王齊瑋， 吳 寧， 杜官本， 李曉平,*， 李文均

（1.云南省木材膠黏劑及膠合制品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；2. 云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 云南省微生物研究所，云南 昆明 650091）

果膠是一種多糖類物質(zhì)，在植物中含量較少但非常重要，主要分布在植物細(xì)胞的胞間層和初生壁中，起著粘結(jié)植物細(xì)胞的作用。果膠在植物細(xì)胞組織中與纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)等相互交聯(lián)，使細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)堅(jiān)強(qiáng)，表現(xiàn)出固有的形態(tài)[1]。

果膠酶就是指可以分解果膠的一類酶的總稱，許多霉菌及少量的細(xì)菌和酵母菌都可產(chǎn)生果膠酶，主要以曲霉和桿菌為主[2-4]。傳統(tǒng)的纖維分離和纖維素提純通常是采用酸堿處理、熱磨法、爆破法、機(jī)械法和傳統(tǒng)微生物法等，不僅需要專門的設(shè)備、耗時(shí)耗能、還會形成二次污染。果膠酶被研究應(yīng)用于紡織、造紙等領(lǐng)域[5-7]，但僅在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)取得了成功，其根本原因就是木質(zhì)材料中復(fù)雜的化學(xué)成分容易導(dǎo)致果膠酶失去活性、不能發(fā)揮作用，導(dǎo)致將果膠酶應(yīng)用于紡織、造紙等領(lǐng)域時(shí)成本高、效率低、質(zhì)量不穩(wěn)定；另外木質(zhì)材料的自然pH值一般在5.5～6.5范圍內(nèi)，而現(xiàn)有果膠酶最適pH值一般在3.5～4.0范圍；為了篩選出適于木材加工用的果膠酶，項(xiàng)目組嘗試在工業(yè)大麻籽的內(nèi)生菌中尋找一株高產(chǎn)果膠酶的菌株，以期用于木材加工的領(lǐng)域。

內(nèi)生菌是一種特殊的微生物，其生活在植物體細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙這樣一個(gè)特殊環(huán)境中，植物與其內(nèi)生菌之間的內(nèi)生關(guān)系早在高等植物出現(xiàn)在地球上的時(shí)候就已開始發(fā)展。在高等植物漫長的演化過程中，其內(nèi)生菌與其宿主都在協(xié)同進(jìn)化，完全適應(yīng)宿主植物的內(nèi)部環(huán)境，若能利用該種微生物開發(fā)果膠酶，則有望制備出一種不受宿主植物任何化學(xué)成分影響，在纖維分離過程中可以保持其活性，實(shí)現(xiàn)高效利用的特種生物酶。本研究的目的就是從“云麻1號”大麻籽中篩選出一批果膠酶高產(chǎn)內(nèi)生菌株，為制備出一種適應(yīng)木質(zhì)材料自身pH環(huán)境，在pH5.5～5.8之間具有較高酶活性的木材加工專用果膠酶奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)中采用的實(shí)驗(yàn)材料包括大麻籽、工業(yè)大麻稈和果膠酶，具體如下：

大麻籽和工業(yè)大麻稈，均選用“云麻1號”大麻籽和工業(yè)大麻稈，由云南工業(yè)大麻股份有限公司提供。

果膠酶：購買了市面上四種果膠酶，分別是德國 merck公司生產(chǎn)的果膠酶（適用 pH3.5～4.0；活性30 000 U/g），國產(chǎn)BBI公司生產(chǎn)的果膠酶（適用pH3.5～4.0；活性30 000 U/g），上海藍(lán)季公司生產(chǎn)的果膠酶（適用pH3.5～6.0，活性30 000 U/g）和南京都萊生物有限公司生產(chǎn)的果膠酶（適用pH3.5～4.0，活性30 000 U/g）。

1.2 方法

1）工業(yè)大麻籽內(nèi)生菌的分離純化：大麻籽經(jīng)過嚴(yán)格的表面消毒后[8]，置于墊有定性濾紙干燥的培養(yǎng)皿中，利用嚴(yán)格消過毒的粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，用竹簽夾起0.1～0.3 g均勻撒于MS分離培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)八周；用YIM38#培養(yǎng)基進(jìn)行菌株分離純化。MS培養(yǎng)基的配方為：1 000 mL培養(yǎng)基中的具體成分包括大量元素（母液1）50 mL，微量元素（母液2）5 mL，鐵鹽（母液3）5 mL，有機(jī)成分（母液4）5 mL，葡萄糖30 g，瓊脂粉14 g；YIM38#培養(yǎng)基的配方為：1 000 mL培養(yǎng)基中各化學(xué)成分的含量為微量鹽2 mL，酵母粉4 g，果膠4 g，麥芽粉3 g，瓊脂14 g。

2）果膠酶生產(chǎn)菌株的篩選：從分離純化好的菌株中用竹簽挑取菌株點(diǎn)在YIM38#培養(yǎng)基平板上，置于37℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后，加入1%碘溶液染色，染色30 min以后倒去碘溶液，再加濃度為 0.9%的生理鹽水，洗滌 1小時(shí)后觀察，菌落周圍有透明圈形成的即為可以生產(chǎn)果膠酶的菌株（如圖1所示），取透明圈與菌落直徑比較大的菌株進(jìn)一步進(jìn)行果膠酶的液體發(fā)酵以制備出酶液。

3）微生物的菌株鑒定：本實(shí)驗(yàn)所獲取的可以產(chǎn)果膠酶的菌株均為芽孢桿菌，所以采用16S rRNA法來進(jìn)行菌株的鑒定，鑒定的步驟具體如下：利用酶解法小量提取DNA[8]，選用 PA/PB 引物（PA: 5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’; PB:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增（94℃1 m；56℃ 30 s；72℃ 1 m，33個(gè)循環(huán)），擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠檢測后送上海生工進(jìn)行測序，序列回來之后經(jīng)EzTaxon-e網(wǎng)站進(jìn)行比對（http://eztaxon-e.ezbiocloud.net）[9]。

4）果膠酶液體發(fā)酵和酶活測定：利用液體發(fā)酵法制備果膠酶溶液，用無菌竹簽將菌齡 24 h、一個(gè)火柴頭大小的菌體挑入發(fā)酵液中，放入搖床搖72 h，設(shè)定溫度37℃，轉(zhuǎn)數(shù)200 r/min；果膠酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基所采用的培養(yǎng)基配方如下： 1 000 mL培養(yǎng)基中各化學(xué)成分的含量為酵母粉4 g，果膠0.4 g，葡萄糖3.6 g，麥芽粉3 g。采用DNS法進(jìn)行酶活測定[10]，向15 mL具塞試管中加入0.8 mL 1.0%的果膠溶液，于50℃水浴下保溫3 min，然后加入一定稀釋倍數(shù)的發(fā)酵上清液0.2 mL，反應(yīng)10 min，再加入DNS試劑3 mL，混勻，沸水浴10 min，立即冷卻定容至15 mL，540 nm測定吸光值?？瞻子弥蠓惺Щ畹陌l(fā)酵上清液代替。活力定義為：上述實(shí)驗(yàn)條件下，每小時(shí)水解果膠產(chǎn)生1 mg還原糖（以半乳糖醛酸計(jì)）所需酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U），測試pH值為5.5。另外選取南京都萊生物有限公司生產(chǎn)的果膠酶，測定不同pH值條件下（pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0）果膠酶的活性，分析不同pH值條件下果膠酶活性的變化情況，以此說明pH值對果膠酶活性的影響。

圖1 果膠酶陽性菌株產(chǎn)生的透明圈

5）果膠酶處理對工業(yè)大麻桿物理結(jié)構(gòu)的影響觀察：取2～5 mm長，2～3 mm寬，2～3 mm厚的工業(yè)大麻桿若干，分別放入自制果膠酶發(fā)酵液和市場上購買的四種果膠酶溶液中，50℃下水浴4 h，再放入104℃烘箱中烘4 h至其絕干，將處理后的樣品放在電子顯微鏡下觀察。采用的掃描電鏡為荷蘭FEI公司生產(chǎn)的環(huán)境掃描電鏡（型號Quanta200），噴鍍儀為日本日立公司（HITACHI）生產(chǎn)（型號E-1010）。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)果膠酶菌株的鑒定結(jié)果和酶活測定

利用MS培養(yǎng)基從工業(yè)大麻籽中獲得菌株60余株，主要為芽孢桿菌和鏈霉菌；利用碘染色法，初步篩選獲得10株產(chǎn)果膠酶的菌株，經(jīng)過液體發(fā)酵復(fù)篩得到7株產(chǎn)果膠酶的菌株，利用DNS法測得果膠酶的酶活，測試結(jié)果如表1所示，通過16S rRNA基因序列分析鑒定7株菌均屬于芽孢桿菌屬，具體菌種還有待進(jìn)一步鑒定。由表1可以看出，果膠酶的酶活在pH5.5條件下都不是很高，主要原因可能如下，首先采用的液體培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件沒有經(jīng)過優(yōu)化，第二菌株為從工業(yè)大麻籽內(nèi)生菌中篩選得到，沒有進(jìn)行果膠酶制備的定向培育和誘導(dǎo)，最后用于測試果膠酶的酶液是沒有經(jīng)過純化的粗果膠酶溶液。后面的研究將進(jìn)一步針對上述的不足進(jìn)行優(yōu)化和純化。

表1 菌株鑒定和酶活的測試結(jié)果

2.2 不同果膠酶處理對工業(yè)大麻桿物理結(jié)構(gòu)的影響

利用果膠酶活性最高的菌株HS032發(fā)酵制備的果膠酶溶液對工業(yè)大麻桿樣品進(jìn)行處理，利用掃描電鏡觀察自制果膠酶溶液的處理效果并與市場上購買到的4種果膠酶對工業(yè)大麻桿樣品的處理效果進(jìn)行對比，如圖2～圖7所示。

圖2 未經(jīng)處理的工業(yè)大麻桿結(jié)構(gòu)

圖3 大麻桿樣品經(jīng)HS032菌株果膠酶處理

圖4 大麻桿經(jīng)藍(lán)季果膠酶處理

圖5 大麻桿經(jīng)Merck果膠酶處理

圖6 大麻桿經(jīng)BBI果膠酶處理

圖7 大麻桿經(jīng)都萊果膠酶處理

由圖2可見，未經(jīng)果膠酶處理的工業(yè)大麻桿結(jié)構(gòu)致密，纖維之間排列整齊，經(jīng)過果膠酶溶液處理之后，纖維之間都出現(xiàn)了不同程度的剝離和分離如圖3～圖7所示。這是由于，工業(yè)大麻桿是一種生物質(zhì)材料，纖維細(xì)胞是其組成的基本結(jié)構(gòu)單元，纖維與纖維之間主要靠胞間層和初生壁連接，胞間層的粘結(jié)物質(zhì)主要是木質(zhì)素和果膠質(zhì)，初生壁中含有35%的果膠質(zhì)，利用果膠酶溶液對其進(jìn)行處理可以有效地降解纖維胞間層和初生壁中的果膠質(zhì)，從而達(dá)到纖維分離的目的，所以經(jīng)過果膠酶溶液處理后，工業(yè)大麻桿樣品中原來排列致密的纖維細(xì)胞之間都出現(xiàn)了不同程度的剝離和分離，但是由圖3～圖7中可知，經(jīng)工業(yè)大麻籽內(nèi)生菌HS032菌株發(fā)酵制備的果膠酶溶液處理后的工業(yè)大麻桿樣品其纖維的剝離程度最高，效果最好。而從市場上購買到的4種酶，對于工業(yè)大麻桿樣品均有一定程度的剝離，但其剝離效果均不如自制的酶液效果好。這主要是因?yàn)椋袌錾犀F(xiàn)有的果膠酶主要都用于食品加工，其適用的pH值范圍在3.5～4.0，而木質(zhì)材料的自然pH值范圍為5.5～6.0，下面將進(jìn)一步分析pH值對果膠酶活性的影響，以闡述開發(fā)木材加工專用果膠酶的重要性。

2.3 pH值對果膠酶活性的影響

圖8 pH值對果膠酶活性的影響

圖 8是利用南京都萊生物有限公司生產(chǎn)的果膠酶測得，由折線圖可以看出，pH4.0時(shí)果膠酶活性最高，隨著pH值從4.0升高值7.0，果膠酶酶活顯著降低，在pH7.0時(shí)果膠酶活性為0。由此可知原料酸堿性對果膠酶活性有很大的影響，木質(zhì)材料的自然 pH值一般在5.5～6.5范圍內(nèi)，而現(xiàn)有果膠酶則在pH值為3.5～4.0范圍內(nèi)時(shí)最高，所以不能夠?qū)δ举|(zhì)材料的纖維進(jìn)行顯著分離。同時(shí)木質(zhì)材料的化學(xué)成分非常復(fù)雜，有很大一部分化學(xué)成分比如木質(zhì)素、單寧、半纖維素等，可對普通的生物酶活性產(chǎn)生抑制作用，從而達(dá)到防治木質(zhì)材料生物降解和腐朽的目的；另外還有種類復(fù)雜，含量較少的無機(jī)鹽，均會對果膠酶的活性產(chǎn)生不利影響。但是，在高等植物漫長的演化過程中，其內(nèi)生菌與其宿主都在協(xié)同進(jìn)化，完全適應(yīng)宿主植物的內(nèi)部環(huán)境，若能利用該種微生物開發(fā)果膠酶，則有望制備出一種不受宿主植物任何化學(xué)成分影響，在纖維分離過程中可以保持其活性，應(yīng)用于木材加工；所以利用 HS032號菌株利用液體發(fā)酵制備的果膠酶溶液酶活不高，但是在與市場上夠得的4種果膠酶相比，其對工業(yè)大麻稈的分離效果最好。

3 結(jié)論

1）利用碘液初篩和液體發(fā)酵復(fù)篩，共從“云麻1號”大麻籽中篩選出7株產(chǎn)果膠酶的內(nèi)生菌菌株，通過16S rRNA基因序列分析，菌株初步鑒定為芽孢桿菌屬。

2）利用液體發(fā)酵，得到果膠酶的粗酶液，利用HS032號菌株的發(fā)酵液與市場上購買的4種果膠酶在相同條件下對工業(yè)大麻稈進(jìn)行處理，通過掃描電鏡觀察可以看到自制果膠酶的纖維分離效果最好，即工業(yè)大麻籽內(nèi)生菌產(chǎn)生的果膠酶對于工業(yè)大麻稈纖維細(xì)胞胞間層中的果膠降解效果最好。

3）市售來源于黑曲霉的果膠酶的活性受到環(huán)境酸堿性的影響非常顯著，在 pH4.0時(shí)果膠酶的活性最高，隨著pH值從4.0升至7.0，其活性迅速降低至0。

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