姜莉，王玉堂，周元，張強

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100）

紅米酒中多酚類化合物的高效液相色譜法測定

姜莉，王玉堂*，周元，張強

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100）

建立高效液相色譜同時測定紅米酒中11種多酚類化合物的方法。采用Venusil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，φ 5 μm）分離11種酚類物質(zhì)，流動相為50%乙腈和超純水，分別加1%乙酸，進(jìn)樣量20 μL，采用梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長260、320 nm。各組分的質(zhì)量濃度與其峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 6，且11種酚類物質(zhì)在45 min內(nèi)得到了較好分離。方法回收率在88.6%～102.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.76%～1.60%。本方法可用于紅米酒中多酚類化合物的快速分析。

高效液相色譜；黃酮；酚酸；紅米酒

紅米以其穎果皮具有紅色沉淀而得名，紅米品種稻主要集中在云南、廣西、湖南、貴州、廣東、江西等省。紅米含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、核黃素、生物活性物質(zhì)以及人體必需的微量元素Se、Zn、Fe、Mn、Ge等［1］，有研究表明，紅米中含有的微量元素硒、鋅等是普通稻米的2倍，并且VB1、VB2、脂肪、膳食纖維的含量也較普通稻米明顯高。它是藥食同源的滋補珍品［2］，具有較好的促進(jìn)健康預(yù)防疾病的營養(yǎng)保健功效。馬靜、陳起萱等的研究表明，紅米具有提高機體抗氧化能力，從而減少動脈壁細(xì)胞及其成分的氧化損傷［3］。紅米酒是將紅米通過一定的發(fā)酵工藝生產(chǎn)出的一種保健性米酒。在研究中發(fā)現(xiàn)，紅米酒中有一定的多酚類活性物質(zhì)，但鮮見有報道。黃酮、酚酸是多酚類化合物的總稱，具有抗氧化、延緩衰老、降血壓、防齲齒、防輻射、抗過敏、抗癌、抗血小板凝聚、消炎等功能特性［4］，在醫(yī)藥、食品添加劑等方面有廣泛用途。由于高效液相色譜具有分析時間短，結(jié)果準(zhǔn)確可靠等特點，近五年來得到迅速發(fā)展。利用高效液相色譜法對食品中黃酮、酚酸分析研究的文獻(xiàn)已有不少［5-9］。本研究采用HPLCDAD法，測定紅米酒中的黃酮、酚酸組成，并對其組分進(jìn)行定量分析，建立8種酚酸及3種黃酮類物質(zhì)的檢測方法，為紅米酒的保健功能提供參考。

1材料與方法

1.1材料

紅米酒：超市購買。

1.2試劑

沒食子酸、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、異槲皮素、槲皮素：均為標(biāo)準(zhǔn)品，均購于上海純優(yōu)生物科技有限公司；甲醇、乙腈、冰乙酸和乙酸乙酯為HPLC級：購于美國天地公司；試驗用水為二次蒸餾水和超純水：由西北農(nóng)業(yè)科技大學(xué)實驗管理處提供。

1.3儀器

液相色譜儀LC-20A高效液相色譜分析儀配紫外檢測器：日本島津；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；KQ-600DB數(shù)控超聲波清洗器：江蘇昆山超聲儀器公司；PHS-3C酸度計：上海雷磁精科儀器廠。

1.4色譜條件

色譜柱VenusilC18柱（250 mm×4.6 mm，φ 5 μm）；流動相A 100%水（含1%乙酸），B 50%乙腈（含1%乙酸），低壓梯度洗脫，流速1 mL/min，檢測波長260、320 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量為20 μL。

1.5方法

1.5.1紅米酒中理化指標(biāo)測定［10］

1.5.1.1pH的測定

使用兩點標(biāo)定法，即用pH 6.86和pH 4.00的緩沖液對PHS-3C型酸度計進(jìn)行標(biāo)定，然后測量紅米酒中pH，重復(fù)3次。

1.5.1.2總酸的測定

取20 mL樣液，置于150 mL燒杯中，加40 mL水在磁力攪拌的作用下，將標(biāo)定好的酸度計的電極浸入樣液中，邊攪拌邊滴加0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)，直至溶液pH=8.2。記錄消耗0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的毫升數(shù)。重復(fù)測定3次。

式中：X為每升樣品中酸的克數(shù)，g/L；M為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；V0為試樣的取樣量，mL；V1為滴定試液時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；F為試液的稀釋倍數(shù)；V2為空白試驗時消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；K為酸的換算系數(shù)。

1.5.1.3酒度測定

采用蒸餾法將一定量樣品進(jìn)行蒸餾，然后用酒精計直接測定其讀數(shù)。

1.5.1.4總糖測定

直接滴定法。

1.5.2多酚類物質(zhì)的提取

取紅米酒適量，用濃鹽酸調(diào)至pH=2.0，然后準(zhǔn)確吸取酒樣品10mL，加入20mL水，加入乙酸乙脂30mL，超聲輔助提取10 min，然后用分液漏斗進(jìn)行萃取，待分層完全后，將下層液再次進(jìn)行萃取，合并萃取液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干有機溶劑，干渣用2 mL 20%乙腈超聲輔助溶解，得到多酚樣品，用0.45 μm濾膜過濾，備用。

1.5.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品5mg，分別用甲醇定容至10mL得到每個標(biāo)準(zhǔn)品的貯備溶液500 mg/L，置于4℃冰箱中避光保存。分別移取1 mL各單個標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液混合用乙腈定容至50 mL，得到多酚混合標(biāo)準(zhǔn)品使用液，濃度為10 mg/L。

1.5.4樣品中各酚類物質(zhì)含量的測定

式中：X樣為樣品的各酚酸含量，mg/L；A樣為樣品的各峰面積；C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的各酚酸含量，mg/L；A標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的各峰面積；2/10為實際樣品用量。

2結(jié)果與分析

2.1紅米酒的理化指標(biāo)

對紅米酒中各項指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1　紅米酒的理化指標(biāo)Table 1Physical and chemical indexes of red rice wine

2.2色譜條件的選擇

2.2.1檢測波長的選擇

將11種500 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液配成50 mg/L的單標(biāo)工作液，分別進(jìn)行全波長掃描，得到各對照品的紫外吸收峰，以260、320 nm波長下出峰數(shù)及分離效果好。11種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

2.2.2流動相的選擇

文獻(xiàn)報道可以使用甲醇-水、乙腈-水等作為流動相分離酚酸。但是由于酚羥基、羧基在水溶液中發(fā)生電離，極性增強，在固定相表面形成雙重保留，易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。加入少量酸性試劑，可使多酚的電離受到抑制，以中性分子的形態(tài)存在，極性減弱，有利于增強在固定相上的保留，分離效果改善，不會出現(xiàn)峰拖尾的現(xiàn)象。經(jīng)過比較，本試驗選擇的流動相A為含1%乙酸的超純水，B為含1%乙酸的50%乙腈，獲得較好的分離效果。

圖111　種酚酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（260、320 nm）Fig.1Chromatograms of 11 standards at 260 nm and 320 nm

2.2.3洗脫梯度選擇

參考有關(guān)文獻(xiàn)，通過試驗對洗脫梯度進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)化洗脫程序是：0 min～3 min，B為10%；3 min～15 min，B為15%；15 min～25 min，B為50%；25 min～35 min，B為60%；35 min～45 min，B為80%；45 min～50 min，B為80%；50 min～51 min，回到初始狀態(tài)，B為10%；51 min～60 min用以平衡色譜柱，為下次進(jìn)樣做準(zhǔn)備。該梯度能較好的將11種黃酮、酚酸分離，并且峰型面積和保留時間均很穩(wěn)定。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別取儲備液適量，用甲醇配制0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在確定的色譜條件下進(jìn)樣分析，平行測定3次，以標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)，以平均峰面積為縱坐標(biāo)得到11種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2　標(biāo)準(zhǔn)曲線與相關(guān)系數(shù)Table 2Standard cueves with correlation coefficients

從表2可以看到，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 6，表明在此質(zhì)量范圍內(nèi)，各對照品質(zhì)量與峰面積相關(guān)性很好。

2.4精密度試驗

取質(zhì)量濃度為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)進(jìn)樣6次，求得各色譜峰相對峰面積的RSD在0.76%～1.60%之間，色譜峰的個數(shù)及特征沒有明顯變化，精密度較好，見表3。

表3　方法的精密度和紅米酒加標(biāo)回收率（n=6）Table 3Precision and recover rates of red rice wine

2.5加標(biāo)回收率試驗

準(zhǔn)確吸取紅米酒10 mL，加入2 mL的10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液，混勻后按照樣品處理的方法進(jìn)行處理，在色譜條件下重復(fù)3次，測得回收率見表3，加標(biāo)回收率在88.6%～102.5%之間，說明本方法回收率較好。

2.6紅米酒的組分分析

根據(jù)前述的樣品提取條件和色譜條件，對紅米酒中的黃酮和酚酸類物質(zhì)進(jìn)行組分分析，見表4。

從結(jié)果可以得到，紅米酒中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量差別較大，有8種酚酸和3種黃酮類物質(zhì)檢出，其中咖啡酸含量最高，為0.676 mg/L，結(jié)果見表4。

表4　紅米酒中黃酮、酚酸組分分析Table 4Contents of flavonoids and phenolic acids in red rice wine

3討論與結(jié)論

1）建立了可用于紅米酒中黃酮、酚酸類化合物分析的高效液相色譜方法。采用50%乙腈-超純水（含1%乙酸）為流動相，低壓梯度洗脫，使黃酮、酚酸等組分在45 min內(nèi)得到了較好分離。11種組分回收率在88.6%～102.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.76%～1.60%。表明樣品預(yù)處理方法可行。

2）通過對樣品的檢測，得到紅米酒中含有多種黃酮與酚酸類物質(zhì)。

3）試驗過程中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)種類有限，尚有多種酚類物質(zhì)未能確定，有待于進(jìn)一步研究。

4）本研究僅對一種紅米酒進(jìn)行了黃酮、酚酸組分分析，原料單一，隨后將對不同品種的原料生產(chǎn)出的米酒做進(jìn)一步研究。

［1］魏毅，靳西彪，楊海亮，等.紅米色素與微量元素硒之間關(guān)系的初步研究［J］.種子，2010，29（5）:1-4

［2］王麗華，葉小英，李杰勤，等.黑米、紅米的營養(yǎng)保健功效及其色素遺傳機制的研究進(jìn)展［J］.種子，2006，25（5）:50-54

［3］謝黎虹，羅玉坤，陳能.紅米和黑米的營養(yǎng)功效研究進(jìn)展［J］.糧油食品科技，2005，13（1）:53-54

［4］Revilla E，Ryan M.Analysis of several phenolic compounds with potential antioxidant properties in grape extracts and wines by high perform ance liquid chromatography photodiode array detecrion with out sample preparation［J］.Joumal of Chromatography A，2000，881（1/2）:461-469

［5］李永庫，李曉靜，歐小輝.固相萃取-高效液相色譜法同時測定葡萄酒中沒食子酸等8種多酚類化合物［J］.食品科學(xué)，2008，29（4）: 283-286

［6］方玲玲，肖作兵，牛云蔚，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定櫻桃酒中的5中酚酸［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（6）:172-176

［7］劉群濤，李崎，武千鈞，等.反相高效液相色譜法測定啤酒中的酚酸［J］.分析實驗室，2006，25（12）:68-70

［8］胡華，張惟廣，肖昭競，等.HPLC法測定醬油中的8種酚酸［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（8）:122-125

［9］孫崇臻，王超，蔡子哲，等.高效液相色譜測定蜂蜜中的脫落酸、黃酮和酚酸［J］.食品科學(xué)，2013，34（10）:281-285

［10］王華.葡萄與葡萄酒實驗技術(shù)操作規(guī)范［M］.西安:西安地圖出版社，1999:113-125

Determination of Polyphenolic Compounds in Red Rice Wine by High Performance Liquid Chromatography

JIANG Li，WANG Yu-tang*，ZHOU Yuan，ZHANG Qiang
（College of Food Science and Engineering，Northwest A&F University，Yangling 712100，Shaanxi，China）

A method was developed for the simultaneous determination of eleven polyphenolic compounds in red rice wine，they were separated by HPLC on a Venusil C18（250 mm×4.6 mm，φ5 μm）column 30℃，Gradient elution was employed with a moble phase consisting of 50%acetonitrile and water，and add to 1% acetic acid，a solvent flow rate of 1.0 mL/min and an injection volume of 20 μL.Eleven polyphenolic compounds were identified at 260 nm and 320 nm.The method showed good linear correlations between the concentration and areas of the eleven components with correlation coefficients greater than 0.999 6，and were separated well in 45 min.The average recoveries were 88.6%-102.5%，with relative standard deviations of 0.76%-1.60%. The method can be applied to the rapid determination of polyphenolic compounds in red rice wine.

high performance liquid chromatography；flavonoids；phenolic acids；red rice wine

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.032

2014-02-11

西北農(nóng)林科技大學(xué)大型儀器設(shè)備新功能開發(fā)項目（dysb130205）

姜莉（1968—），女（漢），高級實驗師，碩士，從事食品化學(xué)與分析的教學(xué)及研究。