肖嵐，李誠，付剛，余霞，杜昕，李曦染

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014；2.四川旅游學(xué)院食品科學(xué)系，四川成都610100）

5種蛋白酶對(duì)豬皮膠原蛋白水解效果的比較研究

肖嵐1，2，李誠1，*，付剛1，余霞1，杜昕1，李曦染1

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安625014；2.四川旅游學(xué)院食品科學(xué)系，四川成都610100）

以新鮮豬皮為原料，分別采用中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶5種不同蛋白酶水解膠原蛋白，以水解度（DH）和超氧陰離子自由基（O2－·）清除率為指標(biāo)，根據(jù)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化5種蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的最適條件；比較分析5種蛋白酶對(duì)豬皮膠原蛋白的水解效果。結(jié)果表明：5種蛋白酶對(duì)豬皮膠原蛋白的水解產(chǎn)物均具有抗氧化性，其水解產(chǎn)物對(duì)O2－·清除率依次為：胰蛋白酶水解產(chǎn)物＞中性蛋白酶水解產(chǎn)物＞胃蛋白酶水解產(chǎn)物＞菠蘿蛋白酶水解產(chǎn)物＞木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物。

中性蛋白酶；菠蘿蛋白酶；胃蛋白酶；木瓜蛋白酶；胰蛋白酶；水解度；O2－·清除率

豬皮資源價(jià)廉易得，豬皮中膠原蛋白含量豐富，但其特殊異味、不良口感、消化率低、加工不便等不利因素嚴(yán)重制約了豬皮資源在生物醫(yī)用領(lǐng)域、食品領(lǐng)域中的開發(fā)利用［1］。膠原蛋白水解產(chǎn)物中存在具有生理活性的肽，其作用包括抗氧化［2-3］、降血壓［4-5］、提高骨密度［6-7］、抑制血小板凝集［2］、降低膽固醇［2］等。目前膠原蛋白活性肽主要是通過體外消化膠原蛋白或明膠來獲得，包括高壓降解，酸、堿降解和酶法降解等；其中酶法制備膠原肽優(yōu)點(diǎn)最多，如安全性高、生產(chǎn)條件溫和，且選擇不同的蛋白酶、控制反應(yīng)條件就可以得到特定的活性肽，這為進(jìn)一步開發(fā)高附加值的產(chǎn)品奠定了良好的基礎(chǔ)［8］。但是，長(zhǎng)期以來，國(guó)內(nèi)［9-11］對(duì)制備膠原蛋白活性肽的蛋白酶的研究一直不夠深入，相關(guān)的研究工作也遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于國(guó)外［4-5，12］。

因此，本試驗(yàn)以豬皮為原料提取膠原蛋白，分別采用中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶對(duì)膠原蛋白水解制備抗氧化肽，以水解度（DH）和超氧陰離子自由基（O2－·）清除率為指標(biāo)，根據(jù)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化水解條件，比較分析5種不同蛋白酶在最適水解條件下對(duì)豬皮膠原蛋白的水解效果，為其應(yīng)用于抗氧化肽的制備提供理論參考和試驗(yàn)參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮豬皮，購于雅安市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶：廣西南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均符合國(guó)家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2儀器與設(shè)備

UV-3200紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；BR4i型多功能冷凍離心機(jī)：法國(guó)THERMO JOUAN公司。

1.3方法

1.3.1豬皮膠原蛋白的制備

根據(jù)前期試驗(yàn)確定的最佳工藝流程制備豬皮膠原蛋白［13-15］。

工藝流程：預(yù)處理→脫脂→水解→調(diào)節(jié)pH→過濾→濃縮→豬皮膠原蛋白

1.3.2豬皮膠原蛋白的水解

稱取一定量的膠原蛋白溶于蒸餾水中，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的膠原蛋白樣液作為水解底物，分別研究5種蛋白酶對(duì)底物的水解效果。選取酶與底物比、pH、水解溫度、底物質(zhì)量濃度、水解時(shí)間5個(gè)因素為自變量，以DH和O2－·清除率為應(yīng)變量，做單因素試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行豬皮膠原蛋白水解正交試驗(yàn)，以確定5種蛋白酶水解膠原蛋白的最適條件。

1.3.2.1菠蘿蛋白酶水解條件的研究

確定底物濃度為6%，選擇水解溫度（℃）、pH、水解時(shí)間（h）、酶與底物比（U/g）作為試驗(yàn)因子，以DH和O2－·清除率為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定菠蘿蛋白酶水解膠原蛋白的最適條件。正交試驗(yàn)表如表1。

表1　菠蘿蛋白酶正交試驗(yàn)因素水平表Table 1The factors of the orthogonal test of Bromelain

1.3.2.2木瓜蛋白酶水解條件的研究

確定底物濃度為6%，選擇水解溫度（℃）、pH、水解時(shí)間（h）、酶與底物比（U/g）作為試驗(yàn)因子，以DH和O2－·清除率為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定木瓜蛋白酶水解膠原蛋白的最適條件。正交試驗(yàn)表如表2。

表2　木瓜蛋白酶正交試驗(yàn)因素水平表Table 2The factors of the orthogonal test of Papain

1.3.2.3中性蛋白酶水解條件的研究

確定底物濃度為6%，選擇水解溫度（℃）、酶與底物比（U/g）、pH、水解時(shí)間（h）作為試驗(yàn)因子，以DH和O2－·清除率為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定中性蛋白酶水解膠原蛋白的最適條件。正交試驗(yàn)表如表3。

表3　中性蛋白酶正交試驗(yàn)因素水平表Table 3The factors of the orthogonal test of Neutral Protease

1.3.2.4胰蛋白酶水解條件的研究

確定底物濃度為10%，選擇pH、水解時(shí)間（h）、酶與底物比（U/g）、水解溫度（℃）作為試驗(yàn)因子，以DH和O2－·清除率為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定胰蛋白酶水解膠原蛋白的最適條件。正交試驗(yàn)表如表4。

表4　胰蛋白酶正交試驗(yàn)因素水平表Table 4The factors of the orthogonal test of Trypsin

1.3.2.5胃蛋白酶水解條件的研究

確定底物濃度為8%，選擇水解溫度（℃）、酶與底物比（U/g）、pH、水解時(shí)間（h）作為試驗(yàn)因子，以DH和O2－·清除率為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定胃蛋白酶水解膠原蛋白的最適條件。正交試驗(yàn)表如表5。

表5　胃蛋白酶正交試驗(yàn)因素水平表Table 5The factors of the orthogonal test of Pepsin

1.3.3指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1DH的測(cè)定

采用甲醛滴定法［16-17］。

1.3.3.2O2-·清除率測(cè)定

取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.2）4.5 mL，置于25℃水浴中預(yù)熱20min，分別加入1mL樣品和0.4mL 25 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5 min，加入8 mol/L HCl 1 mL終止反應(yīng)，299 nm處測(cè)定吸光度（Ai），空白對(duì)照組以相同體積的蒸餾水代替樣品（A0），清除率計(jì)算公式［18］：

式中：A0為空白的吸光度；Ai為樣品吸光度。

1.3.4數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)采用3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)平行測(cè)定3次，使用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件和Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1菠蘿蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

菠蘿蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6　菠蘿蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 6Results and analysis of orthogonal experiments of Bromelain

在菠蘿蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交試驗(yàn)中，pH、酶與底物比、溫度、時(shí)間4個(gè)因素對(duì)DH的影響順序?yàn)椋簆H＞時(shí)間＞酶與底物比＞溫度，但4個(gè)因素對(duì)DH的影響都不顯著（P＞0.05）；各因素對(duì)O2-·清除率的影響順序?yàn)閜H＞酶與底物比＞時(shí)間＞溫度。通過對(duì)兩個(gè)指標(biāo)的極差和方差分析，選擇A2B1C1D1為最優(yōu)組合。驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得在最適條件下水解液的DH為5.25%，O2-·清除率為44.49%。

2.2木瓜蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

木瓜蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7　木瓜蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 7Results and analysis of orthogonal experiments of Papain

在木瓜蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交試驗(yàn)中，pH、酶與底物比、溫度、時(shí)間4個(gè)因素對(duì)DH的影響順序?yàn)椋簻囟龋久概c底物比＞時(shí)間＞pH，4個(gè)因素對(duì)水解度的影響都不顯著（P＞0.05）；各因素對(duì)O2-·清除率的影響順序?yàn)閜H＞酶與底物比＞時(shí)間＞溫度。通過對(duì)兩個(gè)指標(biāo)的極差和方差分析選擇A3B1C3D3為最優(yōu)組合。驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得在最適條件下水解液的DH為13.28%，O2-·清除率為41.97%。

2.3中性蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

中性蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表8。

表8　中性蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 8Results and analysis of orthogonal experiments of Neutral Protease

中性蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的正交試驗(yàn)中，溫度、酶與底物比、pH、時(shí)間4個(gè)因素對(duì)DH的影響順序?yàn)椋簻囟龋久概c底物比＞pH＞時(shí)間，但4個(gè)因素對(duì)水解度的影響都不顯著（P＞0.05）；4個(gè)因素對(duì)O2-·清除率的影響順序?yàn)闀r(shí)間＞酶與底物比＞溫度＞pH。通過對(duì)兩個(gè)指標(biāo)的極差和方差分析，選擇A1B1C2D3為水解膠原蛋白的最優(yōu)組合。驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得在最適條件下水解液的DH為8.45%，O2-·清除率為69.79%。

2.4胃蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

胃蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果見表9。

表9　胃蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 9Results and analysis of orthogonal experiments of Pepsin

胃蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的正交試驗(yàn)中，溫度、酶與底物比、pH、時(shí)間4個(gè)因素對(duì)DH的影響順序?yàn)椋簳r(shí)間＞溫度＞pH＞酶與底物比，但4個(gè)因素對(duì)水解度的影響都不顯著（P＞0.05）；4個(gè)因素對(duì)O2-·清除率的影響順序?yàn)闀r(shí)間＞酶與底物比＞溫度＞pH值。通過對(duì)兩個(gè)指標(biāo)的極差和方差分析，選擇A1B1C2D3為水解膠原蛋白的最優(yōu)組合。驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得在最適條件下水解液的DH為4.47%，O2-·清除率為48.49%。

2.5胰蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果胰蛋白酶水解豬皮膠原蛋白正交組合優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果見表10。

表10　胰蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 10Results and analysis of orthogonal experiments of Bromelain

胰蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的正交試驗(yàn)中，溫度、酶與底物比、pH、時(shí)間4個(gè)因素對(duì)水解度的影響順序?yàn)椋好概c底物比＞溫度＞pH＞時(shí)間；4個(gè)因素對(duì)O2－·清除率的影響順序?yàn)椋簳r(shí)間＞酶與底物比＞溫度＞pH。通過對(duì)兩個(gè)指標(biāo)的極差和方差分析，選擇組合A1B1C2D3為最優(yōu)組合。驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得在最適條件下水解液的DH為12.15%，O2－·清除率為76.49%。

3結(jié)論與討論

1）不同蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的最適條件不同，其中菠蘿蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的最適條件：時(shí)間5 h、溫度45℃、pH3.5、酶與底物比4 000 U/g、底物濃度6%，此時(shí)DH 5.25%，O2－·清除率44.49%；木瓜蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的最適條件：時(shí)間6 h、溫度70℃、pH5、酶與底物比6 250 U/g、底物濃度6%，此時(shí)DH13.28%，O2－·清除率41.97%；中性蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的最適條件：時(shí)間5h、溫度30℃、pH7.5、酶與底物比2000 U/g、底物濃度6%，此時(shí)DH8.45%，O2－·清除率69.79%；胃蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的最適條件：時(shí)間5 h、溫度30℃、pH3、酶與底物比4 000 U/g、底物濃度8%，此時(shí)DH4.47%，O2－·清除率48.49%；胰蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的最適條件：時(shí)間5 h、溫度40℃、pH9、酶與底物比2 000 U/g、底物濃度10%，此時(shí)DH12.15%，O2－·清除率76.49%。

2）五種蛋白酶水解豬皮膠原蛋白的水解產(chǎn)物均具有抗氧化性，但不同蛋白酶水解后的產(chǎn)物的抗氧化活性強(qiáng)弱不同。用不同的酶水解同一種膠原蛋白，因?yàn)槊傅淖饔梦稽c(diǎn)不同，所得的水解產(chǎn)物的氨基酸組成不同，也影響其抗氧化性的發(fā)揮。不同的水解條件影響膠原蛋白的水解程度，所得的水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量以及氨基酸組成不同，從而影響它的抗氧化性［19］。水解產(chǎn)物的抗氧化活性與蛋白酶種類、水解條件的關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。

3）不同蛋白酶在其最適水解條件下對(duì)豬皮膠原蛋白的水解度依次為：木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞菠蘿蛋白酶＞胃蛋白酶。不同蛋白酶水解后的產(chǎn)物對(duì)O2－·清除率依次為：胰蛋白酶水解產(chǎn)物＞中性蛋白酶水解產(chǎn)物＞胃蛋白酶水解產(chǎn)物＞菠蘿蛋白酶水解產(chǎn)物＞木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物。這與王運(yùn)改等［20］、姚東瑞等［21］的研究結(jié)果一致，水解物的水解度與抗氧化活性之間沒有顯著的相關(guān)性。

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Hydrolyzing Effect Comparative Studies of Five Proteases on Pigskin Collagen

XIAO Lan1，2，LI Cheng1，*，F(xiàn)U Gang1，YU Xia1，DU Xin1，LI Xi-ran1
（1.College of Food Science，Sichuan Agricultural University，Ya'an 625014，Sichuan，China；2.Department of Food Science，Sichuan Tourism University，Chengdu 610100，Sichuan，China）

With fresh pigskin as material，five different proteases including neutral protease，bromelain，pepsin，papain，trypsin were used to hydrolyze collagen.Taking DH and scavenging rate of O2－·as index，the condition of the five proteases hydrolyzing pigskin collagen was optimized according to single factor and orthogonal test，and comparatively study the five proteases effect on pigskin collagen.It turned out that：hydrolysates of the five proteases were all anti-oxidative，and the scavenging rates of O2－·were as follows：trypsin＞neutral protease＞pepsin＞bromelain＞papain.

neutral protease；bromelain；pepsin；papain；trypsin；hydrolyzing degree；scavenging rate of O2－·

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.17.003

2014-02-27

四川省教育廳項(xiàng)目（12ZB102）

肖嵐（1981—），女（漢），講師，博士研究生，從事畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全方面研究。

李誠（1964—），男，教授，博導(dǎo)，研究方向：畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。