宋志敏，劉海平，2

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，浙江溫州325035;2.溫州醫(yī)科大學(xué)低氧醫(yī)學(xué)研究所，浙江溫州325035)

人類血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)，又稱為肽基二肽酶A(peptidyl dipeptidase A)，是由ACE基因編碼的一種含鋅的金屬糖蛋白，其分子量為150 000 KD。編碼ACE蛋白的基因序列第16號內(nèi)含子上存在一段287 bp片段的插入(insertion，I)/缺失(Deletion，D)多態(tài)，該多態(tài)位點與血清ACE水平有顯著關(guān)聯(lián)性，II、ID及DD基因型受試者ACE濃度分別為(299.3±49)、(392.6±66.8)和(494.1 ±88.3)μg/L［1］。有研究報道，攜帶I等位基因受試者，其自身血清ACE水平較低，下調(diào)的ACE活性可以通過減輕心臟的后負(fù)荷壓力來增加心輸出量和毛細(xì)血管的密度，改善運動時骨骼肌血液的供給，維持工作能力［2］。目前關(guān)于ACE基因I/D多態(tài)性與運動能力的遺傳學(xué)研究，多集中在該基因多態(tài)性與有氧耐力、速度耐力、力量素質(zhì)的關(guān)聯(lián)性研究方面，其中有氧耐力的可訓(xùn)練性與ACE基因I/D的多態(tài)關(guān)聯(lián)性研究成為各國學(xué)者關(guān)注的焦點。楊賢罡等基于ACE基因I/D多態(tài)性與耐力素質(zhì)的關(guān)聯(lián)性研究的Meta分析研究報道，歐洲人群中II型純合子與優(yōu)秀耐力素質(zhì)明顯關(guān)聯(lián)，中國漢族人群未發(fā)現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)［3］。

關(guān)于ACE基因I/D多態(tài)位點與低氧訓(xùn)練效果的關(guān)聯(lián)研究較少報道。周付濤等研究報道［4］II型基因型可能參與高原低氧適應(yīng)的調(diào)節(jié)。鑒于ACE的生物學(xué)功能，其基因多態(tài)性也有可能與低氧訓(xùn)練效果的個體差異性有關(guān)。本研究選取位于ACE基因序列16號內(nèi)含子I/D多態(tài)，研究該多態(tài)位點基因型(genotype)與平原人群進行高住－高練－低訓(xùn)(living high-exercise high-training low，HiHiLo)過程中生理表型指標(biāo)變化關(guān)聯(lián)性，探究運動員低氧訓(xùn)練過程中生理表型指標(biāo)改善效果與遺傳學(xué)基因標(biāo)記的關(guān)聯(lián)性。

1 研究方法

1.1 研究對象

選35名體質(zhì)水平相近的健康受試者(男性23名、女性12名)，均系中國北方漢族人群，且所有受試者無低氧暴露經(jīng)歷。受試基本情況見表1。

表1 受試者基本情況(±S)

表1 受試者基本情況(±S)

N年齡/yr 身高/cm 體重/kg 35 19.54±2.55 177.94±4.27 68.07±5.579

1.2 研究方案

本實驗采用關(guān)聯(lián)研究方法(Association Study)，研究受試者ACE基因I/D多態(tài)性與HiHiLo低氧訓(xùn)練后生理表型指標(biāo)關(guān)聯(lián)性。所有受試者每天在氧濃度為15.4%的低氧艙內(nèi)(相當(dāng)于海拔2 500 m高度)休息和睡眠，低氧暴露時間≥10 h/d(pm 8:00－am 6:00，低氧環(huán)境由Hypoxic Tent System TM”和“CAT Hatch TM(美國產(chǎn))設(shè)備制造，由CNJK-AT(中國，天津)監(jiān)測控制系統(tǒng)檢測O2、CO2濃度)，白天在海拔50m的常氧環(huán)境下訓(xùn)練、生活。每周在氧濃度為15.4%的低氧環(huán)境下進行3次70%O2max強度蹬功率車運動(MONARK 818功率自行車，瑞典)，每次30 min，功率自行車轉(zhuǎn)速為60轉(zhuǎn)/min，HiHiLo低氧實驗持續(xù)4周。

生理指標(biāo)測試:HiHiLo低氧實驗前后分別測試最大攝氧量(maximal oxygen uptake，O2max)、血象(hematological parameters)等生理表型指標(biāo)。O2max測試(MedGraphicsVO2000便攜式氣體代謝分析儀，美國)采用遞增負(fù)荷運動實驗，受試者以60 W為起始運動強度，蹬功率車轉(zhuǎn)速為每分鐘60轉(zhuǎn)，每級負(fù)荷運動持續(xù)3 min，3 min后遞增30 W，直至運動力竭;血象指標(biāo)采用BECKMAN STKS型全自動血細(xì)胞分析儀(日本)進行，受試者晨起空腹抽取靜脈血0.5 ml，血象測試指標(biāo)主要包括紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)等。

ACE基因I/D多態(tài)性分析:抽取受試者靜脈血2ml，2%EDTA抗凝，采用DNA提取專用試劑盒提取受試者DNA(promega公司)。依據(jù)人類ACE基因序列16號內(nèi)含子上一段基因序列設(shè)計上、下游引物(Primer 5.0)，上、下游引物分別為:5’-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3’;5’-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGAT-3’(上海生工)。20 μL PCR反應(yīng)擴增體系(LifePro Thermal Cycler，中國杭州)(2 μL 的 10 × PCR Buffer，1.2 μL 的 25 mM MgCl2，10 mM dNTP 各 1 μL，0.5 μL 的 10 pmol上、下引物，Taq酶2 U，模板100 ng)。擴增方案包括40 s 94℃變性;40 s 54℃退火;40 s 72℃延伸，共進行35個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳(80 V)40 min，EB熒光染色，紫外透射儀下觀察結(jié)果并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計包(SPSS software for Windows 11.5 package)統(tǒng)計分析。哈溫(Hardy-weinberg)遺傳平衡定律檢驗采用卡方檢驗(chi square-test，χ2)處理;不同基因型受試者低氧訓(xùn)練前、后生理表型指標(biāo)統(tǒng)計處理，分別采用單因素方差分析(ANOVA)和協(xié)方差分析進行。所有數(shù)據(jù)以(±S)表示，顯著水平設(shè)為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 ACE基因I/D多態(tài)性的分析結(jié)果

35名受試者ACE基因I/D解析結(jié)果顯示(圖1)，II、ID及 DD基因型頻率分別為40%、51%，和9%，其中I等位基因頻率占66%，D等位基因頻率占34%。受試人群基因型的Hardy-weinberg遺傳定律通過卡方檢驗處理，結(jié)果顯示，χ2值為0.699(P＞0.05)，符合Hardy-weinberg平衡遺傳定律，表明該樣本具有群體代表性。

圖1 ACE基因酶切產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖

2.2 ACE基因I/D多態(tài)性與HiHiLo低氧訓(xùn)練后生理表型指標(biāo)變化的關(guān)聯(lián)性

HiHiLo低氧訓(xùn)練前后，ACE基因I/D多態(tài)性不同基因型受試者O2max、Hb、RBC 等生理表型指標(biāo)變化見表2。結(jié)果顯示，低氧訓(xùn)練前，ACE基因不同基因型受試者之間O2max、Hb、RBC 指標(biāo)均無顯著性差異。

表2 HiHiLo低氧訓(xùn)練后ACE基因I/D多態(tài)性基因型生理表型指標(biāo)變化(±S)

表2 HiHiLo低氧訓(xùn)練后ACE基因I/D多態(tài)性基因型生理表型指標(biāo)變化(±S)

注:＆:P＜0.10，與ID、II型相比;*:P＜0.05，與ID型相比。圖2同。

指標(biāo)基因型II(14) ID(18) DD(3)基礎(chǔ)值rO2max(ml/min·kg)49.21±3.8149.59±4.8752.40±2.43 O2max(ml/min)3484.58±394.03 3275.03±454.37 3587.43±395.27 Hb(g/L) 148.81±17.08 146.19±13.87 145.77±14.69 RBC(×1012/L) 4.70±0.54 4.71±0.46 4.73±0.30變化量ΔrO2max(ml/min·kg)0.85±4.290.31±3.433.30±0.87＆ΔO2max(ml/min)45.45±315.1011.39±221.03228.10±72.13*ΔHb(g/L) －0.52±8.88 －0.24±6.86 2.53±9.92 ΔRBC(×1012/L)0.19±0.43 0.12±0.42 0.33±0.56

4周HiHiLo低氧訓(xùn)練后，ACE基因不同基因型受試者間 ΔO2max存在明顯差異(P ＜0.05)，DD 基因型受試者增加了(228.10±72.13)ml/min，提高了6.4%，ID基因型受試者增加了(11.39±221.03)ml/min，僅提高 0.3%;同時，ΔrO2max也表現(xiàn)出 DD基因型受試者改善優(yōu)于II、ID基因型趨勢(P＜0.1，表2，圖2)，DD基因型受試者最大攝氧量相對值變化量與低氧訓(xùn)練前相比提高了6.3%，而II和ID基因型受試者則分別提高1.7%和0.6%。4周HiHi-Lo低氧訓(xùn)練后，Hb和RBC變化量未顯現(xiàn)出基因型組間差異(表2)。

圖2 ACE基因I/D多態(tài)不同基因型間rO2max、O2max變化比較

3 討論

低氧環(huán)境下，低氧濃度信號刺激機體產(chǎn)生一系列生理適應(yīng)性變化，低氧適應(yīng)的優(yōu)劣，對人類在低氧環(huán)境下的運動、生活會產(chǎn)生重要的影響。目前，國內(nèi)外很多運動員進行低氧訓(xùn)練(包括傳統(tǒng)高原訓(xùn)練及人工低氧訓(xùn)練等)，以獲得低氧訓(xùn)練適應(yīng)，提高身體機能能力。但因不同個體對低氧環(huán)境適應(yīng)所表現(xiàn)出的生理反應(yīng)差異性，導(dǎo)致產(chǎn)生了不同的低氧訓(xùn)練適應(yīng)效果。大量研究表明，不同低氧訓(xùn)練效果差異性與遺傳學(xué)因素有著密切關(guān)聯(lián)［5－6］。2010年 SCIENCE雜志報道，人類對低氧環(huán)境適應(yīng)與遺傳因素有著高度緊密關(guān)聯(lián)［7］。本文選取ACE基因16內(nèi)含子上I/D多態(tài)性，探究其與低氧訓(xùn)練效果個體差異關(guān)聯(lián)性。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4周HiHiLo低氧訓(xùn)練后，ACE基因I/D多態(tài)與低氧訓(xùn)練后最大攝氧量變化存在著一定的關(guān)聯(lián)性，DD基因型受試者最大攝氧量絕對值的變化量與ID基因型受試者相比有顯著性提高，DD基因型受試者提高6.4%，而ID基因型受試者僅提高0.3%，且DD基因型受試者最大攝氧量相對值變化量與低氧訓(xùn)練前相比提高了6.3%，而II和ID基因型受試者則分別提高1.7%和0.6%，DD基因型有優(yōu)于II、ID基因型的趨勢。但本研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)ACE基因I/D多態(tài)與血象指標(biāo)關(guān)聯(lián)性。

人類ACE基因是由26個外顯子(exon)和25個內(nèi)含子(intron)組成，位于染色體17q23區(qū)域，其轉(zhuǎn)錄表達的ACE是膜結(jié)合糖蛋白，是一種二肽羧肽酶，ACE在體內(nèi)的生理作用主要是將十肽血管緊張素-I的C末端亮氨酸和組氨酸殘基的肽腱水解，生成八肽的血管緊張素-II，血管緊張素II具有收縮血管和氣管平滑肌作用，同時，血管緊張素II在腎素－血管緊張素系統(tǒng)能刺激醛固酮分泌，促進腎小管對鈉、鉀離子的重吸收，增加血容量，對于心臟具有正性肌力作用和變時作用［8］。有研究報道，ACE基因I/D多態(tài)性與血清ACE水平有關(guān)，I等位基因攜帶者可能具有較低氧血清ACE水平［1］，Woods DR報道，較低的血清ACE水平可緩解血管緊張度，降低心臟后負(fù)荷，達到增加心輸出量效果;此外，促進可促使骨骼肌和心肌吸收葡萄糖和氨基酸，提高能量物質(zhì)的儲存和利用;較低的血清ACE水平，可減少血管緊張素II的生成，調(diào)節(jié)激素和水鹽平衡，從而提高機體在低氧環(huán)境下的有氧工作能力［9］。由此推理，攜帶I等位基因受試者可能具有較好的低氧適應(yīng)能力。Droma等研究報道［10］，具有較好低氧適應(yīng)能力的夏爾巴人群I等位基因頻率明顯高于平原人群;樊輝娟等觀察ACE基因I/D多態(tài)性在藏、漢人群中分布發(fā)現(xiàn)，生活在海拔3 500m左右藏族人群I等位基因頻率、II基因型頻率明顯高于生活在同一地區(qū)的漢族人群，且藏族人群血清ACE水平也明顯低于漢族人群［11］。平原人群進入高原低氧環(huán)境中是否也表現(xiàn)為I等位基因攜帶者優(yōu)于D等位基因攜帶者呢?

從本研究發(fā)現(xiàn)，ACE基因I/D多態(tài)性中DD基因型受試者經(jīng)4周HiHiLo訓(xùn)練后，O2max絕對值、相對值改善程度優(yōu)于II、ID基因型。但這一結(jié)果由于DD基因型例數(shù)較少，有待于進一步驗證。前期關(guān)于ACE基因I/D多態(tài)性與運動能力關(guān)聯(lián)研究較多，但這些研究結(jié)果存在著一些差異。早期Montgomery報道［12］，25名英國優(yōu)秀運動員ACE基因II基因型頻率顯著高于對照組;Cieszczyk、Ahmetov等分別觀察ACE基因I/D多態(tài)性在波蘭和俄羅斯優(yōu)秀運動員分布特點發(fā)現(xiàn)，優(yōu)秀運動員中I等位基因及II基因型頻率明顯高于對照組［13－14］。但ACE基因I/D多態(tài)性在中國北方漢族優(yōu)秀耐力項目運動員中，并未發(fā)現(xiàn)運動員組和對照組之間存在顯著性差異［15］。此外，Amir等的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)［16］，以色列優(yōu)秀馬拉松運動員DD基因型頻率和D等位基因頻率顯著高于短跑運動員與健康普通對照組;2000年Rankinenr報道［17］，高加索人種進行20周耐力訓(xùn)練后，DD純合子O2max水平顯著增加，與II基因型受試者相比，在50W的負(fù)荷下，DD基因型受試者的心率下降了36%。2012年，有一項關(guān)于ACE基因I/D多態(tài)性與HiHiLo低氧訓(xùn)練敏感性的關(guān)聯(lián)研究指出［18］，II、ID基因型受試者有HiHiLo低氧訓(xùn)練敏感性趨勢，這與本研究結(jié)果趨勢性變化存在著不同。通過分析該項研究發(fā)現(xiàn)，該研究僅通過比較各組基因型受試者低氧訓(xùn)練自身前后生理表型指標(biāo)差異顯著，且低氧訓(xùn)練后，基因型組間生理表型指標(biāo)變化量無統(tǒng)計學(xué)差異的基礎(chǔ)上得出上結(jié)論，這可能不夠確切。

4 結(jié)論

研究結(jié)果提示，ACE基因I/D多態(tài)性與HiHiLo低氧訓(xùn)練后O2max變化可能存在著一定的關(guān)聯(lián)性。但限于本研究樣本數(shù)量相對偏少，因此，所得結(jié)論有待于今后進一步驗證。

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