陳仕勝 喻蘇婷 周鵬飛 金宛宛 馬新華 張小婷 高 宇

特應性皮炎患兒外周血CD4+T細胞miR-155的表達與疾病嚴重程度的相關性

陳仕勝 喻蘇婷 周鵬飛 金宛宛 馬新華 張小婷 高 宇

目的： 確定特應性皮炎（AD）患兒外周血CD4+T細胞中miR-155的表達與疾病嚴重程度的相關性。方法： 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（Real-time-PCR）檢測45例AD患兒和38例健康者對照外周血CD4+T細胞中miR-155的表達，ELISA法檢測血清IL-5和IFN-γ表達，并進行SCORAD評分。結果： AD組miR-155的表達較對照組明顯升高（P＜0.05）；AD患者組miR-155的表達與SCORAD評分、血清IL-5表達水平呈正相關（均P＜0.05），與血清IFN-γ表達水平呈負相關（P＜0.05）。結論： AD患兒外周血CD4+T細胞中miR-155表達與疾病嚴重程度正相關，可作為評定AD嚴重程度的一個指標。

兒童； 特應性皮炎； miR-155

特應性皮炎是一種慢性炎癥性皮膚病，目前認為其發(fā)病機制是遺傳因素背景下由過敏原誘發(fā)的IgE介導的皮膚速發(fā)型和遲發(fā)型變態(tài)反應。Th1/Th2失衡在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。1microRNA（miRNA）參與許多炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展。2，3近年來發(fā)現(xiàn)miRNA在銀屑病和AD皮損中異常表達，其中miRNA-155在AD中呈特異性高表達，說明miRNA-155可能參與AD的免疫反應調控。4然而AD患者PBMCs中是否存在miRNA-155的高表達，及其與AD嚴重程度的關系，目前還不清楚。本研究通過檢測特應性皮炎患兒外周血CD4+T細胞中miR-155的表達，并與特應性皮炎患兒SCORAD評分、血清IL-5和IFN-γ表達水平進行相關性分析，初步探討miR-155在AD發(fā)生發(fā)展中的作用。

1　對象與方法

1.1對象 45例AD患兒，符合Hanifin&Rajka AD診斷標準，符合以下納入標準：病程1年以上，每年緩解期＜3個月者；未發(fā)現(xiàn)其他皮膚病和內臟疾病史；停用抗組胺藥1周以上；停用系統(tǒng)及局部糖皮質激素及免疫抑制劑1個月以上。對照組38例，均來自我院健康體檢中心，無自身免疫性皮膚病或內臟病史，否認家族過敏史。所有受試兒童法定監(jiān)護人簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會審批通過。

1.2主要試劑與儀器 淋巴細胞分離液（美國Sigma公司），miRNA提取試劑盒（美國Sigma公司），RTPCR試劑盒（美國Promega公司），miR-155引物（美國Invitrogen公司），IL-5 ELISA kit、IFN-γELISA kit（美國R&D systems公司）MACS分選儀（德國Miltenyi Biotec公司），F(xiàn)CX96實時熒光定量PCR檢測儀（Bio-Rad公司），流式細胞分析儀（COULTER Epics XL·MCL，美國）；低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.3研究方法

1.3.1所有患兒由經過SCORAD課程專門培訓的一名指定醫(yī)生評價。參照文獻5將AD患兒按照SCORAD評分＜15分為輕度，15～40分為中度，＞40分為重度3組。

1.3.2標本收集及外周血CD4+T細胞的分離 采集病例組和健康對照組外周血10mL，分成兩管，每管5 mL，EDTA-K2抗凝，于-20℃存放備用。取其中一管用淋巴細胞分離液分離外周單個核細胞，免疫磁珠分選CD4+T細胞。流式細胞儀最后檢測CD4+T細胞純度。

1.3.3總RNA提取與cDNA合成 采用RNA提取試劑盒從上述CD4+T細胞中提取總RNA，聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定RNA的完整性，紫外分光光度儀測定吸光度（A260/280）值。取RNA1μg，逆轉錄酶1 μL，PolyA聚合酶1μL，5xRT緩沖液4μL，加無RNA酶水補足體積至25μL，于PCR儀42℃ 1h，90℃ 10min。將合成的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4Real-timePCR 引物（miR-155，內參U6）由美國Invitrogen公司合成。PCR反應體系（總體積20 μL）：SYBRGreenmix10μL，特異性引物2μL，通用引物2μL，cDNA2μL，ddH2O4μL。反應條件95℃預變性10min；95℃ 10s，60℃ 1min，共40個循環(huán)。每個標本均做3個復孔，反應結束后作溶解曲線分析。RT-PCR檢測結果采用2-ΔCt法分析，選擇U6基因表達量值作為內參照。將同一樣本目的基因的Ct值分別減去其相應的U6的Ct值，獲得ΔCt值，最后計算目的基因相對表達量2-ΔCt。

1.3.5取上述外周血另一管標本，使用IL-5、IFN-γ ELISAkit，按照說明書進行操作，讀取血清樣本的吸光度值（A），通過標準曲線計算樣本濃度值。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件包進行統(tǒng)計分析，miR-155相對表達量用ˉx±s表示。獨立樣本比較采用單因素方差分析；相關性分析，雙變量正態(tài)分布資料計算Pearson相關系數(shù)，不符合雙變量正態(tài)分布資料，計算Spearman相關系數(shù)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1AD患者與健康對照組的相關數(shù)據(jù)情況 45例AD患兒，其中男23例，女22例，年齡6.3～12.0歲，平均8.8±3.2歲。根據(jù)SCORAD評分，將其分為輕、中、重度3組（＜15分為輕度，15～40分為中度，＞40分為重度）。對照組38例，其中男21例，女17例，年齡6.0～12.0歲，平均9.0±1.8歲，對照組和AD患兒組性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義。AD組血清IL-5的量高于對照組，而IFN-γ的表達低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。AD患者組miR-155在CD4+T細胞中的表達均高于健康對照組（P＜0.05），且AD患者中、重度組miR-155的表達水平均高于輕度組（P＜0.05）；中度組與高度組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2AD患兒CD4+T細胞miR-155的表達水平與血清IL-5、IFN-γ表達水平、皮炎嚴重程度SCORAD評分相關性分析 AD組患者體內CD4+T細胞miR-155的表達水平與皮炎嚴重程度SCORAD評分呈正相關（r=0.529，P＜0.05），與血清IL-5的表達水平呈正相關（r=0.459，P＜0.05），與血清中IFN-γ表達水平呈負相關（r=-0.310，P＜0.05），見圖1。

表1　對照組和AD輕、中、重度組miR-155、IL-5、IFN-γ的表達

圖1　AD患者CD4+T細胞miR-155的表達與SCORAD、血清IL-5、IFN-γ表達相關性分析

3　討論

近年來研究顯示在異常免疫反應中miR-155高表達。在一些自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、類風濕性關節(jié)炎（RA）、多發(fā)性硬化（MS）中miR-155表達異常，一些過敏性疾病如過敏性哮喘患者中也能發(fā)現(xiàn) miR-155的表達異常。6自 2007年Sonkoly等發(fā)現(xiàn)miRNA在銀屑病、AD皮損中異常表達以來，miRNA在皮膚病方面的研究越來越多。4研究發(fā)現(xiàn)miRNA-155在AD皮損浸潤的淋巴細胞中呈特異性高表達，主要是CD4+T細胞高表達。伴隨著T細胞分化、活化miRNA-155的表達顯著升高。上調表達的miRNA-155通過結合細胞毒T細胞相關抗原4（cytotoxicTlymphocyte-associatedantigen-4，CTLA-4）的3'非編碼區(qū)（3'-UTR）而抑制CTLA-4，從而發(fā)揮調節(jié)T細胞功能。7

本課題組通過檢測45例6歲以上AD患兒外周血CD4+T細胞miR-155的表達變化，發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，不同嚴重程度的AD患者外周血CD4+T細胞miR-155的表達有不同程度的升高，與Sonkoly等7的發(fā)現(xiàn)一致。同時我們還發(fā)現(xiàn)miR-155的表達水平與皮損嚴重程度評分（SCORAD）呈正相關。Th細胞亞群的失衡在AD的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用，目前認為Th2介導的遲發(fā)型超敏反應是AD的主要發(fā)病機制。關于miR-155在Th分化中的研究是近幾年的熱點之一，8我們分別檢測AD患兒Th1、Th2的標志性細胞因子IFN-γ和IL-5，發(fā)現(xiàn)AD患者以Th2細胞占優(yōu)勢，這與傳統(tǒng)觀點一致。既往體外研究顯示miR-155以IFN-γ受體為靶點抑制IFN-γ反應，從而使CD4+細胞向Th1分化。9我們進一步將miR-155的表達與IL-5、IFN-γ進行相關性分析發(fā)現(xiàn)，miR-155的表達與IL-5的量呈正相關，而與IFN-γ呈負相關。我們推測AD患者體內Th1/Th2的狀態(tài)存在動態(tài)變化。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)特應性皮炎患兒外周血CD4+T細胞miR-155的表達升高，且隨皮損嚴重程度加重，表達量增高。miR-155可以作為評定AD嚴重程度的一個指標。

1CarmiLI，HomeyB，SoumelisV.Amodularviewofcytokine networksinatopicdermatitis.ClinRevAllergyImmunol，2011，41（3）：245-253.

2HaTY.TheroleofmicroRNAsinregulatoryTcellsandtheimmuneresponse.ImmuneNetwork，2011，11：11-41.

3文韻詩，秦海紅，徐金華.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者CD4+T細胞中miR-17和miR-20a的表達及與病情活動的相關性研究.中華皮膚科雜志，2014，47（3）：172-175.

4SonkolyE，WeiT，JamonPC，etal.MicroRNAs：Novelregulatorsinvolvedinthepathogenesisofpsoriasis？PLoSOne，2007，2（7）：e610.

5KunzB，OranjeAP，LabrèzeL，etal.Clinicalvalidationand guidelinesfortheSCORADindex：consensusreportoftheeuropeantaskforceonatopicdermatitis.Dermatology，1997，195（1）：10-19.

6VigoritoE，KohlhaasS，LuD，etal.MiR-155：anancientregulatoroftheimmunesystem.ImmunolRev，2013，253（1）：146-157.

7SonkolyE，JansonP，MajuriML，etal.MiR-155isoverexpressedinpatientswithatopicdermatitisandmodulatesT-cell proliferativeresponsesbytargetingcytotoxicTlymphocyte-associatedantigen4.JAllergyClinImmunol，2010，126（3）：581-589.

8JiaS，ZhaiH，ZhaoM.MicroRNAsregulateimmunesystemvia multipletargets.DiscovMed，2014，18（100）：237-247.

9ArnobB，F(xiàn)elixS，CaitlinS，etal.Micro-RNA-155inhibits IFN-γsignalinginCD4+Tcells.EurJImmunol，2010，40（1）：225-231.

（收稿：2015-04-29 修回：2015-07-22）

Correlation ofm iR-155 in peripheralblood CD4+T cells from children with atopic dermatitiswith disease severity

CHEN Shi-sheng，YU Su-ting，ZHOU Peng-fei，et al.Department ofDermatology，Second Affiliated Hospital，Wenzhou Medical University，Zhejiang，Wenzhou，325000

Objective：To determ ine the correlation ofmiR-155 in the peripheral blood CD4+T cells from children with atopic dermatitis（AD）with disease severity.M ethods：The expression levels ofmiR-155 of 45 children with AD and 38 healthy controlswere detected by Real time-PCR.The levels of serum IL-5 and IFN -γwere tested by ELISA.SCORAD of the patientswere assessed.Resu lts：The expression level ofmiR-155 of children with AD was higher than that in healthy controls（P＜0.05）.The expression level ofmiR-155 was positively correlated with the SCORAD and serum IL-5 level（P＜0.05）and negatively correlated with serum IFN-γ（P＜0.05）.Conclusion：miR-155 is positively correlated with the disease severity in children with AD，which can be used for amarker of disease severity in AD.

children；atopic dermatitis；miR-155

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，浙江溫州，325000