于新友 李天芝 莫 玲 王金良( 山東綠都生物科技有限公司 山東濱州 56600 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 山東濱州 56600)

禽呼腸孤病毒(avian reovirus，ARV)可感染雞、鴨及鵝等禽類，感染雞主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎和腱鞘炎，也可引起呼吸道病、腸道病、矮小綜合征和吸收障礙綜合征等[1]。ARV與其他免疫抑制病原的混合感染也普遍存在于雞群中[2]，使雞對其他傳染病的易感性增加，死亡率、淘汰率升高，生長緩慢或停滯，從而導(dǎo)致飼料報酬率降低，種雞產(chǎn)蛋率下降等，番鴨感染后的臨床癥狀表現(xiàn)有軟腳、腹瀉等，病理變化則主要以多器官的局灶性壞死為特征，死亡率高達(dá)98%。雛鵝感染后也可表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎，病理變化主要是肝、脾壞死，因此給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。1954年，F(xiàn)ahey和Craloley首次從慢性呼吸道病雞體內(nèi)分離到ARV。此后，英國、美國和意大利等相繼報道了ARV感染引起的疾病。20世紀(jì)80年代我國也有ARV引起疾病的相關(guān)報道。ARV屬呼腸病毒科、正呼腸病毒屬，基因組為線性雙股RNA，由分節(jié)段的10個基因片段組成，根據(jù)核酸電泳遷移率可分成3組，即3個大基因節(jié)段(L1，L2 和 L3)，3 個中基因節(jié)段 (M1，M2 和 M3)，4 個小基因節(jié)段 (S1，S2，S3 和 S4)，P10基因是S1節(jié)段的一部分，可編碼感染細(xì)胞后細(xì)胞膜融合相關(guān)蛋白。目前，ARV診斷方法主要有病毒分離鑒定[4]、ELISA[5]、熒光抗體檢測[6]、核酸探針[7]、熒光定量RT-PCR[8]和RT-LAMP[9]等，有的操作繁瑣，診斷時間長，結(jié)果重復(fù)性不好；有的難以檢測出微量病毒，不適宜疾病早期診斷；有的對儀器要求太高不適合大規(guī)模推廣應(yīng)用；還有的太敏感容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果。常規(guī)RT-PCR操作煩瑣，時間長，有時影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；一步法RT-PCR檢測方法具有特異、敏感及簡便等諸多優(yōu)點，能在數(shù)小時內(nèi)檢出病原。因此，建立一種快速、簡單及敏感的ARV一步法RT-PCR檢測方法十分必要。

筆者根據(jù)GenBank公布ARV P10基因序列（AF218358），針對具有較高保守性的P10基因設(shè)計1對特異性引物，建立了1種特異、敏感的一步法RT-PCR檢測方法，旨在為禽呼腸孤病毒病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查等提供1種有效的分子生物學(xué)檢測方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株與病料

禽呼腸孤病毒（ARV）、新城疫病毒（NDV）、H9N2亞型禽流感病毒(AIV)、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)和禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(REV)由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動物生物技術(shù)重點開放實驗室保存，臨床檢測病料為2014年1月至2015年2月采自山東省各地雞場臨床診斷為呼腸孤病毒感染的雞附關(guān)節(jié)、關(guān)節(jié)液和脾臟等。

1.2 工具酶及試劑盒

pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶、PCR相關(guān)試劑、DNA Marker、DNA凝膠回收試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品，AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒為愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司產(chǎn)品。

1.3 RT-PCR引物設(shè)計與合成

應(yīng)用Primer Premier 5.0基因分析軟件，參照GenBank中登錄的ARV P10基因序列（AF218358）設(shè)計1對引物，擴(kuò)增ARV P10基因片段大小為209bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。上游引物:5'-ACGGTGCGACTGCTGTAT-3'，下游引物:5'-ACGATGGAAGACACTACG-3'。

1.4 病毒基因組RNA的提取

按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書提取ARV的RNA，并提取其他幾種病毒的核酸。

1.5 ARV P10基因的一步法RT-PCR擴(kuò)增及條件優(yōu)化

以RNA為模板進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μL。各參數(shù)為50℃反轉(zhuǎn)錄30min，95℃預(yù)變性 2min，然后進(jìn)入 95℃ 20s、50℃ 20s、72℃ 20s循環(huán)，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。取5μL產(chǎn)物，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。同時對各擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，包括退火溫度(40～60℃梯度溫度，每2℃為1個梯度)、引物濃度(0.2～1.2μmol/L，每 0.2μmol/L為 1個梯度)等，反應(yīng)體系均為25μL。

1.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及鑒定

首先取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)掃描進(jìn)行初步鑒定。然后用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段與pMD18-T克隆載體于16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株DH5α。挑取單個的轉(zhuǎn)化菌落，加LB溶液培養(yǎng)18h后，用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA用PCR方法進(jìn)行鑒定，將陽性克隆送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序鑒定。將測序結(jié)果與參照的ARV序列相似性比較。

1.7 特異性試驗

分別提取ARV、NDV、AIV、IBV、IBDV、ALV和REV的核酸，用已建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增。

1.8 敏感性試驗

將ARV提取RNA后定量，然后10倍梯度稀釋提取的病毒基因組RNA，使其分別相當(dāng)于含有100ng RNA、10ng RNA、1ng RNA、100pg RNA、10pg RNA 和1pg RNA的含量，分別進(jìn)行一步法RT-PCR檢測，確定其敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗

用建立的一步法RT-PCR檢測方法，對NDV、AIV、IBV、IBDV、ALV、REV及 ARV 4份陽性病料和4份陰性病料，重復(fù)檢測3次，以驗證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.10 臨床樣品的檢測

取疑似送檢病料35份，利用建立的一步法RT-PCR方法進(jìn)行檢測，對擴(kuò)增產(chǎn)物全部進(jìn)行測序鑒定，并利用生物學(xué)軟件BLAST進(jìn)行序列分析。

2 結(jié)果

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及鑒定

2.1.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物在209bp處可見特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期大小相符（圖1）。

圖1 ARV擴(kuò)增結(jié)果

2.1.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的測序鑒定

挑取PCR鑒定正確的陽性菌液送上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結(jié)果表明，插入到T載體的基因片段的核苷酸序列與ARV（登錄號:AF218358）的序列相似性為100%。

2.2 特異性試驗

利用所設(shè)計的引物及所確定的最佳反應(yīng)條件分別對 ARV、NDV、AIV、IBV、IBDV、ALV 和 REV 的核酸進(jìn)行一步法RT-PCR。結(jié)果6個毒株中只有ARV RNA能擴(kuò)增出目的片段，大小為約209bp(預(yù)期為209bp)，而其他毒株均未擴(kuò)增出相應(yīng)的片段（圖2）。說明本研究建立的方法特異性好。

2.3 敏感性試驗

取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在約209bp附近出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符。從結(jié)果可以看出，引物的一步法RT-PCR檢測靈敏度可以達(dá)到10pg RNA（圖3）。

2.4 重復(fù)性試驗

經(jīng)過3次重復(fù)操作，結(jié)果一致，說明建立的方法是穩(wěn)定、可靠的。

圖2 特異性試驗

圖3 敏感性試驗

2.5 臨床樣品的檢測

用建立的ARV一步法RT-PCR檢測方法，共檢測了35份在不同地方采集的雞病料，檢出陽性樣品17份。

3 討論

本試驗根據(jù)GenBank公布的ARV保守P10基因序列（AF218358），利用Primer Premier5.0設(shè)計1對引物，通過一步法RT-PCR擴(kuò)增出目的基因，連接到pMD18-T載體，送樣測序，對測序結(jié)果與模板序列進(jìn)行比對，其相似性為100%，對退火溫度優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)退火溫度值為54℃時，才能獲得較為理想的產(chǎn)物，即使相差2℃也不能獲得理想的試驗結(jié)果。對引物進(jìn)行濃度優(yōu)化，在引物濃度為0.2～1.2μmol/L對PCR擴(kuò)增效率的影響不大，在0.6μmol/L時擴(kuò)增效率相對較高，而在1.2μmol/L時擴(kuò)增效率相對較差。敏感性試驗結(jié)果顯示，引物的檢測靈敏度可以達(dá)到10pgRNA。特異性試驗結(jié)果顯示，本試驗所建立的雙重RT-PCR檢測ARV的方法能夠擴(kuò)增出209bp目的片段，而對常見的禽病病毒如NDV、AIV、IBV、IBDV、ALV和REV均無擴(kuò)增產(chǎn)物，證明本方法具有較好的特異性。用建立的ARV一步法RT-PCR檢測方法，共檢測了35份在不同地方采集的禽病料，檢出陽性樣品17份。

本試驗建立的ARV一步法RT-PCR檢測方法與傳統(tǒng)的ARV兩步法RT-PCR檢測方法相比操作簡單，不需要單獨做反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增一步完成，節(jié)約了檢測時間。通過傳統(tǒng)的ARV兩步法RT-PCR的檢測比對試驗，結(jié)果顯示二者的符合率為100%，但能節(jié)省檢測時間，更快地指導(dǎo)臨床用藥。ARV一步法RT-PCR檢測方法有多種優(yōu)點如敏感性高、特異性強(qiáng)、快速簡便及檢測成本低。該方法方便、實用，更適合基層獸醫(yī)工作者使用。因此本試驗所建立的方法為國內(nèi)禽呼腸孤病毒病的流行病學(xué)調(diào)查等提供一種實用、有效的分子生物學(xué)診斷方法。

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