仝艷軍，辛瑜，楊海麟，馮守帥，張玲，王武*

（1.江南大學(xué)教育部工業(yè)微生物技術(shù)重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

肌氨酸氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)及失活機(jī)理

仝艷軍1，2，辛瑜1，2，楊海麟1，2，馮守帥1，2，張玲1，2，王武*1，2

（1.江南大學(xué)教育部工業(yè)微生物技術(shù)重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

將來源于Bacillus sp.的肌氨酸氧化酶（SOX）基因在E.coli成功表達(dá)，并探索了肌氨酸氧化酶（sarcosine oxidase）酶學(xué)性質(zhì)和失活機(jī)理。Bacillus sp.的肌氨酸氧化酶基因克隆入載體pET28a，并轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）表達(dá)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8 h，對菌體破壁液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)在43 kDa處有明顯蛋白質(zhì)條帶。采用親和介質(zhì)分離純化獲得較高純度SOX。SOX酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果表明，其相對分子質(zhì)量為43.8 kDa，最適反應(yīng)溫度40℃，最適反應(yīng)pH值為8.0；20 mmol/L的Mn2+對SOX具有明顯激活作用；其動力學(xué)參數(shù)分析表明，肌氨酸作為底物時的Km值為141.6 mmol/L，Vmax為0.115 mmol/（L·min）。結(jié)合SDS-PAGE凝膠電泳、熒光光譜和圓二色性光譜分析，探明了液態(tài)SOX的失活機(jī)理。在37℃恒溫條件下，隨儲存時間延長，SOX酶分子內(nèi)部疏水基團(tuán)逐漸暴露且二級結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致酶分子變性以及最終酶活力下降。為進(jìn)一步提高SOX的酶活穩(wěn)定性提供了理論依據(jù)。

肌氨酸氧化酶；酶學(xué)性質(zhì)；失活機(jī)理

肌氨酸氧化酶（sarcosine oxidase；SOX；EC 1.5.3.1）屬于黃素蛋白質(zhì)，可偶聯(lián)肌酐酶和肌酸酶將肌酐降解為甘氨酸、甲醛和過氧化氫［1］。作為一種重要的診斷酶制劑，SOX被廣泛應(yīng)用于人體血清中肌酐水平的檢測，用來判斷腎功能的健康程度［2］。

肌酐檢測已成為醫(yī)療機(jī)構(gòu)常規(guī)的檢測項目，SOX臨床需要量較大。目前，采用基因工程實現(xiàn)SOX的異源高效表達(dá)是滿足其臨床診斷應(yīng)用的有效手段。E.coli作為常用的表達(dá)宿主菌，具有發(fā)酵成本低、產(chǎn)量高、易于操作、遺傳背景清楚、繁殖周期短和易于調(diào)控等諸多優(yōu)點，被普遍認(rèn)為是重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的首選體系［3-5］。尤其，由于不同生物來源的SOX酶學(xué)性質(zhì)差異較大，會直接影響其應(yīng)用效果，如相對分子質(zhì)量及亞基組成和蛋白質(zhì)組成等［6-9］。因此，深入探索SOX酶學(xué)性質(zhì)變得非常重要。此外，診斷酶試劑的穩(wěn)定性普遍較差也是限制該類酶制劑實際應(yīng)用的重要因素［10-12］。而翔實的酶分子失活機(jī)理研究是有效提高酶穩(wěn)定性的基本前提。

研究中將Bacillus sp.BSD-8來源的SOX在E. coli中進(jìn)行異源重組表達(dá)，采用親和層析獲得純度較高的目的蛋白質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，作者對SOX的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，并采用SDS-PAGE凝膠電泳、熒光光譜和圓二色性光譜等方法探討SOX的失活機(jī)理，為該SOX的穩(wěn)定性研究奠定了理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌株與質(zhì)粒

克隆宿主菌E.coli JM109，表達(dá)宿主菌E.coli BL21（DE3）和重組菌E.coli JM109/pUC57-sox，由作者所在實驗室保藏；質(zhì)粒pET28a，購自Novagen公司。

1.2主要材料

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ，Hind III，T4 DNA連接酶，Taq DNA聚合酶，250 bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品，均購自TaKaRa公司（大連）；膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，IPTG，卡那霉素，均購自上海生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。

1.3主要儀器

電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械五廠制造；F-7000型熒光分光光度儀，日立公司制造；蛋白質(zhì)電泳儀，美國BIO-RAD公司制造；MOS-450 AF圓二色性光譜儀，法國Bio-Logic公司制造；pHS-3TC型pH計，德國賽多利斯股份有限公司制造。

1.4肌氨酸氧化酶基因工程菌的構(gòu)建

重組質(zhì)粒的構(gòu)建策略如圖1所示。將含有pET28a載體的重組菌和含有pUC57-sox的重組菌分別接種于含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)過夜，將得到的菌液用于質(zhì)粒的提取。經(jīng)PCR擴(kuò)增純化后的目的基因和pET28a質(zhì)粒分別經(jīng)EcoRⅠ和Hind III雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后分別純化回收。在16℃，T4 DNA連接酶的作用下連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，在含100 μg/mL Kan的LB平板上選取陽性轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切電泳鑒定；并挑取陽性克隆送上海生物工程有限公司測序。將經(jīng)過測序鑒定正確的重組質(zhì)粒pET28a-sox轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含有Kan的LB固體培養(yǎng)基中，并挑取重組轉(zhuǎn)化子單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

圖1　重組表達(dá)載體pET28a-sox的構(gòu)建流程Fig.1Construction of recombinant plasmids pET28a-sox

1.5重組質(zhì)粒在E.coli中的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取陽性E.coli重組轉(zhuǎn)化子單菌落接種于50 mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基，于37℃，200 r/min振蕩過夜。按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量轉(zhuǎn)接于50 mL含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃200 r/min振蕩至菌體濃度OD600約為0.6～0.8，加入IPTG達(dá)到終濃度為1 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)8 h。8 000 r/min，4℃離心5 min收集菌體，用20 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液洗滌懸浮菌體，冰水浴超聲破碎菌體，獲得待測酶液。同時以不加IPTG誘導(dǎo)的重組菌和一個經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的非重組菌作為對照，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳鑒定。

1.6肌氨酸氧化酶酶活測定

以肌氨酸為底物，參照文獻(xiàn)方法測定［13］，取50 μL不同濃度的SOX酶液，分別加入3 mL顯色液于1 mmol/L的4-氨基安替比林、6 mmol/L的苯酚、7 000 U/L的辣根過氧化物酶、20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）中，混勻后加入150 μL肌氨酸（0.2 mol/L），振蕩混勻，于37℃水浴反應(yīng)5 min，結(jié)束后沸水浴煮沸3 min終止反應(yīng)，冷卻，于500 nm下測定吸光度。酶活單位定義為：在37℃下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmoL肌氨酸產(chǎn)生甲醛所需的酶量定義為1個酶活單位（U）。

1.7重組肌氨酸氧化酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)

1.7.1肌氨酸氧化酶的純化從固體平板挑取單菌落，接入種子培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。按照體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃，200 r/min培養(yǎng)至OD6000.6～0.8后，采用1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)8 h。菌液破壁離心后，取酶上清液進(jìn)行純化，參照文獻(xiàn)［14］，純化后的酶液置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2酶的最適反應(yīng)溫度和最適pH值的測定在pH 8.0、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液體系中，在20～80℃范圍內(nèi)測定不同溫度下的酶活力，觀察溫度對酶活性的影響，以確定酶的最適反應(yīng)溫度；在不同pH的反應(yīng)體系（pH 4.0～11.0）中測定SOX的酶活力，以酶活力最高的記為100%，計算其他pH條件下的相對酶活力，確定酶促反應(yīng)的最適pH。不同pH的緩沖液體系為檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.0～5.0），磷酸-磷酸鉀緩沖液（pH 6.0～7.0），Tris-HCl緩沖液（pH 8.0～9.0），碳酸氫鈉-NaOH緩沖液（pH 10.0～11.0）。

1.7.3酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性分析在pH 8.0、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液體系中，0～80℃系列梯度范圍內(nèi)保溫10 min，測定其對應(yīng)的剩余酶活力，以觀察酶的熱穩(wěn)定性。另外，將一定量的酶液分別置于一系列不同pH的緩沖液中，37℃放置2.5 h后，測定其對應(yīng)的剩余酶活力，以觀察酶的pH穩(wěn)定性。不同pH的緩沖液體系同1.7.2。

1.7.4金屬離子對酶活力影響的測定在不同反應(yīng)體系中分別加入不同的金屬離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe3+、Co2+、Cu2+和Zn2+，設(shè)置3個終濃度梯度為2.0、20、100 mmol/L，分別混勻在37℃水浴中保溫2.5 h，測定各組酶活力。以未加入金屬離子的酶液的活性為100%，計算各組的相對酶活力，以觀察金屬離子對酶活性的影響。

1.7.5SOX酶動力學(xué)參數(shù)的測定用pH 8.0的Tris-HCl緩沖液配制濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mmol/L的肌氨酸溶液，于37℃反應(yīng)5 min的條件下測定SOX在不同肌氨酸濃度時的初始氧化活力。得到反應(yīng)速度V和1/V。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，以1/［S］為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)作圖，計算SOX對肌氨酸的Km和Vmax。

1.8肌氨酸氧化酶失活機(jī)理的分析方法

1.8.1SOX酶活力測定酶活力12 U/mL、pH 8.0的SOX酶液置于37℃恒溫水浴中，定時取樣測定其剩余酶活，設(shè)水浴前SOX酶液的酶活力為100%，計算37℃放置不同時間后的酶活保留率，重復(fù)3次取平均值。

1.8.2SDS-PAGE凝膠電泳分析酶活力12 U/ mL、pH 8.0的SOX酶液置于37℃恒溫水浴中，定時取樣進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，水浴前SOX酶分子溶液樣品作為對照，檢測SOX酶分子在儲存過程中是否存在聚集或降解現(xiàn)象。

1.8.3熒光光譜鑒定利用F-7000型熒光分光光度計對37℃儲存不同時間的SOX酶溶液內(nèi)源熒光及FAD熒光光譜進(jìn)行分析。內(nèi)源熒光實驗條件為：激發(fā)波長280 nm，掃描范圍280～400 nm，狹縫寬度5.0 nm，檢測步長1 nm。FAD輔基熒光實驗條件為：激發(fā)波長460 nm，掃描范圍460～620 nm，狹縫寬度5.0 nm，檢測步長1 nm。

1.8.4圓二色性光譜分析使用MOS-450AF圓二色性光譜儀對37℃儲存不同時間的SOX酶液進(jìn)行分析，掃描范圍為200～250 nm，檢測步長1 nm，響應(yīng)時間2 s，狹縫寬度4.0 nm，比色皿寬度1 mm，以不含有SOX的相同緩沖液體系為背景，測定橢圓率（θ），計算摩爾橢圓率［θ］。

2　結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒鑒定及目的產(chǎn)物誘導(dǎo)表達(dá)

2.1.1重組質(zhì)粒的鑒定將全合成的sox基因成功構(gòu)建在pUC57載體，以pUC57-sox為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增的目的條帶和pET28a質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Hind III雙酶切純化后連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-sox。從轉(zhuǎn)化子中提取重組質(zhì)粒pET28asox，采用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind III進(jìn)行雙酶切驗證，同時重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，泳道2為雙酶切后的重組質(zhì)粒，在1 000 bp和5 000 bp處出現(xiàn)兩條特異性條帶，分別對應(yīng)sox和pET28a片段。該結(jié)果初步驗證了重組質(zhì)粒pET28a-sox已成功構(gòu)建。

2.1.2目的產(chǎn)物的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體經(jīng)超聲破碎處理，獲得粗酶液并進(jìn)行SOX酶活的測定和SDS-PAGE分析。如圖3所示。E.coli BL21（DE3）/pET28a-sox菌體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，其細(xì)胞破壁液中發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量約43 kDa蛋白質(zhì)特異條帶，表達(dá)量約占總細(xì)胞蛋白質(zhì)的30%，SOX在E.coli中已成功表達(dá)。后續(xù)實驗采用乳糖優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)，其產(chǎn)酶水平和生產(chǎn)強(qiáng)度可達(dá)4.0 U/mL和91.2 U/（L·h）。

圖2　重組質(zhì)粒pET28a-sox的雙酶切與PCR驗證Fig.2Identification of expression plasmid pET28a-sox by restriction digestion and PCR

圖3　表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3Analysis of SOX expression by SDS-PAGE

2.2重組肌氨酸氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)2.2.1重組肌氨酸氧化酶的純化收集濕菌體后，采用20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）清洗后離心，去除上清液后重新將菌體懸浮于20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）中超聲波破碎。破壁條件為4 min/1 min（超聲時間/間歇時間），破壁時間為20 min，至溶液變澄清，即獲得粗酶液。采用Sepharose-4-氨基吡咯-2-羧酸親和層析純化SOX；用20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）平衡親和層析柱，再將粗酶液進(jìn)樣層析柱，采用0.03 mol/L NaCl/20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）洗脫目的蛋白質(zhì)，純化經(jīng)SDS-PAGE分析，如圖4（a）所示，在相對分子質(zhì)量43 kDa處有明顯單一蛋白質(zhì)條帶。經(jīng)Sephrose-4-氨基吡咯-2-羧酸親和純化，粗酶液中雜蛋白質(zhì)基本除去，純化的SOX達(dá)到電泳純，比酶活為30.8U/mg，酶活回收率91.2%。采用MALDI-TOF對SOX相對分子質(zhì)量進(jìn)行鑒定，結(jié)果見圖4（b），該重組蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量43.8 kDa，與來源Bacillus sp.B-0618的SOX（43 839 Da）相近［15］；純化后的樣品置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖4　純化的肌氨酸氧化酶的SDS-PAGE圖譜及質(zhì)譜鑒定圖譜Fig.4SDS-PAGE and mass spectrum analysis of purified SOX

2.2.2SOX最適反應(yīng)溫度和pH值溫度和pH值是影響酶反應(yīng)速率的重要因素，酶分子只在一定溫度和pH范圍內(nèi)具有酶活性，對Bacillus sp.SOX的最適反應(yīng)溫度和最適pH值進(jìn)行分析。由圖5（a）可知，該SOX在20～80℃范圍內(nèi)均具有一定的酶活性，其最適反應(yīng)溫度為40℃。由圖5（b）可知，在pH 8.0～11.0范圍內(nèi)，該重組酶具有較高的酶活力，在pH 8.0和pH 11.0的反應(yīng)體系中可以獲得相同的酶活。據(jù)文獻(xiàn)報道［7，16］，SOX在催化底物時，肌氨酸以兼性離子形式結(jié)合于SOX活性中心；而在脫甲基氧化過程中，肌氨酸則是以陰離子形式存在。底物的結(jié)合受到pKa 7.4和10.2兩個離子化參數(shù)的影響。對于肌氨酸其α-氨基的解離常數(shù)pKa為10.01，在pH 8.0的體系中，肌氨酸以適宜濃度的兼性離子存在，促進(jìn)酶與底物的結(jié)合；在pH 11.0的體系中，肌氨酸其α-氨基已去質(zhì)子化狀態(tài)，以較適濃度的陰離子形式存在，促進(jìn)催化作用的進(jìn)行。因此SOX在pH 8.0和pH 11.0的體系中呈現(xiàn)較高的酶活力。

圖5　溫度及pH對SOX酶活力的影響Fig.5Effect of temperature and pH on SOX activity

2.2.3SOX的熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性酶液置于0～80℃不同水浴溫度保溫10 min，如圖6（a）所示，SOX在50℃以下具有較好的熱穩(wěn)定性，剩余酶活可以保持在80%以上。將SOX在不同的pH體系下37℃放置2.5 h，如圖6（b）所示，SOX在pH 7.0～10.0體系中具有較好的pH穩(wěn)定性，37℃下放置2.5 h，其剩余酶活仍保持在80%以上。在50℃以下或者pH 7.0～10.0體系中，SOX均可以保持其正確的空間構(gòu)象。

圖6　SOX的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性分析Fig.6Analysis on thermal stability and pH stability of SOX

2.2.4金屬離子對肌氨酸氧化酶活性的影響SOX

對不同金屬離子的耐受性具有較大的差異，SOX在不同濃度（2.0、20、100 mmol/L）金屬離子體系中放置2.5 h（37℃）后，結(jié)果如圖7所示。不同濃度的Na+、K+及Ca2+對SOX酶活力基本沒有影響；Mn2+和Mg2+對SOX酶活力具有不同程度的激活作用，并呈現(xiàn)不同的變化趨勢；Mg2+對SOX酶活力的激活作用隨著Mg2+濃度的增加而減小；而Mn2+的激活作用隨著Mn2+濃度的增加先增加后減小，在20 mmol/L的體系下其相對酶活力達(dá)到最大為145.7%。Fe3+在低濃度下對酶活性基本沒有影響，Zn2+和Cu2+對SOX酶活力均有較強(qiáng)的抑制作用，在Zn2+和Cu2+體系中，SOX均出現(xiàn)了聚沉現(xiàn)象。Co2+在低濃度體系中對酶活性基本沒有影響，并在20 mmol/L的體系具有激活作用，其相對酶活力可以達(dá)到126.9%，然而在100 mmol/L的體系中則表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用并出現(xiàn)聚沉現(xiàn)象。某些金屬離子在合適的濃度范圍內(nèi)，可能通過與酶表面的原子或基團(tuán)發(fā)生相互作用而使SOX的構(gòu)象發(fā)生一定的變化，使酶分子中的電子傳遞進(jìn)行得更加流暢，因而表現(xiàn)為激活作用［17］。而某些金屬離子如Zn2+和Cu2+表現(xiàn)為強(qiáng)烈的抑制作用，則可能是由于Zn2+和Cu2+可導(dǎo)致酶分子疏水基團(tuán)的暴露，導(dǎo)致聚集的發(fā)生和酶蛋白質(zhì)的失活。其作用和其他Ca2+、Mg2+和Mn2+等二價金屬離子不同，可能與Zn2+和Cu2+特殊的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)［18］。

圖7　不同金屬離子對SOX酶活力的影響Fig.7Effect of various metal ions on the activity of SOX

2.2.5動力學(xué)參數(shù)的測定米式常數(shù)Km是酶的一個特征常數(shù)，可用于判斷酶的專一性，Km值越小，說明酶與底物的親和力越大，該底物越適宜作為該酶的天然底物。在pH 8.0條件下，SOX（10 U/mL）與1～10 mmol/L濃度梯度的肌氨酸于37℃反應(yīng)5 min，測定SOX酶活力。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法繪圖，結(jié)果如圖8所示，其米氏方程為

相關(guān)系數(shù)為0.994 7；計算得Bacillus sp SOX對肌氨酸的Km及Vmax值分別為141.6 mmol/L和0.115 mmol/（L·min）。來源不同的SOX對肌氨酸的Km值具有一定的差異性，如來源于Corynebacterium的SOX對肌氨酸的Km值為21 mmol/L［19］。

2.3肌氨酸氧化酶失活機(jī)理2.3.1SOX酶分子失活的表觀現(xiàn)象造成酶分子不穩(wěn)定的因素有很多，如氨基酸消旋、脫酰胺、氧化，溫度和pH等。通過對SOX酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，SOX在pH 8.0～10.0之間相對穩(wěn)定，選擇酶活力12 U/mL，pH 8.0，37℃的條件下觀察酶失活現(xiàn)象。如圖9（a）所示，隨著儲存時間的延長，酶活保留率逐漸降低；在前3 d內(nèi)，酶活保留率下降速度緩慢，約下降了18%，而后的4 d內(nèi)酶活保留率下降較為明顯，到7 d時下降至7.9%。SOX在儲存過程中，隨著儲存時間的延長出現(xiàn)沉淀；經(jīng)同步SDS-PAGE凝膠電泳分析（見圖9（b）），在SOX失活過程中，表現(xiàn)為目的條帶逐漸變細(xì)，并出現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象。

圖8　SOX的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig.8Lineweaver-Burk graph of recombinant SOX

圖9　SOX的儲存穩(wěn)定性曲線及SDS-PAGE凝膠電泳分析Fig.9The weakening of SOX enzymatic stability and protein banding at different storage period

2.3.2疏水基團(tuán)暴露性分析通過內(nèi)源熒光光譜法測定酶分子內(nèi)部發(fā)色基團(tuán)的變化，表征其結(jié)構(gòu)的變化。酶分子中能發(fā)生熒光的氨基酸殘基有Trp、Tyr和Phe殘基，由于能量的轉(zhuǎn)移和傳遞，酶分子的熒光主要表現(xiàn)為Trp和Tyr殘基。SOX由387個氨基酸殘基組成，其中含有3個Trp和21個Tyr殘基；FAD作為SOX的輔基，含有異咯嗪環(huán)，有長共軛結(jié)構(gòu)的π—π*躍遷，具有熒光性［20］。在酶分子結(jié)構(gòu)解折疊時，內(nèi)源性的疏水性殘基（Trp和Tyr）逐步暴露出來，導(dǎo)致Trp和Tyr殘基周圍的微環(huán)境的極性逐漸增強(qiáng)，酶分子的最大發(fā)射波長發(fā)生移動（熒光光譜紅移）；另外，伴隨疏水基團(tuán)的暴露，熒光強(qiáng)度逐漸上升。如圖10所示，隨著儲存時間的延長，SOX的最大發(fā)射波長由328 nm移向338 nm，熒光光譜發(fā)生紅移，最大熒光強(qiáng)度也逐漸增加，并在儲存3 d時趨于穩(wěn)定。

圖10　儲存不同時間的SOX的熒光光譜圖分析Fig.10Analysis of flurorescence on SOX under different storage period

SOX酶分子在儲存7 d之內(nèi)，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本暴露，二級結(jié)構(gòu)基本喪失，F(xiàn)AD輔基基本暴露；如圖11所示，F(xiàn)AD的最大發(fā)射波長未發(fā)生偏移，最大熒光強(qiáng)度在儲存3 d后略有增加，表示FAD逐漸暴露于溶液中。通常SOX與FAD結(jié)合摩爾比為1∶1，大腸桿菌不能為SOX提供充足的FAD，而且FAD自身不能進(jìn)入細(xì)胞，只能通過將核黃素運輸至胞內(nèi)，并經(jīng)濃縮和磷酸化作用轉(zhuǎn)化為FAD輔基［21-22］，推斷SOX大量表達(dá)的過程中，由于FAD合成速度有限，SOX未能完全結(jié)合FAD輔基。綜上所述，推斷SOX在儲存過程中，SOX疏水基團(tuán)逐漸暴露在溶液中，隨之酶活性逐漸降低，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；另外，大腸桿菌表達(dá)過程中未能提供足量的FAD，表達(dá)的SOX未能充分結(jié)合FAD輔基。

圖11　儲存不同時間的FAD的熒光光譜圖分析Fig.11Analysis of flurorescence on FAD under different storage period

2.3.3二級構(gòu)象的變化酶分子中光活性發(fā)色基團(tuán)的不對稱性及折疊結(jié)構(gòu)的差異性會引起左右兩圓偏振光具有不同的光吸收，表現(xiàn)為圓二色性，常用于溶液中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的研究。在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋在208 nm和222 nm處有兩個負(fù)的特征吸收峰，β-折疊在216 nm處有一負(fù)光譜帶，β-轉(zhuǎn)角在206 nm附近有一正吸收峰［23］。將置于37℃保溫不同時間的SOX酶液進(jìn)行圓二色性光譜分析，結(jié)果如圖12所示，SOX初始時的二級結(jié)構(gòu)特征吸收峰較為完整，但37℃恒溫水浴放置7 d后，SOX酶分子的二級結(jié)構(gòu)特征吸收峰完整性降低，天然構(gòu)象破壞，酶分子活性降低，其剩余的相對酶活不足10%。

圖12　不同儲存時間下SOX酶分子的圓二色性光譜分析Fig.12Analysis of circular dichroism of SOX in far-UV region under different storage periods

3　結(jié)語

肌氨酸氧化酶在臨床診斷具有重要的應(yīng)用價值。研究采用基因工程技術(shù)，實現(xiàn)了Bacillus sp.肌氨酸氧化酶的異源高效表達(dá)。SOX酶學(xué)性質(zhì)分析表明，Bacillus sp.肌氨酸氧化酶為單亞基的蛋白質(zhì)，肽鏈相對分子質(zhì)量為43.8 kDa，最適反應(yīng)溫度為40℃，最適反應(yīng)pH為8.0；SOX的動力學(xué)參數(shù)分析表明，在以肌氨酸為底物時，Km值為141.6 mmol/L，Vmax為0.115 mmol/（L·min）。結(jié)合SDS-PAGE凝膠電泳、熒光光譜和圓二色性光譜等方法，研究了液態(tài)SOX的失活機(jī)理。來源于Bacillus sp.的SOX酶液于37℃恒溫放置過程中，SOX酶分子內(nèi)部疏水基團(tuán)逐漸暴露，同時二級結(jié)構(gòu)逐漸破壞，SOX酶分子變性，導(dǎo)致酶活力下降。SOX失活機(jī)理的探明，為后續(xù)提高SOX的穩(wěn)定性奠定了理論基礎(chǔ)。

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On the Enzymatic Properties and Deactivation Mechanism of Sarcosine Oxidase

TONGYanjun，XINYu，YANGHailin，F(xiàn)ENGShoushuai，ZHANGLing，WANGWu*
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The sarcosine oxidase（SOX）gene from Bacillus sp.was expressed in E.coli，and the properties and deactivation mechanism were further analyzed.After transformation of the cloned DNA into host E.coli BL21（DE3），the SOX gene was induced by IPTG for 8 h，a protein band of 43 kDa appeared in SDS-PAGE electrophoresis.From the crude enzyme solution，SOX in high purity was obtained through affinitive separation and purification.The analytic results of enzymatic properties showed that its relative molecular mass was 43.8 kDa，and its optimum reactiontemperature and pH value were 40℃and 8.0，respectively.Moreover，20 mmol/L Mn2+exhibited an obvious activation effects on recombinant SOX.The kinetic parameters of Km and Vmax were determined as 141.6 mmol/L and 0.115 mmol/（L·min）when sarcosine used as a substrate.With the SDS-PAGE gel electrophoresis，fluorescence and circular dichroism spectroscopy，the deactivation mechanism of SOX was further studied.At constant temperature 37℃，the internal hydrophobic group of SOX molecule was gradually exposed and its secondary structure was destroyed along with the prolonged storage time，leading to the denaturation of SOX protein and the lowering down of its activity.The above results provide a theoretical basis for improving SOX stability in future.

sarcosine oxidase，enzymatic properties，deactivation mechanism

Q 783

A

1673—1689（2015）12—1239—09

2014-10-29

國家自然科學(xué)基金項目（21306064）；江蘇省創(chuàng)新計劃項目（CXZZ12_0752）；江南大學(xué)博士研究生科學(xué)研究基金項目（JUDCF12013）。

仝艷軍（1986—），女，山東荷澤人，工學(xué)博士，食品科學(xué)與工程博士后，主要從事耐熱肌氨酸氧化酶基因表達(dá)、純化及酶穩(wěn)定性研究。E-mail：yanjun1986927@163.com

王武（1952—），女，福建福州人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事酶分子改造，遺傳工程和發(fā)酵工程研究。

E-mail：bioprocessor@aliyun.com；wangwu@jiangnan.edu.cn