張海靜，魏 星，潘寶平

（天津師范大學a.生命科學學院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

青蛤（Cyclina sinensis）是我國沿海常見的經(jīng)濟貝類.由于其具有生長迅速、肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)價值高和對環(huán)境有很強的適應性等產(chǎn)業(yè)化增養(yǎng)殖特點，目前我國對于青蛤的增養(yǎng)殖區(qū)域相當廣泛[1]，隨之而來有關青蛤大規(guī)模病害和死亡現(xiàn)象的報道也日益增多.因此為推動國內(nèi)青蛤養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展，開展對青蛤免疫抗病害機制方面的研究顯得尤為重要.

親環(huán)素（Cyplophilin）是一個多功能蛋白家族，也是一種普遍分布的胞內(nèi)蛋白，具有肽基脯氨基順反異構酶（PPIase）活性[2]，能夠加速自身折疊、體內(nèi)新生肽鏈折疊及變性蛋白質(zhì)的體外折疊，起到分子伴侶的作用[3].親環(huán)素A具有多種生物學活性，可參與信號傳導、調(diào)節(jié)細胞凋亡等.在細菌、真菌、植物和哺乳動物中分布廣泛，同時在生物進化過程中具有很高的保守性[4].據(jù)相關文獻報道，至少在六億年以前就存在親環(huán)素，在長期的演變和進化過程中，它始終存在于各種生物的細胞內(nèi)，擔當著管家基因（Housekeeping genes）產(chǎn)物的角色[5].親環(huán)素A（Cyplophilin A，CypA）是親環(huán)素家族內(nèi)存在最廣泛、保守性最強的一類，是環(huán)孢素A的細胞內(nèi)受體，介導環(huán)孢素A發(fā)揮免疫抑制作用[6].它在細胞和體液中的含量直接影響環(huán)孢素A的藥效發(fā)揮.親環(huán)素A最早被發(fā)現(xiàn)存在于牛胸腺細胞中，并被提取出來[7]，之后從多種動植物的細胞中也提取出該種蛋白，并克隆出了異構體，這些異構體構成了親環(huán)素A的蛋白家族[8].按照蛋白來源，可將親環(huán)素A家族大致分為線蟲類、眼蟲類、真菌類、扁形類、植物類和哺乳動物類6大類，其中研究最詳盡的是人體和擬南芥中的親環(huán)素[9]，對于軟體動物中親環(huán)素的報道相對較少.

本研究從分子免疫學角度出發(fā)，對篩選出的青蛤親環(huán)素A基因（CypA）進行一系列的基因及蛋白序列分析，通過實時定量PCR的方法研究青蛤體內(nèi)不同組織之間親環(huán)素A基因表達量的差異，觀測低濃度致病菌鰻弧菌侵染后不同時間內(nèi)青蛤血淋巴中親環(huán)素A表達量的變化，探討親環(huán)素A參與青蛤的固有免疫機制，為選育抗病能力較強的青蛤品系提供實驗數(shù)據(jù).

1 實驗材料與方法

1.1 材料

活體青蛤樣品采于天津大港灘涂，選取形態(tài)指標無顯著差異的個體，實驗之前將青蛤放置在通氣的人工海水中暫養(yǎng)1～2周.持續(xù)曝氣，每24h換水1次，每天投喂0.005 g/mL的小球藻.

鰻弧菌為天津師范大學生命科學學院動物學實驗室凍存菌種，實驗之前將其以1∶100比例接種至2216E液體培養(yǎng)基中，放置于28℃搖床中200 r/min培養(yǎng)1 d.用隨機分組的方法，設10個平行組.實驗組青蛤每只注射50μL鰻弧菌菌液，對照組青蛤每只注射等量滅菌生理鹽水.處理后用5 mL的注射器分別于 3、6、12、24、36、48h 時從閉殼肌取血.

1.2 方法

1.2.1 cDNA文庫的構建

將青蛤各組織放于液氮中研磨后，置于1 mL的trizol中提取組織總RNA，mRNA的分離按QIAGEN公司的Oligotex mRNA Kits試劑盒操作手冊進行.根據(jù)Clontech公司的SMART-cDNA Library Construction Kit試劑盒說明書進行cDNA文庫的構建，連接載體使用pBluescriptⅡSK+改造體，轉(zhuǎn)化菌株為 E.coli（DH5α）.文庫隨機測序引物：T7-F（5′-TAATACGACTCACTATAGG-3′），T3-R （5′-AATTAACCCTCACTAAAGG-3′）.所得序列去除載體序列后拼接得到contig和無法與其他序列拼接的singlest數(shù)據(jù)，將測得的序列用Blast進行同源性分析.

1.2.2 鰻弧菌刺激后青蛤CypA基因在血淋巴內(nèi)的時序性表達

用鰻弧菌刺激青蛤后，測定青蛤CypA基因在血淋巴內(nèi)的時序性表達.參照1.2.1中的方法，分別提取鰻弧菌刺激下各時間點的血淋巴總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA.以β-actin為內(nèi)參基因，實時定量引物為：βactin-F（5′-CACCACAACTGCCGAGAG-3′）；β-actin-R（5′-CCGATAGTGATGACCTGACC-3′）；CPL-F（5′-GTCACATTCGCCAAGCAA-3′）；CPL-R（5′-TGAAGGACCAGCAAGAGCC-3′）.反應在iQ5熒光定量PCR儀上進行，操作按照TAKARA公司的SYBRPremix DimerEraserTM（Perfect Real Time）使用說明進行.反應程序為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，58℃退火30 s，最后72℃延伸30 s，40個循環(huán).數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCT法，使用SPSS軟件對同一時間點的實驗組與對照組、實驗組和空白組的表達水平進行單因素方差分析.

1.2.3 青蛤CypA基因的原核表達

用特異性引物CypA-F（5′-GGATCCATGGCTAACCCAAAGTGTTATTTTG-3′）和 CypA-R（5′TTCGAATTAAAGCTGACCACAATCTTGAATG-3′）擴增得到青蛤CypA成熟肽基因，連接到pMD18-T載體中得到pMD18-T-CypA，并用 pMD18-T載體通用引物和青蛤CypA特異性引物進行陽性克隆篩選，測序鑒定.用NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切pMD18-T-CypA，用試劑盒回收青蛤CypA基因并將其與NdeⅠ和EcoRⅠ酶切開環(huán)的pET30（+）連接，轉(zhuǎn)入表達宿主菌大腸桿菌BL21（DE3）pLysS感受態(tài)細胞中，得到重組質(zhì)粒pET30（+）-CypA.用T7引物和CsCypA特異性引物進行陽性克隆篩選及測序鑒定.

1.2.4 重組蛋白的純化與復性

將轉(zhuǎn)化菌株接入到LB液體培養(yǎng)基中（含100 g/mL的硫酸卡那霉素），37℃、220 r/min培養(yǎng)至 OD值為600左右，取1 mL作為誘導前的對照，把IPTG（終質(zhì)量濃度1 mg/mL）加入到剩余的菌液中，37℃下誘導培養(yǎng)，每隔1h取樣1次，每次取1 mL.取500 mL誘導的菌液，4℃、6 000 r/min離心，收集菌體，以菌體裂解液重懸并超聲破碎.4℃、6 000 r/min再次離心，將沉淀重懸并過濾膜后得到重組蛋白粗提液.

重組蛋白粗提液使用康為世紀公司的Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒（包涵體蛋白）進行純化，將收集到的蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳檢測.采用透析法進行復性，將純化后的蛋白放在透析袋中，內(nèi)含50 mmol/L 的 Tris-HCl和 6、4、3、2、1、0 mol/L 的尿素緩沖液（pH 5.5）.將復性后的蛋白凍干并稱重，置于－80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?

2 結果

2.1 青蛤CypA基因的結構分析

構建的容量為1.12×106cfu/mL的SMART-cDNA文庫，其重組率約為96.4%.經(jīng)隨機挑取克隆進行大規(guī)模測序后，使用Blastx在線對其比對分析，結果發(fā)現(xiàn)了CypA家族基因的類似序列，并將此序列命名為青蛤CypA，在Gen Bank的注冊號為JN806098.

青蛤親環(huán)素A基因cDNA的核苷酸及對應的氨基酸序列如圖1所示.

圖1 青蛤CypA全長cDNA序列的開放閱讀框及功能域Fig.1 Open reading frame and functional domain of cDNA sequence of C.sinensis CypA

該 cDNA 序列全長為 962 bp，5′UTR 為 87 bp，3′UTR為346 bp，開放閱讀框長度為495 bp，可以編碼164個氨基酸.使用SMART在線分析軟件對青蛤親環(huán)素A進行蛋白質(zhì)序列分析，發(fā)現(xiàn)無信號肽結構，由此證明親環(huán)素A屬胞內(nèi)蛋白，含有1個完整的Pro_isomeraes結構域，為親環(huán)素A的典型結構域.使用Prot-Param工具分析青蛤親環(huán)素A的理論相對分子質(zhì)量、等電點和氨基酸組成，其理論相對分子質(zhì)量為19.39 kDa（1 kDa=1 000摩爾質(zhì)量），理論等電點為5.25.成熟肽包含164個氨基酸，分子式為C1500H2507N495O637S85，氨基酸組成中丙氨酸（Ala）含量最大，占28.9%.使用Swiss-model和Swiss-PdbViewer在線分析軟件對獲得的青蛤親環(huán)素A的空間結構進行預測和查看，結果顯示親環(huán)素A主要具有 α-螺旋（α-helix）、β 折疊（βsheet）和無規(guī)則卷曲等二級結構，整體結構比較緊湊.

2.2 鰻弧菌刺激后青蛤CypA基因在血淋巴內(nèi)的時序性變化

青蛤被鰻弧菌侵染后，以β-actin為內(nèi)參基因，利用實時熒光定量PCR分析青蛤CypA基因在血淋巴中表達量的時序變化，結果如圖2所示.

圖2 青蛤血細胞CypA基因在鰻弧菌刺激不同時間表達量的變化Fig.2 Relativeexpression of CypA gene in blood of C.sinensis infected by Vibrio anguillarum at different time

由圖2可以看出，實驗組在感染后3h時表達量開始升高并且達到最大值，與對照組的差異具有高度統(tǒng)計學意義（p＜0.01），6h后表達量大幅下降，96h時基因表達量恢復到正常水平.而對照組除了在6h時有略微升高之外，其余的時間點無明顯變化.

2.3 青蛤CypA基因的原核表達結果

對青蛤CypA成熟肽基因進行PCR擴增，得到產(chǎn)物長度約為500 bp的DNA片段，與預期大小基本一致.pET-30和PMD18T-CypA經(jīng)雙酶切后，將所得目的片段和線性表達質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后用試劑盒切膠回收，其目的片段大小為500 bp，與預期符合.具體結果如圖3所示.將所得CsCypA目的片段和pET-30線性質(zhì)粒進行連接，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后，對其進行陽性單克隆PCR檢測并送測序，所得測序結果經(jīng)比對正確，重組表達載體構建成功.

圖3 瓊脂糖凝膠電泳顯示的重組序列的PCR產(chǎn)物Fig.3 PCR products of recombination sequenceof CsCypA showed by AGE

2.4 重組蛋白的純化與復性結果

將構建的重組i型溶菌酶基因工程菌（pcr-pET-30-CypA）提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)到大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中，擴大培養(yǎng)后加入IPTG進行誘導表達，利用鎳離子交換柱分離并純化出重組蛋白.經(jīng)SDS-PAGE檢測顯示，IPTG誘導后的菌體與誘導前對照樣品相比，該工程菌株誘導后的樣品在約19 kDa處產(chǎn)生了1條明顯的特異性電泳帶，并純化出了相應大小的重組蛋白，如圖4所示，其相對分子質(zhì)量和理論計算值基本吻合.

圖4 融合蛋白的純化Fig.4 Purification of fusion protein

3 討論與結論

本研究從已構建的青蛤ESTs庫中篩選得到親環(huán)素A基因cDNA的全長序列，對該序列進行分析，發(fā)現(xiàn)親環(huán)素A含有一個完整的Pro_isomeraes結構域，為親環(huán)素A的典型結構域.在已知的櫛孔扇貝的CypA基因中同樣存在一個完整的Pro_isomeraes結構域[10]，它能夠加速自身折疊、體內(nèi)新生肽鏈折疊及變性蛋白質(zhì)的體外折疊，具有分子伴侶的作用.

鰻弧菌是海洋動物中最常見的一種致病微生物，貝類被其侵染后會出現(xiàn)出血性敗血癥，進而導致其局部組織損傷乃至死亡[11].相關研究顯示[12]，低濃度的鰻弧菌對青蛤進行刺激后，與免疫相關的因子如熱休克蛋白、磷酸酶、抗菌肽、溶菌酶等基因在一定時間內(nèi)均發(fā)生了上調(diào)表達，且其血清中的各種免疫相關酶蛋白的含量也隨之升高.本研究利用熒光定量PCR方法分析了青蛤血淋巴CypA基因在鰻弧菌刺激后的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，實驗組青蛤CypA基因的表達量在鰻弧菌刺激后3h開始呈上升趨勢并達到最大值，與對照組的差異具有高度統(tǒng)計學意義（p＜0.01），96h時表達量基本恢復到正常水平.這表明青蛤血淋巴中的CypA在鰻弧菌刺激下能夠大量表達，暗示其可能在血淋巴中具有防御細菌感染的特殊作用.例如在斑點叉尾鮰的卵細胞系中，CypA基因受到愛德華氏菌（Edwardsiella Ictaluri）感染后表達量上調(diào)，證明其在愛德華氏菌感染的早期階段有重要作用[13].近年來在斑節(jié)對蝦（Penaeus Monodon）中也發(fā)現(xiàn)了親環(huán)素A基因，受到LPS刺激后在肝胰腺中表達量上調(diào)[14].由此推測CypA基因參與了青蛤的先天性免疫反應，尤其是在抵抗不良環(huán)境因子的過程中發(fā)揮了重要作用.

本研究以pET-30α作為表達載體系統(tǒng)，構建出了pET30α（+）-CypA重組質(zhì)粒，并通過T7啟動子和1個6×His標簽來控制表達的嚴謹性.研究最終得到了相對分子質(zhì)量在19 kDa左右的目的蛋白，其結果與預測的CsCypA相對分子質(zhì)量理論值19.39 kDa相當吻合.本研究結果為進一步揭示青蛤的免疫防御體系，選育抗病抗逆的青蛤優(yōu)質(zhì)品種奠定了一定的實驗基礎.

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