曹聯(lián)飛　胡福良

（1浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州310021；2浙江大學動物科學學院，杭州310058）

浙江漿蜂及相近蜂種中W316片段的分布頻率研究

曹聯(lián)飛1胡福良2

（1浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州310021；2浙江大學動物科學學院，杭州310058）

為進一步闡明W316片段與王漿高產(chǎn)性狀的相關(guān)性，本研究檢測了浙江漿蜂、意蜂品系和卡尼鄂拉蜂中W316片段的分布頻率。結(jié)果顯示：W316片段在浙江漿蜂中的分布頻率為77.8%，在意蜂品系中為52%，在卡尼鄂拉蜂中為45%，浙江漿蜂中W316片段的分布頻率顯著高于意蜂品系和卡尼鄂拉蜂，而意蜂品系與卡尼鄂拉蜂間差異不顯著。

浙江漿蜂；W316；分布頻率；RAPD

浙江漿蜂是20世紀60年代開始，浙江省杭嘉湖地區(qū)蜂農(nóng)對飼養(yǎng)的意大利蜂長期定向選擇，形成的具有王漿高產(chǎn)突出特征的蜜蜂遺傳資源［1］。浙江漿蜂已被列入國家畜禽遺傳資源目錄。浙江漿蜂形成后，其王漿高產(chǎn)機理及相關(guān)的分子標記一直是業(yè)界研究的熱點，學者們從形態(tài)學、細胞學、生化水平及分子水平等進行了相關(guān)研究。其中，王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)的DNA標記-W316片段的研究引起了較大關(guān)注［2］。然而同時，有人也對相關(guān)研究結(jié)果提出了質(zhì)疑，認為實驗的樣本太少，用作對照的王漿低產(chǎn)蜂種的代表性也不夠強［3］。

鑒于此，我們在浙江省杭嘉湖地區(qū)的平湖、蕭山、長興等地全面采集浙江漿蜂樣品，同時從吉林省養(yǎng)蜂研究所建立的“國家級蜜蜂種質(zhì)資源保護場”采集原意、美意、澳意、本意等意蜂品系樣品及卡尼鄂拉蜂樣品，借鑒前人關(guān)于W316片段的研究方法，檢測和分析W316片段在浙江漿蜂及相近蜂種中的分布頻率，以期進一步闡明W316片段與王漿高產(chǎn)性狀的相關(guān)性，從而為王漿高產(chǎn)蜂種的選育提供參考。

1　材料與方法

1.1實驗材料

浙江漿蜂：浙江省平湖市15家蜂場共30群；浙江省蕭山區(qū)6家蜂場共30群；浙江省長興縣5家蜂場共30群。

“國家級蜜蜂種質(zhì)資源保護場”的原意蜜蜂10群、本意蜜蜂5群、澳意蜜蜂5群、美意蜜蜂5群，以及卡尼鄂拉蜂20群。

1.2實驗方法

1.2.1DNA提取

取酒精浸泡保存的蜜蜂樣品，每群隨機取一只工蜂，剪取蜜蜂胸部肌肉，按照細胞/組織基因組DNA提取試劑盒的說明和步驟提取總DNA。

1.2.2RAPD-PCR擴增

參考前人文獻［2］，使用隨機引物W（引物序列：5’-CGGCCCCGGT-3’）進行RAPD-PCR擴增反應。反應體系20μl,其中10×buffer 2 μl，25mmol/L MgCl21.2 μl，2.5mmol/L dNTP 1.6μl，10nmol/L引物0.4μl，DNA模板2 μl，Taq酶（5U/μl）0.5 μl。擴增反應程序：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，36℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min,4℃保存。

1.2.3PCR產(chǎn)物電泳檢測

擴增產(chǎn)物使用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，之后固定、銀染、顯色,白光燈下拍照保存。Quantity One軟件估測電泳圖片中的片段大小，確定W316片段的電泳位置。統(tǒng)計W316片段在各個蜜蜂群體中的分布頻率。

2　結(jié)果與分析

2.1RAPD-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

部分樣品的電泳圖譜見圖1。紅色箭頭所指位置即為W316片段的電泳位置。

圖1　RAPD-PCR擴增結(jié)果（1-10道：平湖地區(qū)浙江漿蜂；11-20道：原意；21道：DNA Marker；22-26道：本意；27-36道：卡蜂）

2.2W316片段分布頻率統(tǒng)計

浙江漿蜂樣品中，平湖地區(qū)樣品W316片段的分布頻率為80%，蕭山地區(qū)樣品的分布頻率為83.3%，長興地區(qū)樣品的分布頻率為70%。浙江漿蜂總體的分布頻率為77.8%。意蜂品系樣品中W316片段的分布頻率為52%?？岫趵錁悠分蠾316片段的分布頻率為45%。即W316片段的分布頻率在浙江漿蜂中高于意蜂品系，意蜂品系高于卡尼鄂拉蜂。進一步統(tǒng)計分析顯示浙江漿蜂與意蜂品系間、浙江漿蜂與卡尼鄂拉蜂間W316片段的分布頻率差異顯著，而意蜂品系與卡尼鄂拉蜂間差異不顯著。

3　討論

RAPD技術(shù)是20世紀90年代發(fā)展起來的一種DNA多態(tài)檢測技術(shù)，由于其簡便、經(jīng)濟、快捷，且無需事先了解物種的相關(guān)分子生物學信息，迅速廣泛應用于系統(tǒng)發(fā)育研究、動植物物種鑒定、群體遺傳分析、基因圖譜構(gòu)建、以及疾病診斷等諸多領(lǐng)域［4］。張雅娟等人［2］首次應用RAPD技術(shù)進行王漿高產(chǎn)性狀分析，為浙江漿蜂的王漿高產(chǎn)機理研究及標記輔助選擇育種提供了新的思路。本研究借鑒張雅娟等人的實驗方法，擴大浙江漿蜂的樣品數(shù)和采樣范圍，加入與浙江漿蜂親緣關(guān)系較近的意蜂品系作為對照，同時采用分辨率更高的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，從而進一步分析W316片段與王漿高產(chǎn)性狀的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示浙江漿蜂中W316片段的分布頻率顯著高于意蜂品系和卡尼鄂拉蜂。

值得注意的是，張雅娟等［2］的研究結(jié)果顯示W(wǎng)316片段在王漿高產(chǎn)蜂種中存在，而在王漿低產(chǎn)蜂種卡尼鄂拉蜂中不存在。我們的研究結(jié)果顯示W(wǎng)316片段在浙江漿蜂、卡尼鄂拉蜂和意蜂品系中都存在，只是分布頻率有差異。分析原因可能與張雅娟等人實驗中樣品量太少造成的誤差有關(guān)。金水華等人［5］2003年的研究結(jié)果顯示，平湖市7家蜂場的30群浙江漿蜂樣品中有28個樣品存在W316片段，也說明W316片段在蜜蜂群體中存在分布頻率的差異。

浙江漿蜂中W316片段的分布頻率顯著高于意蜂品系和卡尼鄂拉蜂。眾所周知，浙江漿蜂的王漿產(chǎn)量也顯著高于意蜂品系和卡尼鄂拉蜂。是否說明W316片段與王漿高產(chǎn)性狀相關(guān)呢？還需要進一步研究和證實。首先，RAPD技術(shù)是使用隨機引物進行擴增的，其擴增產(chǎn)物反映的主要是DNA的多態(tài)性，而擴增產(chǎn)物中各個DNA條帶的本質(zhì)和功能還是未知的，因此W316片段與王漿高產(chǎn)性狀的相關(guān)性還需要確切的功能驗證。其次，由于W316片段在蜜蜂群體中存在分布頻率的差異，因此實驗樣品的數(shù)量和樣品的代表性至關(guān)重要。本研究雖然比較全面的采集了浙江漿蜂樣品，同時盡可能采集了意蜂品系等對照組樣品，但是由于條件限制，樣品數(shù)量尤其是對照組樣品還偏少，樣品的代表性還不夠強。近年來，新一代生物技術(shù)突飛猛進，新技術(shù)在浙江漿蜂王漿高產(chǎn)性狀的研究中必將發(fā)揮越來越大的致謝:感謝吉林省養(yǎng)蜂研究所牛慶生研究員、浙江省平湖市種蜂場金水華高級畜牧師、浙江省蕭山區(qū)種蜂場楊國泉場長、浙江省長興縣種蜂場邱汝民場長等在樣品采集過程中給予的大力協(xié)助！

作用。

［1］國家畜禽遺傳資源委員會.中國畜禽遺傳資源志-蜜蜂志［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2011.

［2］張雅娟，蔣瀅，王尉平，等.高產(chǎn)王漿西蜂的DNA特異標記-W316bp片段的研究［J］.中國養(yǎng)蜂.2001，52（3）: 7-9.

［3］李志勇.W316bp段為高產(chǎn)王漿標記質(zhì)疑［J］.中國養(yǎng)蜂.2004，55（6）:17.

［4］張丕燕，謝莊，劉紅林，等.RAPD技術(shù)及其在動物遺傳育種中的應用［J］.生物工程進展.2000，20（4）:52～54，+51.

［5］金水華，潘永根，李新鑫，等.使用DNA特異基因標記-W316bp鑒定平湖王漿高產(chǎn)意蜂的研究再報［J］.中國養(yǎng)蜂.2004，55（2）:4～5.

The distribution frequency of W316 in Zhejiang royal jelly bee and related bee breeds

Cao Lianfei1Hu Fuliang2
（1 Institute of Animal Science and Veterinary Medicine,Zhejiang Academy of Agricultural Science,Hangzhou 310021,China；2 College of Animal Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

To clarify the relationship between W316 fragment and high royal jelly producing trait,we determined the distribution frequencies of W316 in Zhejiang royal jelly bee,Italian bee and Carniolan bee.The results showed that the distribution frequency of W316 in Zhejiang royal jelly bee was 77.8%,while it was 52%and 45%in Italian bee and Carniolan bee.The results indicated that Zhejiang royal jelly bee had higher distribution frequency of W316 than Italian bee and Carniolan bee significantly.However,the difference was not significant between Italian bee and Carniolan bee.

Zhejiang royal jelly bee；W316；distribution frequency；RAPD

浙江省農(nóng)業(yè)（畜禽）新品種選育重大科技專項項目（2012C12906-19）、浙江省農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新能力提升工程項目資助

曹聯(lián)飛（1981-），男，博士，主要從事蜜蜂生物學和遺傳育種研究，E-mail：caolianfei1981@163.com.

胡福良，教授，博導，主要從事蜜蜂科學研究，E-mail:flhu@zju.edu.cn.