敖敦格日樂，楊體強，包斯琴高娃，石磊

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)計算機信息學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010110；2.內(nèi)蒙古大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010021；3.內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010051）

電場對脂肪酶二級結(jié)構(gòu)及其活性的影響

敖敦格日樂1，楊體強2，包斯琴高娃3，石磊1

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)計算機信息學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010110；2.內(nèi)蒙古大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010021；3.內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010051）

脂肪酶被不同強度的電場處理5 min，用紅外光譜法研究電場對其二級結(jié)構(gòu)的影響，并測定酶活性的變化。實驗結(jié)果顯示：在1.0～6.0 kV/cm范圍，電場作用對脂肪酶二級結(jié)構(gòu)單元相對含量的影響程度不同。與對照組相比，處理組的α-螺旋和β-折疊含量普遍減少，減少幅度分別為4.9%～10.9%和3.2%～22.6%；β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量普遍增加，增加幅度分別為12.5%～37.7%和3.1%～24%。并且各種結(jié)構(gòu)的含量在3.0 kV/cm電場強度條件下變化最為明顯。經(jīng)電場處理后脂肪酶活性顯著增加，這與β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量的增加有一定的相關(guān)性。

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3）是一種單純蛋白酶，它廣泛存在于各種微生物、植物和動物體中。脂肪酶能催化天然油脂（甘油三脂）水解，反應(yīng)過程中甘油三酯經(jīng)甘油二酯、單酸甘油酯最終降解為甘油和脂肪酸，是一類特殊的酯鍵水解酶。脂肪酶作為生物催化劑可催化由不同底物出發(fā)的水解和合成反應(yīng)，且反應(yīng)不需要輔酶，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少。脂肪酶由于其多重催化功能被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中，如在奶制品的生產(chǎn)、烘焙食品的制作、油脂加工、酒類釀造、肉類加工及食品添加劑的生產(chǎn)等［1-4］。

脂肪酶的催化特性與其分子空間結(jié)構(gòu)有著密切的聯(lián)系。理論研究表明，酶蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)對酶的功能至關(guān)重要，即使極其細(xì)微的擾亂，也能夠極大地影響酶的活性。而且，蛋白質(zhì)不是剛性分子，它的功能依賴于結(jié)構(gòu)的這種運動性［5］。已有研究表明，電場處理可使酶的活性發(fā)生改變［6-8］，并提出酶活性發(fā)生變化的機制可能是電場處理導(dǎo)致酶的靜電性質(zhì)和構(gòu)象發(fā)生改變［9-10］。

作者所在課題組應(yīng)用不同電場強度條件處理脂肪酶，并利用FTIR光譜法研究了脂肪酶對照組和處理組二級結(jié)構(gòu)含量變化，同時測定了酶活性。初步探討了電場對酶分子結(jié)構(gòu)和活性的作用機理，并擬為脂肪酶催化功能強化提出新的物理方法。

1　材料與方法

1.1材料

麥芽脂肪酶，比活力為10 U/mg，購自美國Sigma公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品的電場處理電場處理裝置由平板電極形成，極板電壓波形為50 Hz半波整流。實驗中分別取等量脂肪酶樣品經(jīng)電場處理，電場處理條件分別為E=1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 kV/cm，共6個場強處理條件，對照組記為E0=0.0 kV/cm。電場處理時間5 min。

1.2.2紅外光譜測試方法紅外光譜測定采用NexusTM670傅立葉變換紅外光譜儀（Nicolet公司制）。經(jīng)不同強度電場處理后的脂肪酶，干燥保存12 h后，與KBr粉末按1∶100的質(zhì)量比均勻混合，取等量壓片進(jìn)行紅外光譜測定。紅外光譜測試范圍為400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，經(jīng)32次掃描獲得紅外圖譜。

2　實驗結(jié)果

2.1電場對脂肪酶紅外圖譜的影響

圖1為脂肪酶酰胺Ⅰ帶的去卷積譜。對照組在酰胺Ⅰ存在8個子峰，分別為1 691、1 678、1 668、1 656、1 648、1 638、1 629 cm-1和1 620 cm-1。與對照組相比，不同電場強度處理對脂肪酶去卷積譜子峰峰位和峰強有不同影響：經(jīng)電場處理后，脂肪酶酰胺Ⅰ帶表現(xiàn)為9個子峰，1 678 cm-1峰紅移至1672cm-1，1668cm-1藍(lán)移至1663cm-1，且在1682 cm-1附近有新增子峰；1 638、1 629 cm-1和1 691 cm-1處子峰相對強度明顯下降。

1.2.3光譜處理用儀器自帶的OMNIC E.S.P.5.1軟件包對所得紅外光譜酰胺Ⅰ帶進(jìn)行兩點基線校正，并進(jìn)行7點Savitsk-Golay函數(shù)平滑處理，再作二階導(dǎo)數(shù)和傅立葉去卷積譜，控制半峰全寬（Band width）18，增強因子（Enhancement factor）2.3。結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)譜和去卷積譜得到的子峰峰位進(jìn)行相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)譜峰指認(rèn)。根據(jù)各子峰的吸收頻率，利用Microsft origin數(shù)學(xué)軟件對譜圖進(jìn)行高斯曲線擬合。擬合過程中進(jìn)行基線校正，多次擬合使殘差最小。

1.2.4活性的測定活性的測定按參考文獻(xiàn)方法［11］進(jìn)行。脂肪酶水解油酯為油及游離脂肪酸，用酸堿滴定法滴定生成游離脂肪酸以測定脂肪酶活性。

圖1　不同電場強度處理對脂肪酶酰胺Ⅰ帶去卷積譜圖的影響Fig.1Effects of electric strength on the deconvolved spectra in the amideⅠregion of lipase

2.2電場對脂肪酶二級結(jié)構(gòu)的影響

按文獻(xiàn)報道［12-15］，結(jié)合二階導(dǎo)數(shù)譜，可將脂肪酶酰胺Ⅰ帶各子峰歸屬不同二級結(jié)構(gòu)：（1 656±2）cm-1峰歸屬為琢-螺旋結(jié)構(gòu)；（1 639±2）、（1 629±2）、（1 620±2）cm-1和（1 691±4）cm-1峰歸屬為茁-折疊結(jié)構(gòu)；（1 678±2）、（1 667±2）、（1 682±2）cm-1峰歸屬為茁-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)；（1 646±3）cm-1峰歸屬為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。從各子峰的相對強度和面積分?jǐn)?shù)估計，脂肪酶二級結(jié)構(gòu)應(yīng)以茁-折疊結(jié)構(gòu)為主。這與已有報道較為一致［16-17］。

從脂肪酶去卷積譜的變化情況可以看出，電場處理后脂肪酶的琢-螺旋、茁-折疊的特征峰相對強度均降低，表明其結(jié)構(gòu)含量也降低。在1 682 cm-1附近有新增子峰，表明茁-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量明顯增加。1 647 cm-1峰相對強度增加，表明無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量的增加。對酰胺Ⅰ帶去卷積譜進(jìn)行曲線擬合，計算出各電場處理條件下脂肪酶二級結(jié)構(gòu)含量，如表1所示。

表1　不同電場強度處理后的脂肪酶二級結(jié)構(gòu)含量Table 1Contents of secondary structures of lipase treated by electric field with different strength

圖2是脂肪酶在不同電場強度下各二級結(jié)構(gòu)含量相對對照組的變化。與對照組相比，電場處理后：

1）琢-螺旋含量降低，降幅在4.9%～10.9%，并且隨著電場強度增加，其降幅不同，在1.0、6.0 kV/cm和3.0 kV/cm時降幅較大。

2）茁-折疊含量有不同程度減少，降幅在3.2%～22.6%，其中場強為3.0 kV/cm時降幅最大，6.0 kV/ cm時降幅最小。

3）茁-轉(zhuǎn)角含量大幅度增加，增幅在12.5%～37.7%，其中場強3.0 kV/cm時增幅最大，6.0 kV/cm時增幅最小。

4）電場的作用使無規(guī)卷曲含量不同程度的增加，增幅在3.1%～24%，其中以3.0 kV/cm時增幅最大，6.0 kV/cm時增幅最小。

圖2　不同電場強度下脂肪酶二級結(jié)構(gòu)相對變化量Fig.2Relative change of secondary structure content of lipase treated with electric field of different strength

總體而言，脂肪酶經(jīng)不同電場強度處理后，其二級結(jié)構(gòu)各單元面積分?jǐn)?shù)有不同程度的變化，且其變化規(guī)律呈非單調(diào)型變化。電場具有使脂肪酶的二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-折疊向β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化的作用。這與CD光譜法研究的結(jié)果一致［18］。

2.3脂肪酶二級結(jié)構(gòu)與活性變化關(guān)系

脂肪酶經(jīng)不同強度電場處理后，其活性有不同程度的變化。圖3是處理組相對對照組脂肪酶活性的變化規(guī)律?？梢钥闯?，經(jīng)不同電場強度處理后脂肪酶活性都有較大幅度增加，并在3.0 kV/cm和4.0 kV/cm電場強度條件時活性增加幅度較大。

圖3　不同電場強度下脂肪酶活性的相對變化量Fig.3Relative change of lipase activity treated with electric field of different strength

電場處理后脂肪酶相對活性的增加與其二級結(jié)構(gòu)含量的變化有一定的相關(guān)性。隨著電場強度的增加，α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)的含量變化規(guī)律與脂肪酶活性的變化規(guī)律呈負(fù)相關(guān)，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量變化與酶活性呈正相關(guān)。并且在3.0 kV/cm場強條件時，脂肪酶結(jié)構(gòu)含量和活性均出現(xiàn)了明顯的變化。

3　討論

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是指多肽鏈骨架中局部肽段的構(gòu)象。α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)中存在較多的氫鍵，其作用使得規(guī)則二級結(jié)構(gòu)具有一定的穩(wěn)定性和剛性。無規(guī)卷曲中氫鍵只有很弱的作用，使肽段中的各個殘基間有更大的自由度，從而表現(xiàn)出極大的柔性。蛋白質(zhì)分子中α-螺旋和β-折疊的穩(wěn)定性主要取決于分子內(nèi)部的氫鍵。電場作用導(dǎo)致脂肪酶二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋與β-折疊含量減少，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲含量增加。這表明電場的作用影響了脂肪酶蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的電荷分布，使原有維系其螺旋和折疊結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的氫鍵取向發(fā)生改變，穩(wěn)定性降低，柔性加大。除此以外，脂肪酶的催化活性中心是由Ser-His-Asp/Glu組成的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)構(gòu)成，而催化部位被埋在分子中，表面被對它們起保護(hù)作用的α-螺旋蓋狀結(jié)構(gòu)覆蓋。脂肪酶“蓋子”結(jié)構(gòu)不僅影響酶活性，而且影響酶底物的特異性和穩(wěn)定性。電場作用可能導(dǎo)致了脂肪酶二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋蓋狀結(jié)構(gòu)被打開，將活性中心暴露出來，從而底物能夠更靠近活性中心，催化過程得以進(jìn)行。

4　結(jié)語

目前，人們對生物大分子的電磁效應(yīng)研究較為普遍。然而，由于生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能的特異性，對其處理條件、劑量和時效性的研究仍存在不同的意見。作者研究結(jié)果表明，50 Hz高壓電場處理脂肪酶5 min，具有使脂肪酶的二級結(jié)構(gòu)由α－螺旋、β－折疊向β－轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化的作用，且對不同結(jié)構(gòu)含量和活性的影響均呈非單調(diào)性變化。脂肪酶在3.0 kV/cm場強處理條件下表現(xiàn)出其結(jié)構(gòu)含量和活性變化幅度較大。這說明3.0 kV/cm電場強度處理條件對脂肪酶催化功能起到了較好的促進(jìn)作用。因此3.0 kV/cm電場強度可作為最佳處理條件。電場處理對蛋白酶時效性的影響還有待于進(jìn)一步深入研究。

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Study on the Effect of Electric Field on the Secondary Structure and Activity of Lipase

AO Dungerile1，YANG Tiqiang2，BAO Siqingaowa3，SHI Lei1
（1.School of Computer and Information，Inner Mongolia Medical University，Huhhot 010110，China；2.School of Physical Science and Technology，Inner Mongolia University，Huhhot 010021，China；3.School of Science，Inner Mongolia University of Technology，Huhhot 010051，China）

The changes in the secondary structures and activity of lipase after 5 min treatment using electric field with different strength were studied by FTIR（Fourier-transformation infrared spectroscopy）.The effect of electric field on the relative contents of the lipase secondary structures，i.e.α-helix，β-sheet，β-turn and random coil，varied within the range of 1.0 kV/cm to 6.0 kV/cm. Compared with the control groups，the relative contents of α-helix and β-sheet both decreased，namely，4.9%～10.9%for α-helix and 3.2%～22.6%for β-sheet respectively.The relative contents of β-turn and random coil increased instead，namely，12.5%～37.7%for β-turn and 3.1%～24%for random coil respectively.The most significant change of the relative contents for different secondary structure was observed at the 3.0 kV/cm electric field，which suggested the lipase activity was greatly improved after treatment by electric field.The improvement of the activity was related to the content increase of β-turn and random coil.

electric field，lipase，F(xiàn)TIR，secondary structure，activity

Q 683

A

1673—1689（2015）12—1256—06

2014-10-09

國家自然科學(xué)基金項目（30260028）；內(nèi)蒙古自治區(qū)重大科技項目（200508010101）。

敖敦格日樂（1980—），女，蒙古族，內(nèi)蒙古通遼人，理學(xué)碩士，講師，主要從事生物物理學(xué)研究。E-mail：adgrl@163.com

主題詞：電場；脂肪酶；紅外光譜；二級結(jié)構(gòu)；酶活性