羅建成，李杰，熊鵬

（南陽(yáng)理工學(xué)院生化學(xué)院，河南南陽(yáng)473004）

紫樹(shù)莓葉中黃酮提取條件的優(yōu)化

羅建成，李杰，熊鵬

（南陽(yáng)理工學(xué)院生化學(xué)院，河南南陽(yáng)473004）

采用響應(yīng)面分析優(yōu)化有機(jī)溶劑提取樹(shù)莓葉中總黃酮的工藝。在用有機(jī)溶劑提取工藝中，紫樹(shù)莓葉黃酮提取工藝最佳工藝條件：采用乙醇為溶劑、乙醇濃度為57.8%、提取溫度62.1℃、提取時(shí)間92.7 min、料液比1∶50（g/mL）。對(duì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證得到提取率為12.56%。

紫樹(shù)莓葉；黃酮；條件優(yōu)化；響應(yīng)面分析法

樹(shù)莓屬薔薇科薔薇亞科懸鉤子屬中的一種落葉灌木的成熟果實(shí)，又名托盤(pán)、馬林、覆盆子等［1］，樹(shù)莓的藥用價(jià)值有詳細(xì)記載。樹(shù)莓全株入藥，有補(bǔ)肝腎、縮小便、助陽(yáng)、固精之功效。民間用于治療腹瀉、目赤、酒精中毒等［2］。在樹(shù)莓葉片中起主要作用的是黃酮類(lèi)物質(zhì)。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，樹(shù)莓葉中黃酮含量要遠(yuǎn)高于樹(shù)莓果和籽。徐雅琴等的研究證實(shí)［3］：樹(shù)莓葉中含有豐富的黃酮類(lèi)物質(zhì)，黃酮類(lèi)化合物是植物界分布較廣的一大類(lèi)多酚類(lèi)物質(zhì)，常以游離或糖苷形式存在于植物體內(nèi)，是一類(lèi)具有顯著生理藥理活性和開(kāi)發(fā)前景的植物成分，其中山奈酚（kaempferol）和槲皮素（quercetin）［4-5］具有明顯的抗癌、抗氧化，抗心肌肥厚功能，并能促進(jìn)骨髓中成骨細(xì)胞的形成。樹(shù)莓葉提取物粗黃酮具有一定的抗氧化作用［3］。樹(shù)莓葉提取物粗黃酮對(duì)DPPH·有較好的清除作用，且隨劑量的增加清除作用增強(qiáng)。

由于樹(shù)莓葉黃酮類(lèi)化合物多具有游離的酚羥基，一般情況易溶于堿性溶液和極性較大的有機(jī)溶劑，大多數(shù)以黃酮苷的形式存在，其易溶于水、含水乙醇、甲醇等極性溶劑，少數(shù)以黃酮苷元的形式存在。黃酮類(lèi)化合物性質(zhì)之間差別較大，每種樹(shù)莓葉中所含的雜質(zhì)又不完全相同，因此尚無(wú)一個(gè)通用的提取方法。目前的提取方法主要有以下幾種：有機(jī)溶劑提取、堿性稀醇或堿性水提取、超聲提取、微波提取、超臨界萃取、酶解提取、超濾法等方法［6-13］，再對(duì)粗提物進(jìn)行精制、純化處理。利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化有機(jī)溶劑提取樹(shù)莓葉中的黃酮提取工藝鮮報(bào)道。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料

紫樹(shù)莓葉：河南南陽(yáng)市產(chǎn)。

1.1.2儀器

HHS-6電熱恒溫水浴鍋：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；BS110S電子天平：德國(guó)（北京）賽多利斯天平有限公司；TDL-40B臺(tái)式離心：上海申光儀器儀表有限公司；FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；101A-2電熱鼓風(fēng)干燥箱機(jī)：上海申光儀器儀表有限公司；721 N分光光度計(jì)：上海精密儀器有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器：金壇市杰瑞爾電器游戲公司。

1.1.3試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇、乙醇、正丁醇、正丙醇、硝酸鋁、乙酸乙酯和氫氧化鈉均為分析純且均為天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司。

1.2方法

1.2.1紫樹(shù)莓葉黃酮的提取

黃酮成分粗提時(shí)的工藝流程：清洗→干燥→黃酮粗提物

1.2.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)105℃烘干至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品15 mg，用80%乙醇溶解定容100 mL容量瓶，得到0.15 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液分別于7個(gè)潔凈的25 mL容量瓶中，分別加入6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0 mL的80%乙醇溶液，然后向每個(gè)容量瓶中各加入5% NaNO2溶液1.0 mL充分振蕩后靜置6 min，再向每個(gè)容量瓶中加入10%Al（NO3）3［14］溶液1.0 mL，充分振蕩后靜置6 min，向每個(gè)容量瓶中各加入10%NaOH溶液10.0 mL，然后用80%乙醇定容至25 mL容量瓶刻度處，充分振蕩后靜置15 min，在507 nm處測(cè)吸光度。

1.2.3樣品測(cè)定及提取率的計(jì)算

1.2.3.1樣品測(cè)定方法

提取液離心以后在50 mL的容量瓶定容。精密吸取10 mL溶液，在20 mL的刻度試管中定容。從刻度試管中精密吸取稀釋后的溶液6mL，放入另一備用20mL的刻度試管；然后向每個(gè)刻度試管中各加入5%NaNO2溶液1.0 mL充分振蕩后靜置6 min，再向每個(gè)刻度試管中加入10%Al（NO3）3溶液1.0 mL，充分振蕩后靜置6 min，向每個(gè)刻度試管中各加入10%NaOH溶液10.0 mL，然后用80%乙醇定容至20 mL，充分振蕩后靜置15 min，在507 nm處測(cè)吸光度。

1.2.3.2黃酮提取率的計(jì)算

利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出提取物的重量，其公式可整理成：

x=（0.8y-0.007 8）/0.339 5

式中：y為測(cè)得的吸光度值；x為由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出提取物的重量。

提取率=提取物的重量/紫樹(shù)莓葉的重量×100%

由于本次試驗(yàn)黃酮含量一般，所以在測(cè)量時(shí)提取液稀釋20倍，則黃酮提取率的計(jì)算公式為：η%=x× 20×50×100/6×1 000

1.3不同因素對(duì)紫樹(shù)霉葉中黃酮類(lèi)化合物提取工藝的影響

1.3.1不同提取溶劑對(duì)黃酮提取率的影響

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g紫樹(shù)莓葉粉末，在料液比為1∶50（g/mL），分別采用不同的提取溶劑，甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、水、乙酸乙酯；60℃的水浴，振蕩速度120 r/min條件下提取2 h。提取液離心，取上清液定容至50 mL容量瓶。

1.3.2不同溶劑濃度對(duì)黃酮提取率的影響

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g紫樹(shù)莓葉粉末，在乙醇作為提取溶劑，乙醇濃度分別為：40%、50%、60%、70%、80%、95%。料液比為1∶50（g/mL），60℃水浴，振蕩速度120 r/min條件下提取2 h。提取液離心，取上清液定容至50 mL容量瓶。

1.3.3不同提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g紫樹(shù)莓葉粉末，在60%乙醇為提取溶劑，按料液比1∶50（g/mL），振蕩速度120 r/min，在不同溫度下提取2 h，提取溫度分別為：40、50、60、70、80℃。提取液離心，取上清液定容至50 mL容量瓶。

1.3.4提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g紫樹(shù)莓葉粉末，在60%乙醇為提取溶劑，按料液比1∶50（g/mL），70℃水浴，振蕩速度120 r/min條件下提取，提取時(shí)間分別為：60、90、120、150、180 min。提取液離心，取上清液定容至50 mL容量瓶。

1.3.5提取溶劑的料液比對(duì)黃酮提取率的影響

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g紫樹(shù)莓葉粉末，在60%乙醇作為提取溶劑，60℃水浴，振蕩速度120 r/min條件下提取2 h，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）。提取液離心，取上清液定容至50 mL容量瓶。

1.3.6響應(yīng)面分析

據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［15］，綜合單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，3個(gè)對(duì)黃酮提取率影響顯著的因素，分別以A、B和C為代表，每一個(gè)自變量的試驗(yàn)水平分別以－1、0、1進(jìn)行編碼0代表最高水平、-1為最高水平左面的水平、1為最高水平右面水平。以紫樹(shù)莓葉黃酮提取率為響應(yīng)值（Y），在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)。對(duì)得出的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

2結(jié)果與分析

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)數(shù)據(jù)得到蘆丁含量和吸光度值之間標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)溶液在507 nm處標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Rutin standard standard solution at 507 nm standard curve

通過(guò)一元線性回歸方程為：y=0.339 5x+0.007 8。式中：y為507 nm處的吸光度值；x為黃酮的含量，mg；經(jīng)過(guò)計(jì)算，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.997 5，回歸極顯著。所以在蘆丁含量為0～0.9 mg的范圍內(nèi)，是可以用該方法檢測(cè)黃酮含量的。

2.2最佳溶劑選擇

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g紫樹(shù)莓葉粉末，在料液比為1∶50（g/mL），分別采用不同的提取溶劑，甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、水、乙酸乙酯；60℃的水浴，振蕩速度120 r/min條件下提取2 h。提取液離心，取上清液定容至50 mL容量瓶，稀釋20倍后按1.2.3.1給出的方法測(cè)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)如表1。

表1　不同溶劑的黃酮提取率Table 1Different solvents of flavonoids extraction yield

由表1可知使用不同溶劑，樹(shù)莓葉中黃酮的提取率不同，由上表可知乙醇的提取率最大。

2.3最佳濃度選擇

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g紫樹(shù)莓葉粉末，在乙醇作為提取溶劑，乙醇濃度分別為：40%、50%、60%、70%、80%、95%。料液比為1∶50（g/mL），60℃水浴，振蕩速度120 r/min條件下提取2 h。提取液離心，取上清液定容至50 mL容量瓶，稀釋20倍后按1.2.3.1給出的方法測(cè)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)如表2。

由表2可知隨著乙醇濃度的增加，提取率由大變小，在60%乙醇濃度下提取率達(dá)到最大。

表2　不同濃度的黃酮提取率Table 2Different concentrations of flavonoids extraction yield

2.4最佳溫度選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g紫樹(shù)霉葉粉末，在60%乙醇為提取溶劑，按料液比1∶50（g/mL），振蕩速度120r/min，在不同溫度下提取2 h，提取溫度分別為：40、50、60、70、80℃。提取液離心，取上清液定容至50ml容量瓶，稀釋20倍后按1.2.3.1給出的方法測(cè)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)如表3。

表3　不同溫度的黃酮提取率Table 3The flavonoids extraction rate of different temperature

由表3知在開(kāi)始隨溫度越大提取率越高，之后反而下降，分析有可能高溫使黃酮受到了破壞。因此實(shí)驗(yàn)選取60℃為合適溫度條件。

2.5最佳時(shí)間選擇

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g紫樹(shù)莓葉粉末，在60%乙醇為提取溶劑，按料液比1∶50（g/mL），70℃水浴，振蕩速度120 r/min條件下提取，提取時(shí)間分別為：10、20、30、40、50 min。提取液離心，取上清液定容至50 mL容量瓶，稀釋20倍后按1.2.3.1給的方法測(cè)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)如表4。

表4　不同提取時(shí)間的黃酮提取率Table 4Different extracting flavonoids extraction yield of time

由表4知最開(kāi)始提取時(shí)間長(zhǎng)提取率越高，但在120 min之后反而越小，分析有可能是樹(shù)莓葉中黃酮比較容易提取，時(shí)間越長(zhǎng)提取出來(lái)的其他物質(zhì)較多，和黃酮結(jié)合成了其他物質(zhì)，還有就是黃酮被氧化，因此實(shí)驗(yàn)選取提取時(shí)間為120 min。

2.6最佳料液比選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取1.0 g紫樹(shù)莓葉粉末，在60%乙醇作為提取溶劑，60℃水浴，振蕩速度120 r/min條件下提取2 h，料液比分別為：1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）。提取液離心，取上清液定容至50ml容量瓶，稀釋20倍后按1.2.3.1給出的方法測(cè)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)如表5。

表5　不同料液比的黃酮提取率Table 5Different material liquid ratio of flavonoids extraction yield

由表5知料液比與提取率關(guān)系為料液比越大越好，但是在1∶50之后提取率增長(zhǎng)不明顯，考慮成本因素實(shí)驗(yàn)選取1∶50（g/mL）作為實(shí)驗(yàn)的料液比。

2.7響應(yīng)面分析

據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)所得結(jié)果，確定料液比為1∶50（g/mL），選取乙醇濃度、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)對(duì)黃酮提取率影響顯著的因素，以紫樹(shù)莓葉黃酮提取率為響應(yīng)值（Y），在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表6。

表6　響應(yīng)面分析因素與水平Table 6The response surface analysis of factors and levels

對(duì)乙醇濃度A、提取時(shí)間B和提取溫度C作變換如下：A=（Z-60）/10，B=（t－90）/30，C=（T－60）/10（Z、t、T分別為試驗(yàn)乙醇濃度、提取時(shí)間及提取溫度）以A、B、C為自變量，以3次試驗(yàn)所得多糖提取率的平均值為響應(yīng)值（Y），結(jié)果見(jiàn)表7，其中1～12是析因試驗(yàn)，13～15是中心試驗(yàn)，用來(lái)估計(jì)試驗(yàn)誤差。

表7　響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 7The response surface analysis methods and results

由表7的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果，用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，可建立二次響應(yīng)面的回歸分析模型，提取率的估計(jì)回歸系數(shù)如表8，整理后的二次回歸方程如下：Y=11.880 3-0.451 5A-0.1422 5B+0.181 5C+0.167A×B-0.324A×C-0.294 5B× C-0.800 667A2-0.555 167B2-0.692 167C2，R值為0.964 8＞0.9方法可靠。

表8　提取率的估計(jì)回歸系數(shù)Table 8Extraction yield estimates of regression coefficient

表9　提取率的方差分析Table 9The extraction yield of analysis of variance

由回歸方程的方差分析表8、9可知，模型一次項(xiàng)A顯著，二次項(xiàng)A2極顯著，B2、C2顯著，交互項(xiàng)都不顯著。說(shuō)明3個(gè)因素之間的交互作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響不顯著。回歸方程的F值為19.84，大于F值的概率（Pr＞F）為0.048，顯示該方程的回歸顯著。

由圖2至圖4可知，提取溶劑濃度、提取時(shí)間和溫度對(duì)樹(shù)莓葉中的黃酮提取的效應(yīng)，有一個(gè)極值點(diǎn)，兩個(gè)不同因素間的交互作用黃銅的提取影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。所建立的模型在進(jìn)行的試驗(yàn)范圍之內(nèi)有一穩(wěn)定點(diǎn)，穩(wěn)定點(diǎn)即是極大值所在的點(diǎn)。

為求出基礎(chǔ)黃酮提取的優(yōu)化條件和優(yōu)化條件所對(duì)應(yīng)的黃酮提取率的最大理論值，對(duì)所建立的回歸方程中的變量A、B、C分別求其一階偏導(dǎo)，并令其等于零，可得三元一次方程組，對(duì)此方程組進(jìn)行求解，可得A=－0.214 345 66，B=0.091 685 11，C=0.206 138 93，代入前述的變換公式得到乙醇濃度57.8%、提取時(shí)間為92.7 min、提取溫度62.1℃。計(jì)算理論優(yōu)化提取率為12.48%，按照上述條件即紫樹(shù)莓葉黃酮提取工藝最佳工藝條件為采用乙醇為溶劑、乙醇濃度為57.8%、提取溫度62.1℃、提取時(shí)間92.7 min、料液比1∶50（g/mL）實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證得到提取率為12.56%，實(shí)測(cè)平均值與預(yù)測(cè)值擬合較好，因此，模型能很好地預(yù)測(cè)真實(shí)的提取情況。

圖2　乙醇濃度（A）與提取時(shí)間（B）的響應(yīng)面圖Fig.2Extraction yield and ethanol concentration，extraction of the surface figure of the time

圖3　乙醇濃度（A）與提取溫度（C）的響應(yīng)面圖Fig.3Extraction yield and ethanol concentration，extraction temperature of the surface figure

圖4　提取時(shí)間（B）與提取溫度（C）的響應(yīng)面圖Fig.4Extraction yield and extraction time，extraction temperature of the surface figure

3結(jié)論

在用有機(jī)溶劑提取工藝中，紫樹(shù)莓葉黃酮提取工藝最佳工藝條件為采用乙醇為溶劑、乙醇濃度為57.8%、提取溫度62.1℃、提取時(shí)間92.7 min、料液比1∶50（g/mL）。對(duì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證得到提取率為12.56%。

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Optimization of Extraction Conditions of Purple Raspberry Leaf Flavonoids

LUO Jian-cheng，LI Jie，XIONG Peng

（College of Biological and Chemical Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，Henan，China）

Organic solvent extraction of raspberry was optimized by using response surface analysis technology of total flavonoids in the leaves.In organic solvent extraction process，purple raspberry leaf flavonoids extraction process optimum technological conditions for using ethanol as solvent，57.8%ethanol concentration，extraction temperature 62.1℃，the extracting time 92.7 min，material liquid than 1∶50（g/mL）.The experimental optimization conditions were verified，the extraction yield could reach 12.56%under these conditions.

purple raspberry leaf；flavonoid；conditions optimization；response surface analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.15.010

2015-02-06

羅建成（1965—），男（漢），副教授，碩士，研究方向：生物技術(shù)。