陳　麗，申　欣，孟學平，王興強，楊玉釵

（淮海工學院海洋學院//江蘇省海洋資源開發(fā)研究院//江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港，222005）

皺紋盤鮑和九孔鮑遺傳差異nad2-cox1分析及鮑屬系統(tǒng)發(fā)育

陳麗，申欣，孟學平，王興強，楊玉釵

（淮海工學院海洋學院//江蘇省海洋資源開發(fā)研究院//江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港，222005）

基于nad2-cox1核苷酸序列分析了皺紋盤鮑和九孔鮑3個養(yǎng)殖群體的遺傳差異，基于cox1分析了鮑屬19種鮑的系統(tǒng)發(fā)育關系。共獲得625 bp的DNA片段，33個片段共檢測到17種單倍型，其中皺紋盤鮑2個群體26個個體15種單倍型，九孔鮑7個個體2種單倍型。皺紋盤鮑大連群體與廈門群體有6種交叉共享單倍型，皺紋盤鮑與九孔鮑之間無共享單倍型。皺紋盤鮑群體內(nèi)個體間的遺傳距離（D）為 0.002～0.015，九孔鮑個體間 D值為0.003，兩種鮑間的遺傳距離為0.300～0.320。鮑屬系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，皺紋盤鮑與日本鮑、盤鮑聚為一支（D值為0.000～0.004），而后與大鮑聚在一起（支持率為100%）（D值為0.018），九孔鮑、細紋九孔鮑、雜色鮑聚為一支（D值為0）。九孔鮑與馬蹄螺科的Diloma bicanaliculata聚為一支，白鮑、黑鮑、紅鮑、北國鮑、堪察加鮑聚為一支（支持率87%）。

皺紋盤鮑；九孔鮑；nad2-cox1

鮑為隸屬于軟體動物門（Mollusca）腹足綱（Gastropoda）鮑科（Haliotidae）海味珍品［1］。目前世界上發(fā)現(xiàn)的鮑近100種，投入養(yǎng)殖生產(chǎn)和處于生產(chǎn)試驗階段的鮑已有20多種［2］，其中開展人工養(yǎng)殖的有10余種［3］。我國沿海分布的鮑種類有8個，主要經(jīng)濟種類為皺紋盤鮑、雜色鮑和九孔鮑［4］。皺紋盤鮑與盤鮑、雜色鮑和九孔鮑間的遺傳關系尚不清楚。等位酶研究顯示親緣關系較近的盤鮑與皺紋盤鮑間的遺傳距離為0.055，九孔鮑與雜色鮑間的遺傳距離為0.016，盤鮑與九孔鮑間的遺傳距離為0.214，盤鮑與雜色鮑的遺傳距離（0.172）［5］，等位酶研究顯示九孔鮑和雜色鮑在生物遺傳上非常相似［6］，RAPD研究顯示雜色鮑和九孔鮑間親緣關系近（遺傳距離為0.32），皺紋盤鮑和盤鮑間親緣關系近（遺傳距離為0.28）［7］。微衛(wèi)星分析顯示惠來皺紋盤鮑與惠來盤鮑的NEI氏遺傳距離為0.030，而東山皺紋盤鮑與惠來皺紋盤鮑間的NEI氏遺傳距離為0.044，顯示為種內(nèi)群體間遺傳距離大于種間遺傳距離的異常情況［8］。關于皺紋盤鮑野生群體與養(yǎng)殖群體遺傳差異的微衛(wèi)星分析［9-10］、RAPD分析［11］、雜色鮑養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的微衛(wèi)星分析［12］等均有報道，皺紋盤鮑群體間、皺紋盤鮑與九孔鮑種間的nad2-cox1分析鮮有報道?；蚝塑账岫鄳B(tài)性分析結(jié)果受操作技術的影響小，較等位酶，微衛(wèi)星、RAPD標記更為準確可靠，可為鮑屬種的分類鑒定及增養(yǎng)殖提供可靠的種質(zhì)資源遺傳背景分子生物學依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實驗材料

實驗樣品九孔鮑（xjk）采自廈門培陽水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司養(yǎng)殖場，共7個個體；皺紋盤鮑2個養(yǎng)殖群體 26個個體，分別采自大連海洋島海利奧水產(chǎn)養(yǎng)殖場（DB）和廈門培陽水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司養(yǎng)殖場（JK）。取斧足肌75%（φ）乙醇固定備用或新鮮組織直接提取DNA。

1.2DNA提取及PCR擴增

取乙醇保存的樣本，用蒸餾水洗出乙醇，或新鮮組織用SDS、蛋白酶K裂解組織，酚氯仿抽提蛋白質(zhì)，乙醇沉淀DNA，獲得總DNA。引物設計：從 GenBank檢索得到皺紋盤鮑（EU595789）和九孔鮑（HQ832673）線粒體基因組DNA，從中析出NADH脫氫酶亞基2基因（nad2），細胞色素c氧化酶亞基1基因（cox1）全序列，用Primer Primer軟件分別設計皺紋盤鮑和九子孔鮑nad2-cox1特異引物。Hal-cox1-F:gAT TCg CCg CAA AAT ggA CA； Hal-cox1-R:CTC CTg CAT ggg CAA ggT TA；nad2-cox1-F:5′Cgg CgC AAT gAA AAC CgA 3′；nad2-cox1-R:5′gCA AgA TCT ACC gAT gCC 3′。

PCR反應體系25μL，模板約50 ng，dNTP（10 mmol/dm3）0.5μL，Taq DNA聚合酶［D0090，生工生物工程（上海）股份有限公司］1U，95℃預變性5min后，進行35個循環(huán)擴增：94℃變性45s，52℃退火30s，72℃延伸0.8min。35個循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10min。

1.3PCR產(chǎn)物測序

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。電泳時電壓5 V/cm，用GoldView進行DNA染色，電泳時間0.5 h；PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收，在ABI公司的 3730xl DNA Analyzer測序儀上測序，試劑為BigDye terminator v3.1。

1.4序列分析

將測序所得DNA序列用DNAStar軟件組裝，結(jié)合測序峰圖進行序列人工校對，用 ClustalX軟件排序取齊，通過DnaSP 5.0軟件統(tǒng)計各群體的單倍型，利用MEGA 4分析序列特征、計算遺傳差異和遺傳距離（K2-P），構建NJ（Neighbor-joining）系統(tǒng)進化樹。分別以皺紋盤鮑和九孔鮑 cox1 序列為查尋序列（Query Sequence）進行搜索，獲得鮑屬不同種cox1核苷酸序列，序列信息如表1，共獲得19種鮑25個cox1序列，與本研究獲得的17個單倍型cox1序列合并、以馬蹄螺科（Trochidae）的Diloma bicanaliculata為外群構建系統(tǒng)進化樹，進行鮑屬不同種類的系統(tǒng)發(fā)育分析。

表1　鮑屬不同物種線粒體cox1序列信息Table 1　The cox1 information of different species from genus Haliotis and outgroup species

2　結(jié)果與分析

2.1nad2-cox1序列特征

本實驗擴增了鮑屬皺紋盤鮑和九孔鮑共33個個體的nad2-cox1序列，包括nad2 3′端、cox15′端和2基因間的非編碼區(qū)共625 bp的核苷酸序列，其中，nad2序列長度為210 bp，cox1序列398bp?；蜷g隔區(qū)為17bp。皺紋盤鮑nad2 和cox1核苷酸序列的A、G、T、C比率（%）相同，分別為27.4、 19.4、26.9、26.4，A+T比率為54.3%；九孔鮑A、G、T、C比率（%）分別為26.5、20.4、26.7、26.5，A+T比率為53.2%，A比率明顯低于皺紋盤鮑，G比率明顯高于皺紋盤鮑。

2.2nad2-cox1序列比對

用于核苷酸序列比對的DNA片段長610 bp，33個個體nad2-cox1序列經(jīng)DnaSPv5分析共得到17種單倍型（hap）（表2）。

表2　皺紋盤鮑和九孔鮑 3個群體nd2-cox1單倍型分布Table 2　The nad2-cox1 haplotype distribution on three populations of H.discus hannai and H.diversicolor supertexa

皺紋盤鮑26個個體有15種haps（DB，JK），九孔鮑（xjk）7個個體有2種haps（hap16，hap17）。九孔鮑有5個樣本共享hap16，2個樣本共享hap17；皺紋盤鮑大連群體（DB）（13個個體）有9種單倍型，其中 4種單倍型（hap1，5，12，15）與廈門群體（JK）共享，5種單倍型為群體內(nèi)獨享；廈門群體13個個體，獨享單倍型6種（hap3，4，7，8，9，14）；hap1的頻率最高，為15.2%，hap1和hap11的頻率次之，均為12.1%。

17種單倍型核苷酸序列比對結(jié)果顯示（圖1），在625個比對位點中有160個變異位點，占25.6%。其中皺紋盤鮑15種單倍型中，有21個變異位點，占3.4%；九孔鮑2種單倍型變異位點有2個，占0.3%。九孔鮑區(qū)別于皺紋盤鮑的變異位點139個，占變異位點的86.9%，這些變異位點可用于九孔鮑和皺紋盤鮑的鑒別。

圖1　九孔鮑和皺紋盤鮑cox1（上）和nad2（下）（后8個位點為基因間隔區(qū)）核苷酸變異位點Fig.1 The variable sites of cox1（top）and nad2（below）of Haliotis discus hannai and H.diversicolor supertexta

將nad2和cox1核苷酸序列分別比對顯示，皺紋盤鮑與九孔鮑間nad2的變位點77個，占36.7%（77/210），cox1的變異位點 75個，占 18.8%（75/398）。兩基因之間的非編碼區(qū)變異位點占47.1%（8/17）。編碼區(qū)2個基因的變異率明顯不同，nad2的變異率是cox1的近2倍，兩基因的間隔區(qū)變異率最高。

2.3基于nad2-cox1序列的遺傳距離

基于nad2-cox1的核苷酸序列，計算了皺紋盤鮑群體間、皺紋盤鮑和九孔鮑種間的遺傳距離（K2-P）（表3），由表3可見，皺紋盤鮑種內(nèi)個體間的遺傳距離為 0.002～0.015，九孔鮑種內(nèi)個體間遺傳距離為 0.003。2種鮑間的遺傳距離為0.300～0.320。基于nad2核苷酸序列的2種鮑間的距離為 0.480～0.510，與皺紋盤鮑群體內(nèi)個體間遺傳距離（平均為0.009）之比為53.3～56.5?；赾ox1的遺傳距離為 0.200～0.210，與皺紋盤鮑群體內(nèi)個體間遺傳距離（平均為0.009）之比為22.20～23.30。此結(jié)果顯示鮑屬種間 nad2核苷酸變異率明顯比cox1高，且2種鮑間的遺傳關系較遠。

表3　基于nad2-cox1核苷酸序列的皺紋盤鮑的九孔鮑的遺傳距離（k2-p）Table 3　The distance based on nad2-cox1 nucleotide sequences of H.discus hannai and H.diversicolor superrtexa

2.4基于nad2-cox1序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

基于nad2-cox1的皺紋盤鮑和九孔鮑17種單倍型構建的N-J樹顯示，九孔鮑2種單倍型聚為一支（hap16，17），且支持率很高（100%），皺紋盤鮑的 15種單倍型聚為另一支，支持率相對低，而且皺紋盤鮑大連群體和廈門群體未聚為單系支，而是交叉聚在一起。說明大連群體和廈門群體有基因交流。

2.5基于cox1序列的鮑屬19種鮑的系統(tǒng)演化關系

將鮑屬19種鮑的25條cox1基因片段與本研究獲取的cox1核苷酸序列一起共獲得42條序列。進行系統(tǒng)發(fā)育分析，取齊后共獲得302個比對位點。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果見圖2。

圖2　基于Ccox1的鮑屬不同種類間的系統(tǒng)發(fā)育關系Fig.2　Phylogenetic analysis of differenet species on the genus Haliotis based on cox1

由圖2可見，九孔鮑、細紋九孔鮑和雜色鮑聚為一支（支持率99%），本研究的皺紋盤鮑（DB群體和JK群體）與日本鮑和盤鮑的遺傳關系很近，聚為1支，支持率較低（86%）。以皺紋盤鮑的cox1全序列（EU595789）在GenBank重新搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，日本鮑與皺紋盤鮑的同源性為99%（534/535），盤鮑與皺紋盤鮑的同源性為 99%（533/535），而與另一皺紋盤鮑（AB2366789）（533/535）的同源性也為99%。這說明皺紋盤鮑、日本鮑和盤鮑可能是一個種的不同種群；H.kamtschatkana kamtschatkana（JF285135）與H.kamtschatkana assimilis（JF285142）聚為一支，重新blast分析后顯示這2個序列的同源性為99%（815/816）?？安旒吁U和白鮑聚為一支（84%）；澳大利亞黑鮑（H.rubra）和旋風鮑（H.conicopora）的同源性為100%（535bp/535bp），可能是1個種的不同群體；紅鮑、黑鮑、白鮑、堪察加鮑、H.kamtschatkana assimilis、H.kamtschatkanakamtschatkana遺傳關系近，聚為一大支（支持率為87%）

3　討　論

3.1鮑遺傳背景研究亟待加強

種質(zhì)資源是遺傳育種的基礎，清晰的遺傳背景是鮑增養(yǎng)殖及良種選育和雜交育種的重要資料。我國沿海鮑分布有8種，主要經(jīng)濟種類為皺紋盤鮑、雜色鮑和九孔鮑［13］。中國是世界上第一養(yǎng)鮑大國，2009年養(yǎng)殖產(chǎn)量（4.23萬t）占世界總產(chǎn)量的82.3%。福建是我國的第一養(yǎng)鮑大省，2010年以4.13萬t占全國總產(chǎn)量的73.0%［4］，2011年占全國的78.7%。2011我國的鮑魚養(yǎng)殖產(chǎn)量達7.7萬t，年產(chǎn)值100多億［3］。近年來，鮑魚的研究主要集中在加工［14-15］、天然產(chǎn)物的提?。?6-17］、功能基因研究［18-19］等方面，有關鮑魚遺傳結(jié)構及遺傳多樣性的基礎研究報道很少，這與我國迅速發(fā)展的鮑魚養(yǎng)殖業(yè)不相適應。本研究結(jié)果可為鮑的雜交育種、優(yōu)良種質(zhì)的選育等鮑養(yǎng)殖業(yè)提供有價值的參考資料。

3.2nad2-cox1片段作為群體遺傳差異分析的分子標記特點

在同一個物種中，線粒體基因組不同的蛋白質(zhì)基因變異率不同，不同的物種線粒體同一種蛋白質(zhì)基因的保守性也不同［20］。研究線粒體不同基因的變異率對于鮑魚的群體遺傳差異及同屬不同物種間演化關系的研究具有重要意義，變異率高的基因可用于同種內(nèi)群體間差異分析，變異率低的基因可用于種間差異分析。關于鮑魚線粒體全基因組已有報道［21］，可為基因片段的擴增引物設計提供資料，為基于線粒體DNA的群體遺傳差異分析提供了方便。本研究nad2-cox1片段擴增引物就是根據(jù)已有的鮑的線粒體基因組全序列設計。分析結(jié)果顯示鮑魚nad2的變異率明顯高于cox1，nad2 更適合種內(nèi)群體間遺傳差異分析。在鮑的線粒體DNA中，cox1和nad2是相鄰的2個基因，且在兩基因間有一段非編碼區(qū)。兩個基因的解析能力不同，將兩個基因的片段結(jié)合，加之基因間的非編碼區(qū)（具有更高的解析能力）所得實驗結(jié)果更說明問題。

3.3鮑屬不同種的遺傳背景

鮑屬的物種相對多，根據(jù)形態(tài)學進行分類，有的難以辯認。將形態(tài)學與分子生物學資料結(jié)合，可有效解決鮑屬物種系統(tǒng)演化關系?；诰€粒體全基因組的貝類遺傳距離多數(shù)在5%以上，最低的也有2%［22］，cox1是線粒體蛋白質(zhì)基因中相對保守的基因，種間差異水平也應達到5%。本研究顯示日本鮑與皺紋盤鮑、盤鮑與皺紋盤鮑cox1的同源性很高，達99%，其差異水平未達到種間差異水平。資料中的日本鮑、盤鮑與皺紋盤鮑是否是一個種，有待深入研究。此外，還發(fā)現(xiàn)H.kamtschatkana kamtschatkana（JF285135）與H.kamtschatkana assimilis（JF285142）聚為一支，這2個序列的同源性為99%（815/816），其差異也未達到種間差異的水平；澳大利亞黑鮑和旋風鮑的同源性為100%。鮑屬物種的系統(tǒng)演化關系研究結(jié)果有諸多不明確之處，需作更多的研究加以澄清。目前我國鮑長途運輸頻繁，苗種總體質(zhì)量不高，種質(zhì)資源退化嚴重，影響鮑的抗病能力及生產(chǎn)能力，有必要對現(xiàn)存鮑的遺傳背景作深入細致的研究，為我國鮑養(yǎng)殖業(yè)健康、理性發(fā)展服務。

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（責任編輯：陳莊）

Genetic differences of Haliotis discus hannai and H.diversicolor supertexta and phylogenetic relationships of genus Haliotis based on nad2-cox1

CHEN Li，SHEN Xin，MENG Xue-ping，WANG Xing-qiang，YANG Yu-chai
（Jiangsu Marine Resource Development Research Institute，Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bioindustry Technology，Marine College of Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China）

The genetic differences among three populations of Haliotis discus hannai and H.diversicolor supertexta was examined by adopting the partial sequences of the mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 2-cytochrome coxidase subunit 1 genes（nad2-cox1）.And the phylogenetic relationships of genus Haliotiswas analyzed based on cox1 fragments.A total of 625 bp of DNA fragments were obtained.Seventeen haplotypes were identified from 33 samples，among which，fifteen haplotypes were in of 26 samples of Dalian and Xiamen H.discus hannai，two haplotypes were in seven samples of H.diversicolor supertexta.and six haplotypes were shared by two populations of H.discus hannai，however，no shared hyplotypes were found between H.discus hannai and H.diversicolor supertexta.The genetic distance（D value）was 0.002-0.015 withinthe group of H.discus hannai，and was 0.003 withinthe group of H.diversicolor supertexta and reached 0.300-0.320 between H.discus hannai andH.diversicolor supertexta.Phylogenetic analysis showed that H.discus hannai，H.madaka，and H.discus were clustered into one clade（D value 0.000-0.004），then grouped with H.gigantea（Support rate 100%，D value 0.018）.H.diversicolor supertexta，H.diversicolor aquatilis formed another clade（D value 0）.H.diversicolor supertexta and Diloma bicanaliculata（Gastropoda:Trochidae）formed the third clade and H.sorenseni，H.cracherodii，H.rufescens，H.walallensis and H.kamtschatkana formed the fourth clade（Support rate 87%）.

Haliotis discus hannai；H.diversicolor supertexta；nad2-cox1

S917.4

A

1673-9159（2015）01-0028-07

2015-01-15

連云港市產(chǎn)學研究聯(lián)合研究項目（CXY1219）；江蘇省自然科學基金項目（BK20131210）；江蘇省海洋資源開發(fā)研究院科技開放基金（JSIMR11B19）；江蘇省水產(chǎn)三新工程重大項目（DY2012-4-2）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目（PAPD）

陳麗（1970-），女，碩士，副教授，研究方向為水生生物生理生化及天然產(chǎn)物的提取。E-mail:13961380000@163.com

孟學平，教授，主要從事水生生物生化與分子生物學研究。E-mail:mxp2002@hotmail.com