王果　陳翔

（1.浙江省杭州市第一人民醫(yī)院，浙江杭州310000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院康復中心，浙江溫州325000）

·研究報告·

芹菜素對大鼠腦缺血再灌注后的轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達的影響*

王果1陳翔2△

（1.浙江省杭州市第一人民醫(yī)院，浙江杭州310000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院康復中心，浙江溫州325000）

目的探討轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）在大鼠腦缺血再灌注后不同時間的表達變化及芹菜素對其表達的影響。方法采用改良線栓法建立大鼠腦缺血再灌注后不同時間損傷模型。隨機分為假手術(shù)組、模型組、芹菜素組和地塞米松組，各手術(shù)組按再灌注時間不同又分為再灌注6 h組、24 h組、72 h組、7 d組4個亞組。各組麻醉清醒后均給予神經(jīng)行為學評分，每組1只，大鼠予2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色觀察腦梗死灶，6只免疫組化法測定轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達。結(jié)果在芹菜素72 h組神經(jīng)行為學評分低于模型72 h組（P＜0.05）；各手術(shù)組均出現(xiàn)白色梗死灶；缺血再灌注后TGF-β1表達增加，于24、72 h達高峰，芹菜素組能顯著提高TGF-β1的表達，與模型組比較差異顯著（P＜0.05）。結(jié)論芹菜素可增加腦缺血再灌注后TGF-β1的表達，提示芹菜素可能通過TGF-β1促進腦組織損傷的修復，達到神經(jīng)損傷的保護作用。

芹菜素腦缺血再灌注2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色轉(zhuǎn)化生長因子-β1

腦卒中嚴重危害人類的健康，卒中時的腦缺血再灌注損傷是一個復雜的病理過程，造成神經(jīng)功能的不同程度的損害［1］。對其損傷及修復治療過程一直是研究的熱點。腦缺血再灌注時誘導產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）表達增加［2］。TGF-β1是具有多重調(diào)節(jié)功能的細胞轉(zhuǎn)化生長因子，其生物學作用復雜多樣，并依據(jù)不同的細胞類型和病理環(huán)境發(fā)生變化。傳統(tǒng)觀點認為TGF-β1可促進神經(jīng)元生存，促進其分化，增加神經(jīng)元的軸突數(shù)目，并具有加速神經(jīng)組織修復的作用［3］。芹菜素（APG）是一種來源廣泛的植物黃酮，具有抗氧化、抗炎、神經(jīng)保護、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種活性［4］。課題組前期實驗中發(fā)現(xiàn)芹菜素可通過抑制NF-κB的活化、減少iNOS的產(chǎn)生及缺血半暗區(qū)小膠質(zhì)細胞的過度活化［5］，而抑制缺血再灌注繼發(fā)的炎癥反應。本實驗在前期研究基礎上，進一步探討大鼠腦缺血再灌注后TGF-β1的表達，及芹菜素是否能通過調(diào)節(jié)其表達進一步參與再灌注后神經(jīng)細胞的損傷和修復。

1　材料與方法

1.1實驗動物清潔級健康雄性SD大鼠共91只，體質(zhì)量（250±20）g，由溫州醫(yī)學院動物實驗中心提供，合格證號：SYXK（浙）2005-0061。

1.2藥物與試劑芹菜素（陜西慧科植物開發(fā)有限公司，批號：HK20081218）、地塞米松磷酸鈉注射液（浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：0901055），2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色購自sigma公司（批號：000298964），TGF-β1多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司（批號：BA0290）；即用型SABC快速免疫組化檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司（批號：SA1028）。

1.3儀器德國LEICA公司CM1900冰凍切片機；日本Olympus公司BX41光學顯微鏡；美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus 6.0（IPP6.0）彩色醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)；尼龍栓線購自北京沙東生物技術(shù)有限公司（產(chǎn)品號：2636-A3）。

1.4分組與造模將大鼠隨機分為模型組、芹菜素組和地塞米松組，各28只，再按按再灌注時間分為再灌注6 h組、24 h組、72 h組、7 d組4個亞組，每個亞組各7只，另取7只為假手術(shù)組。參照Belayev［6］報道的線栓法進行改良，建立急性大腦中動脈栓塞和再灌注模型。缺血2 h后將栓線退回到頸內(nèi)、外動脈分叉處實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組栓線只插到頸內(nèi)、外動脈的分叉處。

1.5給藥方法各組于造模再灌注同時及其后的每隔24 h分別腹腔注射給藥，芹菜素組劑量為25 mg/kg（0.8 mL/100 g）、地塞米松組劑量為5 mg/kg（0.8 mL/ 100 g），假手術(shù)組和模型組給予等體積生理鹽水。

1.6標本采集與檢測

1.6.1神經(jīng)行為學評分阻斷血流1 h后參照Zea Longa［7］5分制評分標準進行神經(jīng)行為學評分：0分為無神經(jīng)缺損癥狀；1分為不能完全伸展對側(cè)前爪；2分為行走時向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分為行走時向偏癱側(cè)傾倒；4分為不能自發(fā)行走，意識受到抑制；5分為死亡。

1.6.2腦組織切片2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色各組隨機取1只觀察至再灌注后24 h，用10%水合氯醛麻醉后，經(jīng)左心室迅速灌注冰生理鹽水150 mL，快速斷頭取腦，以2 mm間距冠狀切成6片，浸在2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑緩沖液中，置37℃的水浴箱中避光染色30 min，再在4%的多聚甲醛中固定過夜，數(shù)碼相機拍照觀察。

1.6.3免疫組織化學觀察TGF-β1的表達各亞組大鼠6只觀察至規(guī)定的時間后，灌注固定后取腦，冠狀切取前囟前1.0 mm至前囟后2.0 mm的左半球腦組織，置4%多聚甲醛中后固定2 h，再置30%蔗糖中4℃冰箱過夜至組織沉底，OCT包埋液氮速凍后移入-80℃冰箱保存?zhèn)溆?；冰凍切片機冠狀連續(xù)切片，8 μm厚，每隔10張取1張，每只大鼠取5張切片。檢測方法按試劑盒說明書進行。封片后，自然晾干，并盡快觀察與攝片。圖片放大倍數(shù)表示物鏡倍數(shù)乘目鏡放大倍數(shù)。每只大鼠取免疫組化切片5張，置于高倍鏡下（400倍），每張切片于腦缺血梗死區(qū)周圍隨機選取陽性表達區(qū)域5個非重疊視野攝片后，用美國IPP6.0分析軟件進行圖像分析，測量陽性細胞的OD值。

1.7統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，計量資料以（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者用LSD檢驗，方差不齊者用Dunnett’T3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠缺血再灌注后神經(jīng)行為學評分比較見表1。模型組在腦缺血再灌注后7 d神經(jīng)行為學評分較再灌注6 h減小（P＜0.05）；芹菜素組在腦缺血再灌注后7 d神經(jīng)行為學評分較再灌注6 h、再灌注24 h減?。≒＜0.05），在再灌注72 h神經(jīng)行為學評分低于模型再灌注72 h組（P＜0.05）；地塞米松組在再灌注7 d神經(jīng)行為學評分較本組再灌注6 h、24 h有減?。≒＜0.05）；余各相應時間點間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1　各組大鼠缺血再灌注后不同時間點神經(jīng)行為學評分比較（分，±s）

表1　各組大鼠缺血再灌注后不同時間點神經(jīng)行為學評分比較（分，±s）

與模型組同時間比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與本組6 h時比較，■P＜0.05；與本組24 h組比較，◆P＜0.05。下同。

組別n 再灌注6 h再灌注24 h再灌注72 h再灌注7 d模型組7芹菜素組7 2.3452±0.8175 2.2031±0.8128 1.9892±0.72891.2823±0.6134■1.9889±0.6456 1.7202±0.6548 1.0223±0.5834▲0.7039±0.5846■◆地塞米松組72.2019±0.8089 1.9801±0.7376 1.1871±0.69320.7298±0.5494■◆

2.2各組大鼠腦組織梗死灶比較見圖1。假手術(shù)組腦片均紅染，未見白色梗死灶形成；模型24 h組可見尾殼核和額顳頂葉皮層白色梗死灶的融合；地塞米松24 h組及芹菜素24 h組的梗死灶較相應時間的模型組均有不同程度的減小，主要表現(xiàn)在皮層。

圖1　各組腦組織切片2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色圖

2.3各組腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織TGF-β1的表達見表2。正常腦組織TGF-β1呈極低表達。模型組、芹菜素組和地塞米松組各時間點TGF-β1的表達明顯增加，與假手術(shù)組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。模型組、芹菜素組、地塞米松組TGF-β1表達在24 h、72 h時達高峰（P＜0.01），各組24 h和72 h組之間比較無明顯差異，7 d仍有大量表達。芹菜素組和地塞米松組較同期模型組表達均有明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。芹菜素組和地塞米松組相對應時間組之間表達量無明顯差異。

表2　芹菜素和地塞米松對大鼠腦缺血再灌注后TGF-β1表達的影響（OD值，±s）

表2　芹菜素和地塞米松對大鼠腦缺血再灌注后TGF-β1表達的影響（OD值，±s）

與假手術(shù)組比較，★P＜0.01。

組別n模型組6芹菜素組6再灌注6h再灌注24h再灌注72h再灌注7d 0.2728±0.0325★0.3761±0.0327★0.3570±0.0242★◆◆0.3269±0.0243★0.3098±0.0181★▲▲0.4444±0.0206★▲▲0.4256±0.0175★▲▲0.3581±0.0181★▲▲地塞米松組60.3292±0.0170★▲▲0.4326±0.0161★▲▲0.4211±0.0277★▲▲0.3551±0.0224★▲假手術(shù)組60.1287±0.0223

3　討論

本研究結(jié)構(gòu)顯示，腦缺血再灌注時大鼠均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)行為學評分異常，但隨著再灌注時間的延長，大鼠神經(jīng)功能逐漸恢復。芹菜素組和地塞米松組神經(jīng)行為學評分與模型組比較各時間點均有下降的趨勢，其中芹菜素組72 h較同時間點各組相比差異有統(tǒng)計學意義。國內(nèi)外學者多普遍采用的TTC作為梗死區(qū)域的檢測標記［8］，其具有快速、靈敏、可靠、直觀等優(yōu)點。本實驗結(jié)果顯示各組均出現(xiàn)白色梗死灶，且腦梗死體積有自然縮小的趨勢。芹菜素組在各時間點梗死體積均較模型組有減小，與前期實驗結(jié)果［9］相符。地塞米松組在各時間點梗死體積均較模型組有減小，亦與Bertorelli等［10］實驗結(jié)果相符。

缺血性腦損傷的動物實驗研究及臨床研究發(fā)現(xiàn)腦缺血后有多種細胞因子、趨化因子、黏附分子和各種生長因子的表達［11］，而缺血周圍區(qū)的神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)歸則受到多種因素的影響。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)、少突膠質(zhì)細胞均可產(chǎn)生TGF-β1。TGF-β1是一類具有復雜功能的細胞因子，作用涉及調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、分化，參與炎癥反應和組織修復，體內(nèi)很多正常組織或細胞都能合成釋放這種因子［12］，可抑制神經(jīng)元的變性和凋亡［13］，修復受損的腦組織［14］。TGF-β1具有多種生物學效應，參與體內(nèi)多種病理和生理過程，如免疫炎癥反應、細胞生長和活化、腫瘤的發(fā)生及進展、神經(jīng)細胞的凋亡、血管的發(fā)生、超氧離子的產(chǎn)生等［15］。TGF-β1能通過調(diào)節(jié)纖連蛋白的合成促進胚胎干細胞的增殖［16］，也能通過參與調(diào)節(jié)表皮生長因子受體基因的活化而影響軟骨細胞的形成［17］，亦能參與調(diào)控軸突的生長［3］和神經(jīng)干細胞的增殖和分化［18］。在缺血性腦損傷中，TGF-β1有抗氧化、阻止細胞凋亡、調(diào)節(jié)生理反應、調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞反應的多種作用，它可通過抑制缺血早期中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應，從而減輕腦水腫、減小梗死面積、促進微血管增生［2］，對組織的修復發(fā)揮重要作用。

圖2　各組缺血側(cè)皮層TGF-β1胞漿陽性表達（DAB，400倍）

芹菜素組和地塞米松組各時間點TGF-β1的表達較同期模型組表達均有增加，以24 h、72 h組表達增加最為明顯（P＜0.01），7 d仍有大量表達。芹菜素組與地塞米松組相比差異無統(tǒng)計學意義。芹菜素是一種黃酮類化合物，能抑制大鼠腦缺血再灌注繼發(fā)的炎癥反應，降低腦毛細血管通透性和腦水腫，能通過TGF-β參與調(diào)節(jié)毛發(fā)的生長［19］。

綜上，腦缺血再灌注后大鼠出現(xiàn)神經(jīng)行為功能的改變伴有不同程度的腦梗死，TGF-β1在再灌注后表達明顯增加，而芹菜素在一定程度上改善大鼠神經(jīng)功能的缺損，并能增強腦缺血后TGF-β1表達，從而達到促進腦組織損傷的修復，達到神經(jīng)損傷的保護作用。

［1］Jickling GC，Liu D，Stamova，et al.Hemorrhagic transformation after ischemic stroke in animals and humans［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2014，34（2）：185-199.

［2］Wang Y，Hu Z，Lu W.A modulator for Golgi structural stability after cerebral ischemia-reperfusion injury［J］.See comment in PubMed Commons belowNeural Regen Res，2013，58（25）：1673-5374.

［3］Bain JM，Ziegler A，Yang Z，et al.TGF beta1stimulates the over-production of white matter astrocytes from precursors othe brain marrow in a rodent model of neonatal encephalopathy［J］.PLoS One，2010，5（3）：9567.

［4］朱榮鑫，張賽龍，金永生.黃酮類化合物抗腫瘤作用研究進展［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2010，25（1）：5-10.

［5］韓書珍，范海玲，陳翔.芹菜素對急性局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠半暗區(qū)內(nèi)小膠質(zhì)細胞的影響［J］.中草藥，2011，42（2）：312-317.

［6］Belayev L，Alonso OF，Busto R，et al.Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture：Neurological and pathological evaluation of an improved model［J］.Stroke，1996，27：1616-1623.

［7］Zea Longa EL，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［8］Goldust EJ，Paczynski RP，He YY，et al.Automated measurement of infact size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains［J］.Stroke，1996，27：1657-1662.

［9］劉嬋，涂豐霞，陳翔.芹菜素對大鼠急性腦損傷的保護作用［J］.中草藥，2009，40（10）：1598-1602.

［10］Bertorelli R，Aslarm M，Di Santo E，et al.MK801 and dexamethasone reduce both tumor necrosia factor levels and infarct volume after focal cerebral ischema in the brain［J］.Neurosci Lett，1998，246（1）：41-44.

［11］Berti R，Williams AJ，Moffett JR，et al.Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2002，22（9）：1068-1079.

［12］Raineteau，Schwab ME.Plasticity of motor systems after incomplete spinal cord injury［J］.Nat Rev Neurosci，2001，（2）：263-273.

［13］李良勇，李家林，謝成娟，等.經(jīng)鼻給予TGFβ1對癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元的保護作用［J］.中風與神經(jīng)疾病雜志，2012，29（2）：109-112.

［14］Ma M，Ma Y.Intranasal delivery of transforming growth factor-beta1 in mice after stroke reduces infarct volume and increases neurogenesis in the subventricular zone［J］.BMC Neurosci，2008，9（10）：117.

［15］Vivien D，Ali C.Transforming growth factor-beta signalling in brain disorders［J］.Cytokine&Growth Factor Reviews，2006，17（1-2）：121-128.

［16］Kim Y，H J，Ryu M，et al.Fibronectin synthesis by high glucose level mediated proliferation of mouse embryonic stem cells：Involvement of ANGⅡand TGF-betal［J］.J Cell Physiol，2010，223（2）：397-407.

［17］Takeda H，Inoue H.Activation of epidermal growth factor receptor gene is involved in transforming growth factor-betamediated fibronectin expression in a chondrocyte progenitor cell line［J］.Int J Mol Med，2010，25（4）：593-600.

［18］Sun J，Zhou W.Ischemia induced neural stem cell proliferation and differentiation in neonatal rat involved vascular endothelial growth factor and transforming growth factor-beta pathways［J］.Brain Dev，2010，32（3）：191-200.

［19］HuhS，LeeJ.Acell-basedsystemforscreeninghairgrowth-promotingagents［J］.ArchDermatolRes，2009，301（5）：381-385.

Effects of Apigenin on the Expression of Transforming Growth Factor-β1after Cerebral Ischemia-reper-fusion in Rats

WANG Guo，CHEN Xiang.Hangzhou First People′s Hospital，Zhejiang Province，Zhejiang，Hangzhou 310000，China

Objective：To investigate the effects of apigenin（APG）on the expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1）of focal cerebral ischemia-reperfusion in rats.Methods：Cerebral ischemia was induced by middle cerebra artery occlusion.The rats were randomly divided into four groups including Sham-operated，Mode，APG and Dexamethasone groups.All the operated groups were divided into different groups：reperfusion 6 h group，24 h group，72 h group and 7 d group.Neurological behavior was assessed with five score methods.After anesthesia awake，each group was given neurological behavior scores.One brain slice was observed by 2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride（TTC）stainning，and the expression of TGF-β1in another six brain slices were measured by immunohi stochemistry.Results：Neurological behavior scores of the rats in A72 h group was significant lower than those in ischemia M72 h group（P＜0.05）.Typical cortical infarct lesions in Mode group were found by TTC stainning.The expression of transforming growth factor-β1in normal brain tissue was in very low volume.The expression of transforming growth factor-β1were enhanced immediately after ischemia，and reached to peak at 24 hour and 72 hour after ischemia respectively，Apigenin could significantly increase the expressions of TGF-β1than ones at the corresponding time points in group M respectively（P＜0.05）.Conclusion：Apigenin can increase the expression of transforming growth factor-β1in transient focal cerebral ischemia and reperfusion in rats.They may repair ischemia brain tissue and improve neurological function recovery by transforming growth factor-β1.

Apigenin（APG）；Cerebral ischemia-reperfusion；2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride（TTC）；Transforming growth factor-β1（TGF-β1）

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1546-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.015

2015-05-27）

浙江省溫州市科技局國際合作項目（H20070034）

（電子郵箱：guoguo1109@163.com）