北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所（101111）劉曦 崔永平

1 引言

雙胍類物質(zhì)是一種對(duì)細(xì)菌和病毒有較強(qiáng)殺滅作用的殺毒劑，其具有廣譜抗菌、低濃度高效能、對(duì)眼睛和皮膚低刺激等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)療和個(gè)人護(hù)理等領(lǐng)域。目前，聚氨丙基雙胍（PAPB）常用于角膜接觸鏡護(hù)理液中，該類護(hù)理液對(duì)角膜接觸鏡的殺菌消毒和抑制致病微生物的作用完全符合GB 19192-2003和YY 0719.3-2009的要求[1][2][3][4][5]。PAPB在角膜接觸鏡護(hù)理液中的含量約為1μg/mL，含量過(guò)低達(dá)不到殺菌效果；過(guò)高則會(huì)在接觸鏡上聚集對(duì)角膜或眼部其它組織產(chǎn)生刺激或傷害[6]。因此，衛(wèi)生部規(guī)定消毒劑中有效成分的準(zhǔn)確測(cè)定是檢查消毒劑質(zhì)量的基本措施之一；YY 0719.2-2009中也強(qiáng)制性要求接觸鏡護(hù)理產(chǎn)品應(yīng)符合制造商標(biāo)示的主要有效成分含量范圍[7][8]。但行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中并未規(guī)定檢驗(yàn)方法，國(guó)內(nèi)外也鮮見(jiàn)相關(guān)方法學(xué)研究報(bào)告。鑒于此，本文利用Sep-Pak固相萃取柱對(duì)樣品中PAPB進(jìn)行富集，去除樣品中基線噪音和雜質(zhì)峰的干擾，采用液相色譜法建立角膜接觸鏡護(hù)理液中PAPB的測(cè)定方法，為此類產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)控制、安全性評(píng)價(jià)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的完善提供依據(jù)。

附表1 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

附表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

附圖1 PAPB標(biāo)準(zhǔn)工作液高效液相色譜圖

附圖2 相似濃度的PAPB標(biāo)準(zhǔn)工作液與樣品檢驗(yàn)液的高效液相色譜圖

2 材料與方法

2.1 試劑與樣品 磷酸（北京化學(xué)試劑廠，優(yōu)級(jí)純），鹽酸（北京化學(xué)試劑廠，優(yōu)級(jí)純），己烷磺酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度：99.0%），氫氧化鈉（北京化學(xué)試劑廠，分析純），四硼酸鈉（北京化學(xué)試劑廠，分析純），硼酸（西隴化工股份有限公司，分析純），三乙胺鹽酸鹽（天津市光復(fù)精細(xì)化工有限公司，純度：99.00%～100.5%），氯化鈉（北京化學(xué)試劑廠，分析純），甲醇（Fisher Scientific，HPLC Grade），PAPB對(duì)照品（批號(hào)：4/30/2014，純度：98.9%），角膜接觸鏡護(hù)理液（批號(hào)：A131008，凈含量：500mL）。

2.2 儀器設(shè)備 高效液相色譜儀（Waters，1525），固相萃取真空裝置（CNW，SBEQ-CR1012），真空泵（Autoscience），固相萃取柱（Waters，Sep-Pak），電子天平（梅特勒-托利多，XP205DR），超純水機(jī)（Millipore，Milli-Q A10），0.45μm尼龍過(guò)濾膜（Memebrane Solution），0.45μm尼龍針式過(guò)濾器（Merck Millipore）。

2.3 色譜條件 S U P E L C O S I L C8（5 c m×4.6 m m，5 μ m）色譜柱；進(jìn)樣量100μL；流速0.5mL/min；流動(dòng)相A[0.2mmol/L己烷磺酸鈉水溶液-甲醇（V/V=1:1），0.45μm過(guò)濾膜過(guò)濾，用磷酸和1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=（3.1±0.05）]和流動(dòng)相B[1mmol/L氯化鈉-7.5mmol/L三乙胺鹽酸鹽混合水溶液-甲醇（V/V=1:9），0.45μm過(guò)濾膜過(guò)濾，用磷酸和1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=（3.1±0.05）]；梯度洗脫[流動(dòng)相B（0～8）min，流動(dòng)相A（8～17）min]；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)235nm；柱溫25℃。

2.4 PAPB標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備 精密稱量0.0257g PAPB對(duì)照品，用0.01mol/L鹽酸溶解并定容至50mL得到51.4μg/mL PAPB標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2.5 樣品檢驗(yàn)液的制備 固相萃取柱先用4mL甲醇活化，再用4mL硼酸鹽緩沖液（0.2mmol/mL硼酸-0.005mmol/mL硼酸鈉-0.2mmol/mL氯化鈉混合水溶液，0.45μm過(guò)濾膜過(guò)濾，用1mol/L鹽酸和1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值7.1～7.4）沖洗；然后用固相萃取真空裝置慢速富集20mL樣品，用4mL高純水淋洗至真空抽干；最后用4mL 0.1mol/L鹽酸洗脫，0.45μm針式過(guò)濾器過(guò)濾得到樣品檢驗(yàn)液。

3 結(jié)果與討論

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性 用0.1mol/L鹽酸將PAPB標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，分析本研究中色譜條件對(duì)PAPB的系統(tǒng)適應(yīng)性，結(jié)果表明理論塔板數(shù)約為4000，PAPB與相鄰共存物的分離度為2.2，拖尾因子為1.03。色譜圖見(jiàn)附圖1。

3.2 樣品的富集 角膜接觸鏡護(hù)理液中PAPB含量約為1μg/mL，在2.3色譜條件下直接進(jìn)樣測(cè)定，PAPB信號(hào)響應(yīng)值（峰高）較低，基線噪音、雜質(zhì)峰或者相鄰共存物等因素的干擾會(huì)降低定量的準(zhǔn)確性，故采用固相萃取對(duì)樣品進(jìn)行2.5中的富集-洗脫，得到樣品檢驗(yàn)液。

另外，本研究中考慮到對(duì)樣品進(jìn)行富集-洗脫后，可能引入的新物質(zhì)、新雜質(zhì)對(duì)PAPB色譜峰保留時(shí)間的影響，造成PAPB標(biāo)準(zhǔn)工作液無(wú)法直接用于外標(biāo)法定量，而也需要進(jìn)行2.5中的富集-洗脫，故按照2.3色譜條件，分別對(duì)相似濃度的PAPB標(biāo)準(zhǔn)工作液與樣品檢驗(yàn)液進(jìn)樣，液相色譜圖顯示并無(wú)明顯差異，見(jiàn)附圖2。結(jié)果表明PAPB標(biāo)準(zhǔn)工作液無(wú)需進(jìn)行富集-洗脫，即可用于外標(biāo)法定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 用0.1mol/L鹽酸逐級(jí)稀釋PAPB標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液得到2.57μg/mL～25.7μg/mL的PAPB標(biāo)準(zhǔn)工作液。將上述標(biāo)準(zhǔn)工作液按照2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得到PAPB含量對(duì)應(yīng)的峰面積，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，含量（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)，線性回歸。結(jié)果表明PAPB在濃度2.57μg/mL～25.7μg/mL范圍內(nèi)與峰面積保持良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=470000x-103000，相關(guān)系數(shù)為r=0.9999。

3.4 靈敏度 將PAPB標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，按照2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)信噪比（S/N）=3時(shí)，本方法檢出限為0.514μg/mL。

3.5 精密度 取一定濃度的PAPB標(biāo)準(zhǔn)工作液，按照2.3色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，得到PAPB峰面積，計(jì)算其變異系數(shù)（RSD）為1.1%（n=5），表明本方法精密度良好。

3.6 加標(biāo)回收率 精密量取已知PAPB含量（1.295μg/mL）的樣品20mL，共6份；分別精密加入PAPB標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（51.4μg/mL）適量，按照2.5制備檢驗(yàn)液，按照2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定檢驗(yàn)液中PAPB含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)附表1。

3.7 樣品含量測(cè)定 按照2.5制備樣品檢驗(yàn)液，按照2.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算樣品中PAPB含量，結(jié)果見(jiàn)附表2。

4 結(jié)論 本研究表明，固相萃取-高效液相色譜法用于角膜接觸鏡護(hù)理液中聚氨丙基雙胍含量的測(cè)定，具有良好的線性范圍、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、易于操作和推廣，能為此類產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)控制和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制修訂提供技術(shù)依據(jù)。