丘秀珍，王少玲，湯惠儀

（韶關(guān)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東韶關(guān)512005）

基質(zhì)固相分散-HPLC法測定水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫

丘秀珍，王少玲，湯惠儀

（韶關(guān)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東韶關(guān)512005）

建立了基質(zhì)固相分散-液相色譜法快速測定水產(chǎn)品中的孔雀石綠和結(jié)晶紫的新方法。將魚肉樣品粉碎后與C18填料研磨混合，裝柱、淋洗，洗脫液濃縮后用高效液相色譜檢測。色譜條件：色譜柱Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×150 mm），乙腈和乙酸銨緩沖溶液體積比80∶20作流動(dòng)相等度洗脫，流速1.00 mL/min，檢測波長254 nm。結(jié)果表明，孔雀石綠和結(jié)晶紫在0.30 μg/L～30.00 μg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.999，檢測限（S/N=3）分別為：0.18 ng/g和1.10 ng/g，樣品加標(biāo)回收率分別為86.28%～98.79%和82.51%～93.71%，其精密度RSD均小于5%（n=5）。

基質(zhì)固相分散萃?。桓咝б合嗌V；孔雀石綠；結(jié)晶紫

孔雀石綠（MG）、結(jié)晶紫（CV）同屬于堿性三苯甲烷類染料。因價(jià)格低廉、使用方便，在水產(chǎn)品養(yǎng)殖、保鮮和運(yùn)輸過程中，經(jīng)常被作為殺菌劑和抗寄生蟲藥，用于防治各種水產(chǎn)品的水霉病、真菌及原生動(dòng)物感染等，以延長魚類的存活時(shí)間。試驗(yàn)研究表明，孔雀石綠、結(jié)晶紫由于其化學(xué)官能團(tuán)三苯甲烷，所以具有高毒素，可產(chǎn)生致癌、致畸、致突變等副作用［1］。水產(chǎn)品質(zhì)量事關(guān)國計(jì)民生，因此，對水產(chǎn)品中的MG及CV殘留的檢測與監(jiān)控尤為重要。目前，對孔雀石綠、結(jié)晶紫殘留量檢測方法主要有微生物法［2］、高效液相色譜法［3-4］和高效液相色譜-質(zhì)譜法［5］。高效液相色譜法是MG及CV殘留的主要分析方法，但其檢測之前需要一系列繁瑣的樣品提取和凈化步驟。

基質(zhì)固相分散（Matrix Solid-Phase dispersion，MSPD）是由Barker等人提出的一種新型樣品前處理方法［6］，其原理在于分散劑對樣品結(jié)構(gòu)和生物組織的完全破壞和高度分散，從而大大增加了萃取溶劑的與樣品中目標(biāo)分子的接觸面積，達(dá)到快速溶解分離的目的。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于集樣品勻化、提取和凈化過程于一體，其操作快速簡單，非常適合于固體、半固體樣品（包括生物組織）的處理。目前廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留、獸藥殘留和添加劑檢測［7-10］，但尚未見用于水產(chǎn)品中的MG及CA殘留的檢測的報(bào)道。本研究以基質(zhì)固相分散和高效液相色譜法為基礎(chǔ)，建立一種同時(shí)檢測魚肉中MG及CV殘留的分析方法。本文首次將MSPD技術(shù)用于水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫的分析。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器（PDA）：島津；KQ-3200B型超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；電子分析天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；高速離心機(jī)：北京貝瑞生物有限公司；6 mL固相萃取小柱（空柱）。

孔雀石綠、結(jié)晶紫（純度均＞99%，天津迪馬科技公司）、乙腈、甲醇（色譜純）；十二烷基硫酸鈉（SDS）、正丁醇、庚烷、冰醋酸、乙酸銨、乙酸乙酯、正己烷、無水乙醇、丙酮（分析純）；C18填料（20 μm～60 μm）；活性炭、聚乙酰胺粉末（200目～300目）。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取一定量的孔雀石綠和結(jié)晶紫，用乙腈溶解后配置成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放置在冰箱中，備用。取一定量的孔雀石綠和結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成0.30、0.60、3.00、6.00、12.00、24.00、30.00 μg/mL系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.2.4色譜條件進(jìn)樣，用峰面積作縱坐標(biāo)，溶液濃度作橫坐標(biāo)繪制孔雀石綠和結(jié)晶紫標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2分散劑的預(yù)處理

稱取2.0 g C18填料，裝人50 mL注射器中，分別用20 mL的正已烷、乙酸乙酯和甲醇依次淋洗活化，60℃真空干燥，貯于磨口玻璃瓶中，備用。

1.2.3樣品前處理

將活草魚、鯽魚去皮取肉后切成小塊用勻漿機(jī)把樣品絞碎混勻，于-18℃保存?zhèn)溆?。稱取2.0 g已處理的C18填料和1.0 g已絞碎的魚肉置于瑪瑙研缽中，加入0.50 mL 3.0 μg/mL的孔雀石綠和結(jié)晶紫的標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻研磨15 min，使魚肉組織和C18填料及標(biāo)準(zhǔn)溶液混合均勻。將樣品緊實(shí)裝入6 mL的固相萃取小柱中。依次用20 mL正己烷（棄去洗滌液）、20 mL乙酸乙酯和30 mL乙腈進(jìn)行淋洗，真空抽干，收集洗脫液，洗脫液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干后用空氣流吹干，用1 mL乙腈溶解殘?jiān)?，?jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后，直接進(jìn)液相色譜分析。操作流程如圖1所示。

圖1　基質(zhì)固相分散萃取流程圖Fig.1The flow chart of Matrix solid-phase dispersion extraction

1.2.4色譜條件

色譜柱：InertsilODS-SP柱（5μm，4.6mm×150mm）；流動(dòng)相：乙腈∶乙酸銨緩沖液（體積比）=80∶20；流速：1.00 mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2結(jié)果與討論

2.1色譜條件的優(yōu)化

2.1.1流動(dòng)相的種類的選擇

考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-乙酸銨3種不同的流動(dòng)相對孔雀石綠和結(jié)晶紫的洗脫能力。研究發(fā)現(xiàn)用甲醇-水和乙腈：水作流動(dòng)相為時(shí)，孔雀石綠的色譜峰強(qiáng)度不高，而結(jié)晶紫幾乎洗脫不出來；用乙腈-乙酸銨作流動(dòng)相時(shí)，兩物質(zhì)在8 min內(nèi)得到較好分離，且柱壓較低。故選用乙腈-乙酸銨作流動(dòng)相。

2.1.2流動(dòng)相的比例的選擇

在流速為1.00 mL/min時(shí)，考察了乙腈-乙酸銨體積比分別為90∶10、85∶15、80∶20、70∶30、60∶40時(shí)對孔雀石綠和結(jié)晶紫的洗脫能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著乙腈的比例不斷減少，兩組分流出色譜柱的時(shí)間增長。在保證分離度和峰形的情況下，乙腈：乙酸銨的體積比為80∶20時(shí)，出峰時(shí)間最適宜（見圖2）。

圖2　孔雀石綠和結(jié)晶紫的色譜圖Fig.2The chromatograms of Malachite green and crystal violet

2.2基質(zhì)固相分散萃取條件的優(yōu)化

2.2.1分散劑種類的選擇

分散劑的選擇是影響MSPD富集效果的主要因素之一。MSPD也具有類似色譜分離中的待分離組分與固定相的相互作用所構(gòu)成的保留作用。應(yīng)根據(jù)待測物-分散劑表層的鍵合特征，選擇合適極性的分散劑，一般選擇具有親脂性的C18和C8填充料。本文選擇了不同極性的活性炭、C18、硅膠、聚酰胺4種基體作分散劑，按1.2.3條件處理樣品，進(jìn)樣測定，計(jì)算孔雀石綠和結(jié)晶紫的平均回收率見圖3。

圖3　分散劑種類對MG及CV加標(biāo)回收率的影響Fig.3The influence of dispersant type on addition recovery rate of MG and CV

由圖3可知，在相同條件下做樣品加標(biāo)試驗(yàn)，活性炭對MG及CV幾乎沒保留；用C18作分散劑時(shí)，MG及CV的樣品加標(biāo)平均回收率均大于90%。故選用C18作分散劑。

2.2.2洗脫溶劑種類的選擇

研究了正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙腈4種溶劑作洗脫劑對孔雀石綠和結(jié)晶紫的洗脫效果洗脫能力，見圖4。

由圖4數(shù)據(jù)可知，正己烷對孔雀石綠和結(jié)晶紫幾乎無洗脫能力，只能洗掉C18柱上結(jié)合力很小的一些雜質(zhì)；乙酸乙酯可洗脫部分孔雀石綠和結(jié)晶紫，但洗脫能力較弱；甲醇和乙睛的洗脫能力強(qiáng)，孔雀石綠和結(jié)晶紫回收率的回收率均達(dá)到80%以上，乙腈作洗脫溶劑，回收率更高，故選擇乙腈作洗脫液。

圖4　不同洗脫劑種類的回收率Fig.4Recoveries of different eluting conditions

2.2.3洗脫劑種類及用量的選擇

只用純乙腈作洗脫機(jī)，孔雀石綠和結(jié)晶紫的回收率只有80%左右。為提高回收率，試驗(yàn)選用混合溶劑，研究比較了不同洗脫劑的種類和用量的回收率，詳見表1。

表1　洗脫劑用量對回收率的影響Table 1The influence of dosage of eluent on recovery

由以上試驗(yàn)可知，洗脫劑乙腈的用量越多，兩物質(zhì)的回收率越高，當(dāng)洗脫劑的用量大于20 mL正己烷+20 mL乙酸乙酯+30 mL乙腈時(shí)，兩物質(zhì)的回收率均變化不大，說明這時(shí)孔雀石綠和結(jié)晶紫均被完全洗脫下來。所以，選用的洗脫劑為20 mL正己烷+20 mL乙酸乙酯+30 mL乙腈。

3方法評價(jià)

3.1線性關(guān)系及檢出限

按1.2.1方法繪制孔雀石綠和結(jié)晶紫的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2　線性方程、相關(guān)系數(shù)Table 2Linear equation and Correlation coefficientthe limit of detection

由測定結(jié)果可知，孔雀石綠和結(jié)晶紫在0.30μg/mL～30 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 7）。

3.2方法回收率和精密度

按照1.2.3方法處理樣品，計(jì)算樣品加標(biāo)回收率，標(biāo)樣的添加量及結(jié)果如表3。

表3　回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3Recovery and relative standard deviation

5次平行測定孔雀石綠和結(jié)晶紫的平均加標(biāo)回收率分別為92.40%和88.17%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5%以內(nèi)。

3.3檢出限

取空白的魚肉樣品，平行10份，按1.2.3樣品前處理的方法處理，不加標(biāo)準(zhǔn)溶液。測得基線噪音值N，以基線噪音值的3倍（S/N=3）為檢出限（LOD）?？兹甘G和結(jié)晶紫的檢出限分別為0.18 ng/g（魚肉）和1.1 ng/g。結(jié)果表明，本方法在準(zhǔn)確度、精密度上均達(dá)到了殘留分析的要求。

4結(jié)論

本文將基質(zhì)固相分散萃取運(yùn)用到對孔雀石綠和結(jié)晶紫的前處理當(dāng)中，通過優(yōu)化基質(zhì)固相分散萃取的條件和色譜分離條件，建立了水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫的分析方法。結(jié)果表明，此方法在0.30 μg/mL～30.00 μg/mL的線性范圍內(nèi)，具有很好的線性關(guān)系，水產(chǎn)品中對孔雀石綠和結(jié)晶紫的檢出限分別為0.18 ng/g和1.10 ng/g，樣品加標(biāo)回收率分別為86.28%～98.79%和82.51%～93.71%，其精密度RSD均小于5%（n=5）。該方法集樣品勻化、提取和凈化過程于一體，其操作快速簡單，非常適合于固體、半固體樣品（包括生物組織）中物質(zhì)的痕量分析。

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Determination of Malachite Green and Crystal Violet in Aquatic Products by Matrix Solid-Phase Dispersion with Liquid Chromatography

QIU Xiu-zhen，WANG Shao-ling，TANG Hui-yi
（College of Chemistry and Environmental Engineering，Shaoguan University，Shaoguan 512005，Guangdong，China）

A method for the determination of malachite green and crystal viole in aquatic products based on matrix solid-phase dispersion with liquid chromatography was established.Fish samples mix with C18after grinding，and then the blended material was transferred to a 6 mL SPE column.And then，the column was eluted with hexane，ethyl acetate and acetonitrile in sequential order.The eluent was collected and evaporated to dryness.The concentrated sample solution were filtrated with filter membrane（0.22 μm），and then injected in to the HPLC system.The separation was carried on the inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×150 mm）chromatographic column with ammonium acetate/acetonitrile（80∶20）as mobile phase isocratic elution，and flow rate of 1.00 mL/min and the detection wavelength was 254 nm.The results show that，A good linearity（r＞0.999）was achieved for the target compound over the range of 0.30 μg/mL-30.00 μg/mL.the limit of detection（S/N=3）of Calachite Green and Crystal Violer were 0.18 ng/g and 1.10 ng/g.the recoveries of Malachite Green and Crystal Violet from fish tissue ranged from 86.28%-98.79%and 82.51%-93.71%both with the relative standard deviations（RSD）within 5%.

matrix solid-Phase dispersion（MSPD）；high performance liquid chromatography（HPLC）；malachite green（MG）；crystal violet（CV）

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.032

2014-06-16

廣東省自然科學(xué)基金（No.2014A030307024）；韶關(guān)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012 CX/N25）

丘秀珍（1982—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品分析。