張彩晴王倩云鄭 龍程曉峰馮 捷鄒曉榮?

阿維A對(duì)P物質(zhì)誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞一氧化氮合成及細(xì)胞增殖的影響

張彩晴1王倩云1鄭 龍1程曉峰1馮 捷2鄒曉榮1?

目的： 確定阿維A對(duì)P物質(zhì)（SP）誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞NO合成和細(xì)胞增殖的影響。方法：細(xì)胞分為5組：空白組、SP組（10-5mol/L P物質(zhì)）、小劑量組（10-8mol/L阿維A+10-5mol/L P物質(zhì)）、中劑量組（10-7mol/L阿維A+10-5mol/LP物質(zhì)）、大劑量組（10-6mol/L阿維A+10-5mol/LP物質(zhì)）。應(yīng)用硝酸還原酶法檢測(cè)作用時(shí)間為30 m in時(shí)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量，MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖率。結(jié)果： 與對(duì)照組相比，小劑量組NO含量上升（P＜0.05），中劑量組無(wú)明顯變化（P＞0.05），而大劑量組明顯降低（P＜0.05）；中小劑量組細(xì)胞增殖率增加，而大劑量組下降（P＜0.05）。結(jié)論： 阿維A對(duì)HaCaT細(xì)胞一氧化氮的合成和增殖可能有雙相調(diào)節(jié)作用。

阿維A； P物質(zhì)； HaCaT細(xì)胞； 一氧化氮； 細(xì)胞增殖

阿維A是第二代維A酸類藥物，臨床應(yīng)用較為廣泛，主要用于治療銀屑病、重度痤瘡、毛發(fā)紅糠疹等角化異常性疾病。而一氧化氮（nitricoxide，NO）是一種廣泛存在于人體內(nèi)的小分子活性物質(zhì)，一氧化氮可參與調(diào)節(jié)血管舒張、突觸傳遞、巨噬細(xì)胞的殺菌活性及免疫反應(yīng)等，是機(jī)體生理和病理生理過(guò)程中的一種重要化學(xué)性介質(zhì)。具有雙重作用的效果，一方面在生理狀態(tài)下對(duì)維持機(jī)體的正常功能具有保護(hù)作用，另一方面NO生成過(guò)多時(shí)又可加重組織的損傷。1NO不僅調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，而且也參與維護(hù)皮膚的自穩(wěn)。2P物質(zhì)是一種神經(jīng)肽類物質(zhì)，參與機(jī)體的生理和病理過(guò)程。而P物質(zhì)和NO及細(xì)胞的增殖異常都會(huì)影響疾病的發(fā)生和發(fā)展，為探討阿維A治療皮膚疾病的作用機(jī)制。本研究初步探討了阿維A在P物質(zhì)作用下對(duì)體外培養(yǎng)的人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞NO合成及細(xì)胞增殖作用的影響。

1　材料與方法

1.1材料 NO測(cè)試試劑盒（南京建成生物工程研究所）；人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞（ATCC）；P物質(zhì)（Alexis）；MTT（Sigma，USA）；高通道多功能微板測(cè)試系統(tǒng)（BMG Lab technologies，Germany）。

1.2方法

1.2.1NO含量的檢測(cè) 將細(xì)胞置于含10%FBSDMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)條件為 37℃、5%CO2，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70%～80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。選擇生長(zhǎng)旺盛、狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)組：小劑量組（10-8mol/L阿維A+10-5mol/L P物質(zhì)），中劑量組（10-7mol/L阿維A+10-5mol/L P物質(zhì)）、大劑量組（10-6mol/L阿維A+10-5mol/L P物質(zhì)），作用30 min后取上清液0.9 mL用硝酸還原酶法檢測(cè)NO含量。NO含量（μmol/L）=（測(cè)定管吸光度值-空白管吸光度值）÷（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值-空白管吸光度值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（100μmol/L）×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.2.2MTT法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 HaCaT細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶/EDTA常規(guī)消化，10%FBS-DMEM中和、離心，用3%FBS-DMEM培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板置37℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)24 h后取出，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的選作實(shí)驗(yàn)用，每孔加入10% DMEM培養(yǎng)液200μL；按上述細(xì)胞分組加液后。將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中。12 h、24 h后每孔中加入15 μL的MTT（5 g/L）。將培養(yǎng)板移入細(xì)胞培養(yǎng)箱，再次培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液后每孔加入150 μL的DMSO，37℃孵箱過(guò)夜，使結(jié)晶物充分溶解。在高通道多功能微板測(cè)試系統(tǒng)中振蕩10 min，空白對(duì)照孔調(diào)零，在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔吸光度值（OD），記錄結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間比較用單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1阿維A對(duì)HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量的影響（圖1）

圖1　各組細(xì)胞NO含量

空白組細(xì)胞培養(yǎng)上清中的NO含量為53.13±5.94 μmol/L；對(duì)照組為83.99±3.13μmo1/L，小劑量組為123.20±6.56μmol/L，中劑量組為85.73±4.66μmol/ L，大劑量組為64.84±3.48μmol/L。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)照組與空白組相比，NO含量明顯上升（P＜0.01）；與對(duì)照組相比，小劑量組 NO含量明顯上升（P＜0.01），中劑量組變化不明顯（P＞0.05）；大劑量組明顯下降（P＜0.01）。

2.2阿維A對(duì)P物質(zhì)作用下HaCaT細(xì)胞增殖率的影響，見(jiàn)表1。

表1　阿維A對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響

3　討論

HaCaT細(xì)胞是正常突變的永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞株，體外傳代超過(guò)140代，具有永生性，不具有成瘤性。因其許多生物學(xué)特性與原代角質(zhì)形成細(xì)胞相同而成為研究人表皮細(xì)胞的有力工具。在生理情況下，SP、NO在體內(nèi)均有表達(dá)；在病理狀態(tài)下二者均與多種疾病相關(guān)。如Farber等3注意到皮膚中某些神經(jīng)肽、尤其是SP在銀屑病發(fā)病過(guò)程中的作用。Ormerod等4研究發(fā)現(xiàn)在銀屑病皮損中NO合成增加，通過(guò)雙盲法對(duì)17例銀屑病患者局部使用NO合成抑制劑LNMMA與對(duì)照組比較研究發(fā)現(xiàn)L-NMMA能明顯抑制銀屑病患者皮損中NO合成，對(duì)治療銀屑病具有一定的療效。目前很多臨床試驗(yàn)顯示，阿維A可明顯改善銀屑病患者的皮損。5，6而我們?cè)谇捌诘难芯恐邪l(fā)現(xiàn)，P物質(zhì)可促進(jìn)一氧化氮的合成并雙相調(diào)節(jié)HaCaT細(xì)胞增殖。7

本實(shí)驗(yàn)采用硝酸還原酶法和MTT分析法研究了不同濃度的阿維A在P物質(zhì)作用下對(duì)HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量和細(xì)胞增殖率的影響，以探討阿維A治療皮膚疾病的作用機(jī)制。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量檢測(cè)結(jié)果表明，未加P物質(zhì)的空白組細(xì)胞合成釋放一定基礎(chǔ)量的NO，對(duì)照組加入10-5mol/的P物質(zhì)后，細(xì)胞上清液中NO含量明顯增加（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，小劑量組細(xì)胞上清液中，NO含量反而明顯上升（P＜0.01），中劑量NO含量變化不明顯，大劑量組NO含量下降，3組細(xì)胞上清液中NO含量均高于空白對(duì)照組。說(shuō)明在小劑量阿維A作用下，阿維A與P物質(zhì)可能有協(xié)同作用，可促進(jìn)NO的合成；中劑量作用下，可能對(duì)抗了一部分因P物質(zhì)導(dǎo)致的NO釋放，因此其含量無(wú)明顯變化；在大劑量情況下，可抑制因P物質(zhì)引起的NO釋放。

MTT結(jié)果顯示，在12 h時(shí)與對(duì)照組相比，中小劑量組細(xì)胞增殖率增加；大劑量組細(xì)胞增殖率下降。作用24 h時(shí)，與空白組相比，對(duì)照組細(xì)胞增殖率下降；與對(duì)照組相比，小劑量組和中劑量組細(xì)胞增殖率增加；而大劑量組細(xì)胞增殖率下降。說(shuō)明在SP刺激作用下，中、小劑量阿維A可促進(jìn)細(xì)胞增殖；大劑量阿維A抑制細(xì)胞增殖。但國(guó)內(nèi)覃璇等8報(bào)道1×10-6mol/L、5×10-6mol/L阿維A均可抑制HaCaT細(xì)胞增殖，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同。分析本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因可能為：一方面，本實(shí)驗(yàn)以SP為刺激物，其濃度、作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的作用不同；另一方面，阿維A與SP之間可能存在相互作用，從而對(duì)細(xì)胞增殖和NO合成造成影響。

1Espey MG，Miranda KM，F(xiàn)eelisch M，etal.Mechanisms of cell death governed by the balance between nitrosative and oxidative stress.Ann N Y Acad Sci，2000，899（2-3）：209-221.

2GiustizieriML，Albanesi C，Scarponi C，et al.Nitric oxide donors suppress chemokine production by keratinocytes in vitro and in vivo.Am JPathol，2002，161：1409-1418.

3 Farber EM，Rein G，Lanigan SW.Stress and psoriasis，psychoneuro-immunologicmechanisms.Int JDermatol，1991，30（1）：8 -12.

4Ormerod AD，Copeland P，Shah SA.Treatmentof psoriasiswith topical NG-monomethyl-L-arginine，an inhibitor of nitric oxide synthesis.Br JDermatol，2000，142（5）：985-990.

5 Carretero G，Rubera M，Blingchon I，et al.Guidelines for the use of acitrine in psoriasis.Actas Dermosifilioger，2013，104（7）：598-616.

6 Dogra S，Yadav S.Acitrin in psoriasis：an evolving sccscenario. Int JDermatol，2014，53（5）：525-538.

7張彩晴，王倩云，鄭龍，等.P物質(zhì)對(duì)HaCaT細(xì)胞一氧化氮合成及細(xì)胞增殖的影響.中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志，2013，29（5）：317.

8覃璇，吳時(shí)，孫樂(lè)棟.阿維A對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響.暨南大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，35（6）：561-563.

（收稿：2015-04-20 修回：2015-06-28）

·病例報(bào)告·

Effects of acitretin on the syn thesis of nitric oxide and the proliferation of HaCaT cells induced by substance P

ZHANGCai-qing，WANGQian-yun，ZHENG Long，etal.Department ofDermatology，323 HospitalofChinese PLA，Xi'an 710054

Objective：To determine the effects of acitretin on the synthesis of nitric oxide（NO）and the proliferation of HaCaT cells induced by substance P（SP）.Methods：The cellswere classified into the blank group，SP group，low dose acitretin combined SP group，moderate dose acitretin combined SP group and larger dose acitretin combined SP group.The level of NO in the supernatant of cell culture medium of HaCaT cells were detected by nitric aciddeoxidize enzymemethod after culture for 30 minites.The proliferation rate of HaCaT cells in all groupswas detected by MTT.Results：Compared with SP group，the level of NO in the low dose acitretin combined SP group was higher and that in the high dose acitretin combined SP group was lower（P＜0.05）.The proliferation of HaCaT cells in the low dose acitretin combined SP group and moderate dose acitretin combined SP group was higher and in in the high dose acitretin combined SP group was lower than that in the SP group（P＜0.05）.Conclusion：Acitretinmay had thebidirectional regulation on the synthesis of NO and the proliferation of HaCaT cells.

acitretin；substance P；HaCaT cells；nitric oxide；proliferation of cells

蘭州軍區(qū)科研計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：CLZ12JB31）

1解放軍323醫(yī)院皮膚科，西安，710054

2西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，西安，710004