胡丹丹　樓黎明　徐慧連

（浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院，浙江杭州310005）

·研究報告·

參附注射液對膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡及Bcl-2表達的影響*

胡丹丹樓黎明徐慧連△

（浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院，浙江杭州310005）

目的觀察參附注射對膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡及Bcl-2蛋白表達的影響，探討參附注射液抗膿毒癥心肌損傷的相關機制。方法將24只雄性SD大鼠隨機分為3組：假手術組、模型組和參附組，以盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法建立膿毒癥大鼠動物模型，觀察各組大鼠心肌酶譜變化；凋亡原位末端標記法（TUNEL）檢測心肌細胞凋亡指數(shù)，以RT-PCR法檢測心肌細胞Bcl-2 mRNA表達。結(jié)果參附組大鼠心肌酶譜升高程度較模型組低（P＜0.05），模型組較假手術組心肌酶水平高（P＜0.05）；參附組大鼠心肌細胞TUNEL評分平均光密度（MOD）較模型組明顯降低（P＜0.05），模型組較假手術組升高（P＜0.05）；模型組心肌細胞Bcl-2 mRNA表達較假手術組明顯降低（P＜0.05），參附組較模型組升高（P＜0.05）。結(jié)論參附注射液能減輕膿毒癥大鼠的心肌損傷，其作用機制與上調(diào)Bcl-2 mRNA表達、減少心肌細胞凋亡相關。

參附注射液膿毒癥細胞凋亡Bcl-2

膿毒癥是感染性疾病和創(chuàng)傷性疾病應激過程中常見的并發(fā)癥，具有發(fā)病率、死亡率高的臨床特點，其高死亡率與其易導致多臟器功能損傷有直接關系，而其中有40%～50%的膿毒癥為導致心功能不全，其病理表現(xiàn)為心室擴張、收縮及舒張功能障礙［1］。心臟實質(zhì)細胞的損傷是心功能不全發(fā)生的主要原因。細胞凋亡在膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，已有的試驗已證明抗凋亡治療有逆轉(zhuǎn)膿毒癥心肌損傷的作用［2］。而在中醫(yī)學膿毒癥認識中，心功能不全多責之于邪氣損傷心陽、心陽不足。參附注射液具有溫陽祛邪的作用，尤其多用于癥見心陽不足的患者，而對其抗膿毒癥心肌損傷的機制探討較少。因此本研究通過觀察參附注射液對大鼠膿毒癥模型心肌損傷標記物、心肌細胞凋亡指數(shù)及Bcl-2 mRNA表達的影響，探討參附注射液對膿毒癥大鼠心臟實質(zhì)細胞損傷的保護作用?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1動物雄性清潔級SD大鼠，24只，體質(zhì)量（200± 20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。造模前于實驗動物中心，適應性喂養(yǎng)7 d。

1.2藥物與試劑參附注射液（雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：國藥準字Z20043117）。戊巴比妥鈉。氯仿，異丙醇，二硫代蘇糖醇，RNasin，dNTP，隨機引物，DNaseI，逆轉(zhuǎn)錄酶，SYBR I，50×Calibration，HS ExTaq酶及10×Buffer等；TNF-α ELISA試劑盒（煙臺賽爾斯公司）；LightShift化學發(fā)光EMSA試劑盒（Pierce，美國）等。低溫離心機；紫外分光光度計；電泳轉(zhuǎn)膜裝置；數(shù)顯恒溫水浴鍋；Model 550酶標儀；BioSenSC300凝膠圖像分析系統(tǒng)；PTC-225 Peltier Thermal Cycler；Rotor-Gene RG-3000 Real-Time Thermal Cycler等。

1.3分組與造模按體質(zhì)量隨機將24只SD大鼠分為假手術組、模型組和參附組，每組8只動物。膿毒癥模型制備方法參照文獻報道以盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法制備膿毒癥模型［3］。模型組大鼠行CLP術后，分別于0、6、12 h尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液5 mL/kg，參附組分別于CLP術后0、6、12 h行尾靜脈注射參附注射液5 mL/kg。

1.4標本采集與檢測各組于CLP術后24 h分別麻醉并腹主動脈采血處死，留取心肌組織行相關指標檢測；假手術組麻醉后開腹翻動腸道，關腹，24 h后麻醉，腹主動脈采血處死，留取心肌組織行相關檢測。應用自動生化分析儀檢測心肌損傷標志物，指標包括心肌肌酸激酶（CK）和心肌肌酸激酶同工酶（CK-MB）。TUNEL法檢測肺組織細胞凋亡取心肌組織，制備石蠟切片。具體方法依照試劑盒說明書。熒光定量PCR法檢測心肌Bcl-2 mRNA水平，總RNA提取方法如下：1）約100 mg組織于冰浴勻漿器中，冰上迅速研磨成勻漿液，加入1 mL Trizol，劇烈震蕩，室溫放置5 min。2）加入0.2 mL的氯仿，蓋好后漩渦劇烈震蕩15 s，室溫放置2～3 min，然后離心12000 r/min，15 min，4℃。離心后分成3層，下面的紅色為酚-氯仿相，1個中間層，一面是無色的水相。RNA只存在于水相中。3）將上層水相轉(zhuǎn)移到另一干凈的EP管中，加入等體積的異丙醇，靜置30 min，-20℃，然后離心12000 r/min，15 min，4℃。4）去上清液，加入1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，振蕩器混勻，離心7500×g，5 min，4℃。5）去上清，置真空或空氣中5～10 min，干燥RNA沉淀。根據(jù)沉淀的量加入適量的RNase free水溶解RNA，去除基因組DNA；RNA定量后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；引物序列為Bcl-2（110bp），F(xiàn)：5′-AGTACCTGAACCGGC ATCTG-3。R：5′-CAGCCAGGAGAAATCAACAG-3′。GAPDH（130bp），F(xiàn)：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3。R：5′-GGCATG GACTGTGGTCATGAG-3′。以總cDNA為模板進行實時定量PCR，應用相對定量方法分析各樣本的ΔCt值（ΔCt=母的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值），再依據(jù)ΔΔCt值=實驗組ΔCt值-對照組ΔCt值計算2-ΔΔCt的值。當目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率接近時，2-ΔΔCt的值表示目的基因在實驗組樣本中相對于對照組樣本的表達倍數(shù)。

1.5統(tǒng)計學處理應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件處理。各項計量資料以（±s）表示。采用單因素方差分析；方差齊性選用LSD檢驗，方差不齊采用Dunnett’s T3法檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠心肌酶譜水平比較見表1。與假手術組比較，模型組、參附組大鼠血清CK-MB、CK較假手術組明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，參附組大鼠血清CK-MB、CK較模型組明顯降低（P＜0.05）。

表1　各組大鼠心肌酶水平比較（U/L，±s）

表1　各組大鼠心肌酶水平比較（U/L，±s）

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別nCK-MBCK假手術組82187.41±556.631189.40±245.87模型組84208.51±382.57*3216.75±565.42*參附組83584.59±347.06*△1986.21±366.73*△

2.2各組大鼠心肌細胞凋亡比較見表2和圖1。各組均可見凋亡細胞，模型組、參附組大鼠心肌細胞TUNEL評分平均光密度（MOD）均高于假手術組（P＜0.05）；參附組MOD較模型組明顯降低（P＜0.05）。

表2　各組大鼠心肌細胞MOD及Bcl-2 mRNA表達比較（±s）

表2　各組大鼠心肌細胞MOD及Bcl-2 mRNA表達比較（±s）

組別n假手術組8模型組8參附組8 MOD（U/L）Bcl-2 mRNA（10-3）0.09±0.055.75±0.09 0.24±0.11*3.83±0.07*0.18±0.09*△4.86±0.08*△

圖1　各組大鼠心肌細胞凋亡情況（20倍）

2.3各組大鼠心肌組織Bcl-2 mRNA表達水平變化見表2。模型組、參附組大鼠心肌Bcl-2 mRNA均較假手術組明顯降低（P＜0.05）；參附組大鼠心肌Bcl-2 mRNA與模型組明顯升高（P＜0.05）。

3　討論

膿毒癥可使多個器官同時受損，而心臟是其損傷最為重要的靶器官。心肌酶屬胞漿酶，組織損傷時由于細胞膜的完整性破壞而釋放出來，血清CK、CK-MB是最常用的心肌損害指標。CK-MB絕大部分存在于心肌細胞內(nèi)，是心肌細胞特異性酶，能夠及時反映心肌損害的程度；CK主要分布在骨骼肌、心肌和腦組織。本實驗結(jié)果顯示，模型組和治療組兩種酶均有不同程度的升高，與假手術組比較有顯著差異，表明CLP動物存在心肌的病理損傷。治療組與模型組比較，兩種酶均有所降低，表明參附注射液對膿毒癥心肌損傷有一定的保護作用。

研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥心肌損傷除與心肌細胞低氧、線粒體損傷能量代謝障礙有關，還與心肌細胞凋亡有關［1］。膿毒癥心肌細胞的凋亡過程涉及多條信號轉(zhuǎn)導通路，其中線粒體途徑是最重要的通路之一［4］。Bcl-2是此途徑中的關鍵調(diào)節(jié)因子，有抑制凋亡作用。Bcl-2表達占優(yōu)勢時可阻止細胞凋亡［5］。在小鼠CLP模型，抗凋亡蛋白Bcl-2的過表達可抑制巨噬細胞和樹突狀細胞的細胞凋亡［6］，腸道特異Bcl-2過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠膿毒癥死亡率較其他小鼠低［7］。陳華文等［8］研究亦發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠心肌細胞Bcl-2蛋白表達下降，心肌細胞凋亡增加。本研究顯示，模型組及參附組大鼠心肌Bcl-2 mRNA表達均高于假手術組，心肌細胞凋亡增加，均有統(tǒng)計學差異。

中醫(yī)學認為正氣不足是膿毒癥發(fā)生之根本。“正氣存內(nèi)，邪不可干”“邪之所湊，其氣必虛”，從根本上闡明了疾病發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在“正虛”因素，也為扶正祛邪防治膿毒癥及膿毒癥器官損傷提供了理論依據(jù)?！秲?nèi)經(jīng)》有“少火生氣，壯火食氣”的論述，膿毒癥邪氣傷人，先傷臟腑之功能，后則損及形質(zhì)，重癥膿毒癥的高熱階段必然耗損正氣，甚則陽氣耗散，膿毒癥心臟損傷，也表現(xiàn)為先傷及心陽而后心之形質(zhì)受損?！瓣柣瘹狻㈥幊尚巍?，膿毒癥時邪氣損傷心陽，心陽受損、氣化失司，陰血不生，臟腑失養(yǎng)而進一步加劇心臟功能障礙。因此溫陽益氣是治療膿毒癥心臟損傷的關鍵，通過溫心陽，心陽恢復、氣化得行則陰血自生，從而恢復正常的臟腑功能。

膿毒癥心肌損傷，為邪氣盛實，心陽虛衰。參附注射液由紅參、附子組成，主要有效成分為人參皂苷和烏頭堿，具有溫陽益氣養(yǎng)心、回陽救逆之效。臨床常用于膿毒癥而癥見胸悶、氣促、悸動不安、動則尤甚等心陽不足證候者。參附注射液具有抗缺血再灌注損傷、改善心臟功能、抗休克、增強心肌收縮力等作用。江榮林等［9］研究表明，參附注射液能夠顯著改善膿毒癥患者的組織缺氧。邱澤亮等［10］則發(fā)現(xiàn)參附注射液可以降低嚴重膿毒癥患者急性生理和慢性健康狀況評分（APACHE）Ⅱ、Marshall評分及白介素-6（IL-6）和C反應蛋白（CRP）水平，明顯升高CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細胞和單核細胞HLA－DR，提示參附注射液能夠調(diào)節(jié)促炎和抗炎的平衡，并雙向調(diào)節(jié)膿毒癥導致的免疫紊亂。本研究顯示，與模型組比較，參附組大鼠心肌Bcl-2 mRNA表達較模型組上調(diào)，細胞凋亡明顯減少，心肌損傷酶學指標較模型組降低。通過上述實驗分析，可證明參附注射液可以通過上調(diào)心肌細胞Bcl-2 mRNA表達，減少膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡，改善膿毒癥相關的心肌損傷。

膿毒癥心肌損傷機制繁多，同時也存在其他治法及方劑使用的臨床及實驗報道，對于參附注射液逆轉(zhuǎn)膿毒癥心肌損傷的劑量療效關系、其他作用機制及與其他治法方劑的比較仍需進一步實驗證實。

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［4］Buerke U，Carter JM，Schlitt A，et al.Apoptosis contributes to septic cardiomyopathy and is improved by simvastatin therapy［J］.Shock，2007，29（4）：497-503.

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［8］陳華文，馮俊，李樹生.丹參酮ⅡA對膿毒癥大鼠心肌凋亡的保護作用［J］.中國藥學雜志，2013，48（17）：1267-1271.

［9］江榮林，雷澍，王靈聰，等.參附注射液對重度膿毒癥患者組織氧代謝的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2009，24（7）：965-967.

［10］邱澤亮，葉一萍，張寧，等.參附注射液對嚴重膿毒癥免疫調(diào)節(jié)的前瞻性研究［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2012，31（2）：363-366.

Effect of Shenfu Injection on the Cardiomyocyte Apoptosis and the Expression of Bcl-2 in Rat with Sepsis

HU Dandan，LOU Liming，XU Huilian.The Third Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310005，China

Objective：To investigate the anti-myocardial injury mechanism of Shengfu Injection by the change of myocardial enzyme and the expression of Bcl-2 and myocardial cell apoptosis in rat model with sepsis.Methods：24 male SD rats were randomly divided into three groups：the sham-operated group，the model group and the Shenfu group，8 rats in each.Rat sepsis models were established with CLP.The change of myocardial enzyme spectrum was observed.Myocardial apoptosis was detected with TUNEL，and the expression of Bcl-2 mRNA in myocardial cell was detected with RT-PCR.Results：The rise of myocardial enzyme spectrum in Shengfu Injection group was lower than that of the model group（P＜0.05）.Myocardial enzyme level of the model group was higher than that of the sham-operated group（P＜0.05）.TUNE L scores of cardiac muscle cells and MOD of Shengfu Injection group was lower than that of the model group（P＜0.05），and higher than that of the sham-operated group（P＜0.05）.The expression level of Bcl-2 mRNA in myocardial cell of model group was lower than the sham-operated group（P＜0.05），while the Shengfu Injection group was higher than the model grou（P＜0.05）. Conclusons：Shengfu Injection can alleviate injury in cardiac muscle caused by sepsis by upregulating the expression level of BCL-2 and reducing myocardial apoptosis.

Shengfu Injection；Sepsis；Apoptosis；Bcl-2

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1540-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.013

2015-04-18）

浙江中醫(yī)藥大學科研項目（2010LX22）；浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院一般項目（ZS10CA15）

（電子郵箱：xhl9366@163.com）