，被譽為世界“第三類糖源”［1］。同時其還兼具生物活性和藥用價值，可以輔助治療高血壓、高血糖、糖尿病，預(yù)防動脈硬化、齲齒，也有消炎、抗菌、抗癌和增強免疫力等功效［2-4］。甜菊糖主要由9種甜味成分組成，均含有相同的苷元——四環(huán)二萜類化合物甜菊醇（steviol），僅C19和C13位上連接不同數(shù)量的葡萄糖基或鼠李糖基［5］。甜菊糖中含量最高的為甜菊苷（13-［（2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl）oxy］kaur-16-en-18-oic acid，β-D-glucopyranosyl ester，stevioside，St）。甜菊糖雖然優(yōu)點眾多，但也存在缺陷，亟需解決，首當(dāng)其沖就是后苦澀味。與精制、復(fù)配、加入掩蓋劑等手段相比，酶催化轉(zhuǎn)苷法可以從分子層面上去除后苦澀味［6］。分子結(jié)構(gòu)中糖基位置、數(shù)目、種類三者共同決定甜菊糖的甜味特質(zhì)，C13槐糖基是甜味的主要功能基團。對甜度和甜味有利的連接糖基種類的順序是：果糖基>葡萄糖基>鼠李糖基或半乳糖基>其他疏水性分子基團［7］。此外利用糖基水解酶可以選擇性催化水解甜菊糖結(jié)構(gòu)中已有的糖基，可以得到多種自然界中稀有次級苷，如懸鉤子苷、異甜菊醇等，次級苷可以進一步衍生化，合成其他功能性糖苷［8-9］。

微波是一種波長介于1 mm～1 m的電磁波。微波輻射（Microwave Irradiation，MI）作為一種加熱方式，具有均勻、快速、高效等特點，已在提取、干燥、冶金、消解、滅菌、化學(xué)等領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用［10-13］。與常規(guī)加熱（Conventional Heating，CH）相比，微波輻射不僅能減少催化劑用量，加快反應(yīng)速度，甚至改變選擇性［14-16］。這可以歸結(jié)為熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)：熱效應(yīng)是指微波輻射使反應(yīng)物溫度升高，從而加快反應(yīng)速度的現(xiàn)象；非熱效應(yīng)是指除加熱使溫度升高帶來的影響以外，MI對某些反應(yīng)具有提高平衡轉(zhuǎn)化率、減少副產(chǎn)物、改變產(chǎn)物選擇性等無法用單純的致熱效應(yīng)來解釋的其它效應(yīng)［17］。如微波輻射下，嘧啶被選擇性合成6-取代蝶呤，而在常規(guī)加熱下產(chǎn)物則以7-取代蝶呤為主［18］。微波輻射也能促進糖苷酶催化糖苷合成或水解反應(yīng)，如在300 W下，來源于Pyrococcus furiosus的β-葡萄糖苷酶催化oNPG，水解活性提高了2.3萬倍［19-20］。

已有的研究大多是使用家用微波爐或是在類似工作原理的微波反應(yīng)器中進行，均為非連續(xù)多模微波輻射，微波場密度低，功率分布不均勻，導(dǎo)致實驗重現(xiàn)性差，非熱效應(yīng)不明顯。本文初探了單模連續(xù)微波輻射輔助3種糖苷酶分別催化甜菊苷水解和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，如圖1所示。

圖1　微波輔助糖苷酶催化甜菊苷水解和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)圖示Fig.1Schematic illustration of microwave-assisted enzymatic transglycosylation and hydrolysis of stevioside

1　試劑與儀器

甜菊苷（純度95%，HPLC），購于GLG生命科技集團；甜菊苷標準品（純度98.5%，HPLC），由常州市牛塘化工廠有限公司惠贈；懸鉤子苷標準品（純度98.2%，HPLC），由廣西師范大學(xué)陳全斌課題組惠贈；甜菊醇標準品（純度98.5%，HPLC），作者所在實驗室自制；來源于Bacillus Subtilis的α-中溫淀粉酶（4 000 U/g），購于無錫雪梅酶制劑有限公司；來源于軟化類芽孢桿菌Paenibacillus macerans JFB05-01的α-CGTase（187 U/mL），來源于Sulfolobus sp.的β-半乳糖苷酶（770 U/mL），來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶（14 kU/g），由江南大學(xué)吳敬課題組提供；玉米淀粉，購于作者所在地超市；鄰硝基苯酚（oNP，純度99%），購于上海晶純生化科技股份有限公司；鄰硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（oNPG，純度99%），購于上海寶曼生物科技有限公司；有機純試劑（AR），購于中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W(xué)試劑公司；乙腈（色譜純），購于美國J.T bakter公司；超純水，作者所在實驗室自制。

Discover微波反應(yīng)器，購于美國CEM公司；WSC21070A空氣壓縮機，購于上?；垴Y機電有限公司；HZ-8812S-B往復(fù)式水浴搖床，購于太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司；D-2000 Elite日立HPLC，購于天美（中國）科學(xué)儀器有限公司；DKB-501A超級恒溫水槽，購于上海森信實驗儀器有限公司；81-2型磁力攪拌器，購于上海司樂儀器有限公司；紫外可見分光光度計，購于北京普析通用儀器有限公司；2695型液相色譜儀（二極管陣列檢測器996），MALDI SYNAPT QTof MS液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀，購于美國Waters公司。

2　實驗方法

2.1酶活測定

α-CGTase環(huán)化酶活的測定：用磷酸緩沖液（pH 6.0，50 mmol/L）將酶液稀釋一定倍數(shù)；在5 mL的離心管中加入980 μL麥芽糊精溶液（質(zhì)量分數(shù)1%），放入40℃水浴鍋中恒溫10 min；加入20 μL稀釋到一定倍數(shù)的酶液，反應(yīng)10 min后加入1 mL HCl（1 mol/L）終止反應(yīng)；10 min后向反應(yīng)液中加入1 mL甲基橙顯色（0.1 mmol/L，緩沖液配制同上），室溫靜置15～20 min后用分光光度計在505 nm測定吸光度，根據(jù)標準α-CD標準曲線計算酶活。空白對照：先加入1 mol/L的HCl終止反應(yīng)，而后再加酶液，其他條件相同。α-CGTase酶活定義：每分鐘釋放1 μmol α-CD所需要的酶量定義為1個酶活單位。

來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶酶活測定：在5 mL的離心管中加入1.8 mL醋酸緩沖液（pH 4.6），再加入100 μL稀釋100倍的酶液（空白不加酶），37℃下預(yù)熱10 min；加入oNPG（20 mmol/ L）底物100 L，計時反應(yīng)10 min；加入1 mL Na2CO3（1 mol/L）終止反應(yīng)；在420 nm處測定其吸光度，根據(jù)鄰硝基苯酚oNP標準曲線（y=0.229 2×OD值，R2= 0.999 2）計算酶活。酶活（U）定義為在上述反應(yīng)條件下每分鐘生成1 μmol oNP所需要的酶量。

來源于Sulfolobus sp.的β-半乳糖苷酶酶活測定：將緩沖液替換成pH 6.0、50 mmol/L的磷酸緩沖液，80℃，其他測定條件同上。

2.2微波輻射輔助甜菊苷的轉(zhuǎn)苷反應(yīng)

稱取2 g淀粉加入100 mL水調(diào)成糊狀，放入90℃水浴中不斷攪拌，直至成糊。將燒杯放入70℃水浴中恒溫后加入2 mL α-淀粉酶液（4 U/mL）不斷攪拌，液化30 min。煮沸3 min滅活，冷卻后定容至100 mL。離心后上清液備用，沉淀為未溶解的淀粉，恒質(zhì)量計算淀粉水解液的真實濃度。分別移取10 mL St溶液（20 mg/mL）和10 mL淀粉水解液（20 mg/mL）于圓底燒瓶中，放入微波反應(yīng)器；選擇恒溫模式，在一定溫度下預(yù)熱30 min后，改成恒定功率模式（20 W），加入α-CGTase（10 U/g）后反應(yīng)1 min，并通過同步冷卻控制溫度恒定；將反應(yīng)液煮沸滅除酶活，離心取上清液；HPLC測定甜菊苷的含量，計算St轉(zhuǎn)化率。

常規(guī)加熱采用水浴加熱，其他反應(yīng)條件同上。

2.3微波輻射輔助甜菊苷的水解反應(yīng)

移取10 mg/mL St溶液于圓底燒瓶，放入微波反應(yīng)器；選擇恒溫模式，在一定溫度下預(yù)熱30 min，設(shè)定微波加熱模式，加入β-半乳糖苷酶100 U/g，反應(yīng)數(shù)分鐘；取樣作HPLC分析，計算St轉(zhuǎn)化率。

常規(guī)加熱采用水浴加熱，其他反應(yīng)條件同上。所有實驗均做3次平行。

2.4產(chǎn)物分析

LC-MS分析轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物（St-Glc）組成［21］；根據(jù)HPLC計算St轉(zhuǎn)化率和轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物產(chǎn)率：色譜柱為氨基柱（APS-2 HYPERSIL，250 mm×4.6 mm，Thermo，United States），檢測波長210 nm；乙腈/水梯度洗脫：V（乙腈）∶V（水）=75∶25（2 min）到V（乙腈）∶V（水）= 50∶50（25 min），體積流量1 mL/min。St轉(zhuǎn)化率

式中：C0表示St初始質(zhì)量濃度（mg/mL），Ct表示t h時反應(yīng)混合物中St的質(zhì)量濃度（mg/mL）。根據(jù)HPLC外標曲線計算St的濃度。轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物的產(chǎn)率根據(jù)峰面積歸一化計算得到。

水解產(chǎn)物分析：色譜柱為C18柱，檢測波長為210 nm；乙腈/水梯度洗脫：V（乙腈）∶V（水）=15∶85（2 min）到V（乙腈）∶V（水）=81∶18（25 min），體積流量1 mL/min；根據(jù)外標曲線求得懸鉤子苷及甜菊醇產(chǎn)率。

3　結(jié)果與討論

3.1微波輻射對糖苷酶催化甜菊苷反應(yīng)的作用

恒定功率和溫度，考察3種糖苷酶催化St轉(zhuǎn)苷和水解反應(yīng)。來源于Paenibacillus macerans JFB05-01的α-CGTase催化St的轉(zhuǎn)苷反應(yīng)［21］，來源于Aspergillus sp.的β-半乳糖苷酶可以催化St水解制備懸鉤子苷［9］，來源于Sulfolobus sp.的β-半乳糖苷酶可以催化St水解制備甜菊醇［22］。相同條件下，與常規(guī)加熱相比，微波功率為15 W時，來源于Paenibacillus macerans JFB05-01的α-CGTase催化St的轉(zhuǎn)化率提高了21.7倍，1 min St的轉(zhuǎn)化率達32.6%（圖2）。而其他兩種β-半乳糖苷酶在MI下并沒有表現(xiàn)出較高的催化活性，MI下反應(yīng)1 min，未檢測出產(chǎn)物；延長反應(yīng)時間至0.5 h后與相同條件下CH相比，St的轉(zhuǎn)化率僅提高1%～3%。

圖2　微波輻射輔助糖苷酶催化甜菊苷轉(zhuǎn)苷和水解反應(yīng)Fig.2Microwave-assisted enzymatic transglycosylation and hydrolysis of stevioside

更換其他兩種MI模式，繼續(xù)考察來源于Sulfolobus sp.的β-半乳糖苷酶催化St水解反應(yīng)。圖3（a）為恒溫模式（時間延長至2 h）；圖3（b）表示恒定功率下升溫模式（從25℃升至75℃）。由圖3可知，MI對來源于Sulfolobus sp.的β-半乳糖苷酶催化水解反應(yīng)的加速作用仍然較弱。

圖3　微波輻射輔助來源于Sulfolobus sp.的β-半乳糖苷酶催化甜菊苷的水解反應(yīng)Fig.3Hydrolysis of stevioside using the β-galactosidase from Sulfolobus sp.under microwave irradiation

3.2微波輔助α-CGTase催化甜菊苷的轉(zhuǎn)苷反應(yīng)

如圖4所示，虛線表示St的轉(zhuǎn)化率，實線表示各種轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物的產(chǎn)率；圖4（a）是60℃，10 W，淀粉水解液10 mg/mL，St 10 mg/mL，10 U/g；圖4（b）是60℃，淀粉水解液10 mg/mL，St 10 mg/mL，10 U/ g，1 min；圖4（c）是20 W，淀粉水解液10 mg/mL，St 10 mg/mL，10 U/g，1 min；圖4（d）是20 W，55℃，St 10 g/mL，10 U/g，1min；圖4（e）是20 W，55℃，淀粉水解液10 mg/mL，St 10 mg/mL，10 U/g，pH 5.0 50 mmol/L醋酸緩沖液，pH 6～8 50 mmol/L磷酸緩沖液；圖4（f）是20 W，55℃，m（淀粉水解液）∶m（St）= 1∶1，10 U/g；圖3（g）是20 W，55℃，淀粉水解液10 mg/mL，St 10 mg/mL，1 min。

圖4　微波輻射下α-CGTase催化St轉(zhuǎn)苷反應(yīng)條件優(yōu)化Fig.4Optimalreactionconditionsforstevioside transglycosylationwithα-CGTaseunder microwave irradiation

以St轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物中味質(zhì)最佳的St-Glc 1為指標（Glc表示葡萄糖基，數(shù)字表示轉(zhuǎn)苷個數(shù)），優(yōu)化微波輔助α-CGTase催化St轉(zhuǎn)苷反應(yīng)。反應(yīng)1 min，轉(zhuǎn)苷反應(yīng)基本達到平衡，見圖4（a）；高功率和高溫均會降低催化效率，使α-CGTase活性受到抑制或失去，最佳功率和溫度分別為20 W和55℃，見圖4（b）（c）。最優(yōu)條件下，1 min，20 W，55℃，m（淀粉水解液）∶m（St）=1∶1，以水為溶劑，St初始底物質(zhì)量濃度最高可達200 mg/mL，加酶量為10 U/g時，最終St轉(zhuǎn)化率為52.5%，St-Glc 1的產(chǎn)率為21.5%；當(dāng)加酶量為1 000 U/g，反應(yīng)1 min，St的轉(zhuǎn)化率高達71.6%，St-Glc 1的產(chǎn)率為23.7%。與CH相比，達到相同轉(zhuǎn)化率的反應(yīng)時間大大縮短，說明MI下更能促進高轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物的生成。

4　結(jié)語

本文初探了連續(xù)微波輻射對糖苷酶催化St的轉(zhuǎn)苷和水解反應(yīng)的影響。微波輻射能夠提高來源于Paenibacillus macerans JFB05-01的α-CGTase催化St轉(zhuǎn)苷反應(yīng)的效率。20 W，反應(yīng)1 min，55℃，m（淀粉水解液）∶m（St）=1∶1，以水為溶劑，St初始底物質(zhì)量濃度最高可達200 mg/mL，加酶量為10 U/g St時，轉(zhuǎn)化率為52.5%，St-Glc 1的產(chǎn)率為21.5%；當(dāng)加酶量為1 000 U/g，反應(yīng)1 min St的轉(zhuǎn)化率高達71.6%，St-Glc 1的產(chǎn)率為23.7%。與CH模式下相比，達到相同轉(zhuǎn)化率的反應(yīng)時間大大縮短，說明微波輻射下更能促進高轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物的生成。

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Microwave-Assisted Enzymatic Transglycosylation and Hydrolysis of Stevioside

WANHuida
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Chemical and Materials Engineering，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Microwave-assisted enzymatic transglycosylation and hydrolysis of stevioside（St）were investigated using α-cyclodextrin glucanotransferase（α-CGTase）and β-galactosidase，respectively. Microwave irradiation could accelerate the transglycosylation of St using α-CGTase extracted from Paenibacillus macerans JFB05-01，and the catalytic efficiency was increased by 21.7 folds. However，little effect was observed when microwave irradiation was applied to the enzymatic hydrolysis of St using β-galactosidase.With 1 000 U/g of α-CGTase was loaded，the conversion of St could reach as high as 71.6%after 1 min and the yield of St-Glc 1 was 23.7%correspondingly.

microwave，stevioside，transglycosylation，hydrolysis

Q684；O629.13；Q556.2

A

1673—1689（2015）12—1338—06

2015-05-04

無錫市科技支撐計劃——社會發(fā)展（CSE01N1239）；江南大學(xué)青年自主科研課題（1042050205141410）。

萬會達（1984—），男，江蘇鹽城人，工學(xué)博士，副教授，主要從事生物催化研究。E-mail：huidawan@jiangnan.edu.cn