楊　超，車(chē)　有，宋存江*

（南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，分子微生物與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津　30007　1）

生鮮家畜肉類(lèi)與水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)物流過(guò)程中微生物菌相變化的研究進(jìn)展

楊超，車(chē)有，宋存江*

（南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，分子微生物與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071）

生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)物流過(guò)程中的腐敗變質(zhì)主要由微生物引起。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，分子生態(tài)技術(shù)已成為研究生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)物流過(guò)程中微生物菌相變化的主要手段。引起生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)在物流過(guò)程中腐敗變質(zhì)的微生 物也不斷被發(fā)現(xiàn)。本文綜述了生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)物流過(guò)程中常見(jiàn)微生物物種，包括肉食桿菌、乳酸菌、沙門(mén)氏菌屬、假單胞菌屬、明串珠菌屬、熱殺索絲菌、單增李斯特氏菌等細(xì)菌以及酵母菌、霉菌等真菌；介紹了2010年后多用于生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)菌相研究的分子生態(tài)技術(shù)，包括變性梯度凝膠電泳技術(shù)、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，旨在為我國(guó)生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)的菌相研究提供參考。

生鮮家畜肉類(lèi)；水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)；腐敗變質(zhì)；微生物菌相；分子生態(tài)技術(shù)

生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)作為生鮮肉類(lèi)和水產(chǎn)品重要的組成部分，是我國(guó)居民日常消費(fèi)的主要食品之一。我國(guó)是世界生鮮肉類(lèi)和水產(chǎn)類(lèi)第一生產(chǎn)大國(guó)［1］，但由于國(guó)內(nèi)物流保鮮技術(shù)尚不完善，目前我國(guó)生鮮產(chǎn)品在物流過(guò)程中的腐敗率超過(guò)35%，其中肉類(lèi)和魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品腐敗率約占15%［2］，難以滿足國(guó)民對(duì)食品質(zhì)量的要求。為此，提高生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)在物流過(guò)程中的保鮮技術(shù)已迫在眉睫。在物流過(guò)程中，微生物的繁殖是引起生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)腐敗變質(zhì)的根源。因此，開(kāi)展生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)中微生物的菌相研究對(duì)于生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)物流過(guò)程中保鮮技術(shù)的研究具有重要意義。

1983年Blickstad［3］和Dainty［4］等采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的手段，對(duì)冷藏肉類(lèi)中的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)、篩選，在冷藏保鮮豬肉中篩得大量乳酸菌類(lèi)。隨后，Gill［5］、Church［6］和Borch［7-8］等在冷藏保鮮的豬肉中分離得到了肉食桿菌（Carnobacterium）、乳桿菌（Lactobacillus）和熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）， 初步探究了生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)中微生物的物種。然而，采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)會(huì)受到培養(yǎng)條件的限制，并不能展示食物中真正的菌相分布。不同微生物對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的偏好性不同、微生物間的競(jìng)爭(zhēng)抑制、培養(yǎng)溫度以及溶氧條件等諸多因素導(dǎo)致培養(yǎng)基中適宜生長(zhǎng)的微生物數(shù)量增加，而不適宜培養(yǎng)的微生物最終減少直至消亡；同時(shí)，采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)策略，只能對(duì)食物中數(shù)量占優(yōu)勢(shì)的微生物進(jìn)行鑒定，這些問(wèn)題已成為菌相分析的技術(shù)難題。

近年，隨著分子生態(tài)技術(shù)的發(fā)展，微生物的分析手段日益完善。特別是在食品微生物領(lǐng)域，以DNA指紋技術(shù)［9］為基礎(chǔ)所演生的分子生態(tài)技術(shù)被使用之后，生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)中微生物菌相分布研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)步。Zhao Fan等［10］利用高通量測(cè)序技術(shù)監(jiān)測(cè)豬肉腐敗過(guò)程中的菌相變化，發(fā)現(xiàn)了微球菌科（Micrococcaceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）等微生物參與腐敗過(guò)程，并在腐敗末期檢測(cè)到77%的微生物來(lái)自厚壁菌門(mén)（Firmicutes）。這表明利用靈敏度更高的分子生態(tài)技術(shù)不僅可以檢測(cè)到傳統(tǒng)培養(yǎng)法難以發(fā)現(xiàn)的微生物物種，同時(shí)亦可監(jiān)測(cè)微生物的豐度水平，推動(dòng)了該領(lǐng)域的研究發(fā)展。

為了促進(jìn)分子生態(tài)技術(shù)在該領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展，本文綜述了近年利用分子生態(tài)技術(shù)在生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)物流過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的常見(jiàn)微生物物種，并介紹了該領(lǐng)域常用的變性梯度凝膠電泳技術(shù)、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)。此外，隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，一種能夠?qū)ξ⑸锘蚪M測(cè)序并自動(dòng)鑒定菌種的MicroSeq［11］微生物鑒定平臺(tái)應(yīng)運(yùn)而生，使得食品微生物菌相分布的研究更加全面，自動(dòng)化程度也大幅提高。

1　生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)物流過(guò)程中腐敗微生物菌相分布的研究進(jìn)展

1.1生鮮家畜肉類(lèi)物流過(guò)程中微生物的菌相分布

生鮮家畜肉類(lèi)通常在0～4 ℃條件下運(yùn)輸或采用冰點(diǎn)以下的微凍技術(shù)長(zhǎng)期冷藏［12］。在該領(lǐng)域研究初期［6-7，13］，真空冷藏保鮮的肉類(lèi)中以肉食桿菌、乳桿菌、明串珠菌（Leuconostoc spp.）、熱殺索絲菌為肉類(lèi)腐敗的主要菌群。隨著研究技術(shù)水平的提高，更多的微生物在生鮮家畜肉類(lèi)中被發(fā)現(xiàn)，微球菌科、黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、乳桿菌科和肉桿菌科（Carnobacteriaceae）等被鑒定為冷藏保鮮肉類(lèi)中常見(jiàn)微生物［14］。此外，由于屠宰加工環(huán)境及保藏條件的限制，一些常見(jiàn)微生物也經(jīng)常在生鮮家畜肉類(lèi)研究中被報(bào)道。如金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［15］、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）［15］、沙門(mén)氏菌屬（Salmonella spp.）［15-16］、單增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）［15-18］和假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）［14，19］等均為生鮮家畜肉類(lèi)中的常見(jiàn)微生物，是肉制品衛(wèi)生安全的檢測(cè)指標(biāo)。除了細(xì)菌，多種真菌［20-21］和酵母菌類(lèi)［21］微生物也在生鮮家畜肉類(lèi)腐敗過(guò)程中被檢測(cè)到（表1）。

表1　生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)中常見(jiàn)致腐菌屬及菌種Table 1 Common genus and species of microorganism in fresh livestock meat and aquatic fish and shrimp during logistics

物流過(guò)程中肉類(lèi)一旦發(fā)生腐敗，肉類(lèi)中的微生物組成也將發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。Fontana等［13］發(fā)現(xiàn)在真空冷藏保鮮的牛肉中，保藏初期以米酒乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）為主要菌群，隨著保藏時(shí)間的推移，牛肉逐漸腐敗變質(zhì)，米酒乳酸桿菌逐漸消失，取而代之的是彎曲乳酸桿菌（Lactobacillus curvatus）、明串珠菌和熱殺索絲菌。這表明肉類(lèi)腐敗的不同階段，其微生物種類(lèi)和豐度也在發(fā)生著動(dòng)態(tài)變化。隨著肉類(lèi)腐敗過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、pH值等不斷變化，保藏初期占優(yōu)勢(shì)的微生物其生長(zhǎng)遭到抑制，而另一些微生物逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌群，導(dǎo)致了生鮮家畜肉類(lèi)中微生物的演替。因此，針對(duì)物流過(guò)程中肉類(lèi)腐敗的不同階段采取不同的保鮮手段和使用防腐保鮮劑，將有效延長(zhǎng)生鮮家畜肉類(lèi)的貨架期，為肉類(lèi)保鮮技術(shù)和保鮮劑的開(kāi)發(fā)提供參考。

此外，地域和保藏方式的差異也會(huì)影響肉類(lèi)中的菌相分布（表1）。Mihaiu等［16］在來(lái)自羅馬尼亞的豬肉中發(fā)現(xiàn)沙門(mén)氏菌屬為豬肉腐敗末期菌相中主要致腐菌之一，這與前人報(bào)道的假單胞菌或乳酸菌類(lèi)作為主要腐敗菌略有不同。而Coton等［23］發(fā)現(xiàn)在有氧條件下保藏的肉類(lèi)其腐敗末期以熱殺索絲菌、假單胞菌屬和希瓦氏菌（Shewanella spp.）為主，并發(fā)現(xiàn)在厭氧條件下假交替單胞菌（Pseudoalteromonas haloplanktis）也是參與肉類(lèi)腐敗變質(zhì)的主要菌群之一。生鮮家畜肉類(lèi)在物流過(guò)程中其微生物的菌相分布比較復(fù)雜，不同來(lái)源、不同保鮮方式的肉類(lèi)，其菌相分布也各有差異。探究不同保鮮方式的微生物菌相分布，有利于保鮮技術(shù)的應(yīng)用，從而延長(zhǎng)生鮮家畜肉類(lèi)的貨架期。

1.2水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)物流過(guò)程中的微生物菌相分布

新鮮的水產(chǎn)魚(yú)類(lèi)、蝦類(lèi)等因捕撈后通常不會(huì)進(jìn)行清洗，其表面、鰓內(nèi)及消化系統(tǒng)內(nèi)存在大量微生物，不同環(huán)境生長(zhǎng)的魚(yú)類(lèi)其初始微生物菌相分布也大不相同。但經(jīng)過(guò)低溫保藏的水產(chǎn)魚(yú)類(lèi)腐敗后，其微生物菌群主要以假單胞菌屬、嗜冷菌屬（Psychrobacter spp.）、沙雷氏菌屬（Serratia spp.）、微桿菌屬（Exiguobacterium spp.）、葡萄球菌屬（Staphylococcus spp.）為主要菌群（表1）。此外，Noseda等［24］在真空冷藏的鯰魚(yú)中證實(shí)了乳酸菌類(lèi)（lactic acid bacteria）和熱殺索絲菌也是魚(yú)肉腐敗末期的主要菌群之一。而B(niǎo)jornsdottir-Butler等［32］從保藏的黃鰭金槍魚(yú)、藍(lán)魚(yú)和假長(zhǎng)鰭魚(yú)中檢測(cè)到了美人魚(yú)發(fā)光桿菌（Photobacterium damselae）、志賀鄰單胞菌（Plesiomonas shigelloides）、希瓦氏菌和摩氏摩根菌（Morganella morganii）等非常見(jiàn)微生物。

相比生鮮家畜肉類(lèi)，水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)物流過(guò)程中其微生物物種多樣性更為復(fù)雜，對(duì)保鮮工藝要求更加嚴(yán)格，但其菌相變化規(guī)律卻有相似之處。Boziaris等［21］在研究水產(chǎn)變質(zhì)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，隨著食物pH值的降低，食物中革蘭氏陰性菌逐漸減少，而乳酸菌類(lèi)和酵母菌類(lèi)微生物逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌群。這與生鮮家畜肉類(lèi)中的變化趨勢(shì)基本一致。因此，針對(duì)水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)中復(fù)雜菌相的潛在優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行防腐抑制，對(duì)延長(zhǎng)水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)的貨架期有著重要指導(dǎo)意義。

2　生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)類(lèi)微生物引起腐敗變質(zhì)過(guò)程

2.1生鮮家畜肉類(lèi)微生物致腐過(guò)程

在肉類(lèi)腐敗初期，葡萄糖作為肉中微生物生長(zhǎng)繁殖的主要碳源，隨著肉中葡萄糖的消耗已不能滿足微生物的生長(zhǎng)繁殖，微生物開(kāi)始利用肉中游離的氨基酸等小分子物質(zhì)作為碳源，此過(guò)程會(huì)因降解氨基酸而產(chǎn)生酮酸和氨類(lèi)，而因此產(chǎn)生惡臭味［33］。腸桿菌屬、假單胞菌屬、沙門(mén)氏菌屬和乳酸菌屬等都是腐敗過(guò)程中氨類(lèi)物質(zhì)的主要微生物源［34］。

在肉類(lèi)腐敗中期和末期，此時(shí)微生物菌群數(shù)量達(dá)到一定規(guī)模，其分泌的蛋白酶足以降解肉中的蛋白質(zhì)以進(jìn)一步增殖，加速肉的腐敗變質(zhì)，肉本身也出現(xiàn)不同程度的腐爛、惡臭、顏色變暗或變綠，其表面也產(chǎn)生黏性物質(zhì)，甚至滋生霉菌［33，35］。

2.2水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)微生物致腐過(guò)程

水產(chǎn)魚(yú)類(lèi)腐爛前會(huì)因?yàn)闄C(jī)體死亡后停止呼吸，導(dǎo)致厭氧條件下糖酵解作用引發(fā)乳酸堆積，導(dǎo)致體內(nèi)pH值下降，此時(shí)魚(yú)體僵硬，但鮮度基本沒(méi)有被破壞［36］。隨后魚(yú)類(lèi)開(kāi)始進(jìn)入腐敗階段，伴隨微生物的生長(zhǎng)繁殖，魚(yú)體內(nèi)蛋白質(zhì)經(jīng)微生物脫羧酶作用，催化氨基酸脫羧而產(chǎn)生生物胺（鹽酸丁二胺、五甲烯二胺、組胺、酪胺等［36］）及小分子碳源開(kāi)始積累。隨著微生物的生長(zhǎng)，魚(yú)肉鮮度降低至最終完全腐敗。

捕獲后的新鮮水產(chǎn)魚(yú)類(lèi)一般不會(huì)進(jìn)行細(xì)致清洗，其表面、鰓內(nèi)和其他器官內(nèi)存在著大量微生物，隨著各種氨基酸及小分子碳源的增加，這些微生物開(kāi)始快速繁殖，在降解氨基酸和其他小分子物質(zhì)的同時(shí)產(chǎn)生一種名為“三甲胺”的物質(zhì)，進(jìn)而產(chǎn)生腥臭味［36］。伴隨微生物的大量繁殖，微生物侵入各個(gè)器官，引發(fā)魚(yú)體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸的降解，從而最終造成水產(chǎn)魚(yú)類(lèi)的完全腐敗，此時(shí)魚(yú)已經(jīng)失去食用營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

3　生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)腐敗研究中常用的微生物菌相分析方法

分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)對(duì)生命體進(jìn)行分子水平的操作，以實(shí)現(xiàn)對(duì)生命體的改造［37］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，微生物分子生態(tài)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。微生物分子生態(tài)技術(shù)是利用分子生物學(xué)的技術(shù)方法對(duì)環(huán)境中的微生物進(jìn)行分子水平的研究，從而了解環(huán)境中微生物的功能、多樣性及群落結(jié)構(gòu)［37］。其中DNA指紋識(shí)別技術(shù)作為分子生態(tài)技術(shù)中的基礎(chǔ)研究方法，被廣泛應(yīng)用于食品微生物菌相的研究中。DNA指紋技術(shù)是一種利用不同個(gè)體間DNA片段差異性而對(duì)不同個(gè)體進(jìn)行鑒定的分子生物學(xué)手段［14］。細(xì)菌16S rDNA、真菌18S rDNA和真核ITS序列在不同微生物中具有特異性，常被用作微生物分類(lèi)的依據(jù)，并可用于檢測(cè)微生物的相對(duì)數(shù)量。為了對(duì)細(xì)菌16S rDNA、真菌18S rDNA和ITS序列進(jìn)行鑒定，常常用到以下分子生態(tài)技術(shù)。

3.1變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)

DGGE技術(shù)是1979年由Fischer等［38］最先提出的鑒定DNA突變的一種電泳分離技術(shù)，而Muyze等［39］首次將DGGE技術(shù)應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究，成為鑒定自然界微生物種群多樣性常用的技術(shù)手段。

DGGE技術(shù)可以將長(zhǎng)度相同而堿基不同的雙鏈DNA片段（即突變序列）進(jìn)行分離。利用雙鏈DNA序列堿基排列方式影響解鏈溫度的原理，將雙鏈DNA片段在含梯度變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，當(dāng)雙鏈DNA片段遷移到梯度凝膠一定距離且達(dá)到解鏈溫度后，開(kāi)始部分解鏈［40］。DNA分子解鏈程度越小其遷移程度越大，從而使解鏈程度不同的雙鏈DNA分子分離，獲得純合的DNA片段［40］。為了在電泳過(guò)程中保證DNA雙鏈不完全分離，DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，其5'端會(huì)被引入一段30～50 bp的富含G/C堿基的“GC夾板”（GC-clamp），以保證DNA片段在梯度凝膠電泳時(shí)能夠充分分離［40］。

圖1　利用DGGE技術(shù)鑒別真空冷藏牛肉中的菌相分布［1133］Fig.1　Bacterial community of vacuum-packaged beef evaluated by DGGE fingerprint［13］

在生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)中，DGGE技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于微生物菌相的多樣性分析以及微生物菌相動(dòng)態(tài)變化的監(jiān)測(cè)。Fontana等［13］首次采用DGGE技術(shù)，確定了保藏末期真空冷藏牛肉中主要微生物為乳酸菌類(lèi)。Broekaert等［28］則在冷凍保藏的水產(chǎn)魚(yú)類(lèi)中檢測(cè)到培養(yǎng)基未能培養(yǎng)出的霉實(shí)假單胞菌（Pseudomonas fragi）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter spp.）。DGGE技術(shù)作為分子生態(tài)學(xué)最基本的手段，已成為食品微生物菌相變化研究的常用手段。然而，盡管DGGE技術(shù)克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)法不能反映食物中真實(shí)菌相分布的缺點(diǎn)，但該方法還存在一定局限性。一些稀有微生物的基因組含量較低，采用DGGE技術(shù)鑒定的結(jié)果（圖1）只能反映優(yōu)勢(shì)微生物（清晰較深的條帶）的分布狀態(tài)，也不能將生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)中活菌和死菌的分布狀態(tài)進(jìn)行區(qū)分。因此，該方法只能用來(lái)定性分析生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)總體菌相變化，不能鑒定出全部微生物物種。

3.2末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（terminal restriction fragment length polymorphism，TRFLP）技術(shù)

TRFLP技術(shù)結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù)、DNA限制酶切技術(shù)和DNA自動(dòng)測(cè)序儀技術(shù)，能夠?qū)μ囟ê怂崞伍L(zhǎng)度多態(tài)性進(jìn)行測(cè)定，來(lái)鑒別環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)和功能［41］。

TRFLP技術(shù)在目標(biāo)基因保守區(qū)擴(kuò)增時(shí)，在5'端引入熒光標(biāo)記序列（HEX、TET、6-FAM等）［42］。根據(jù)不同物種DNA保守區(qū)序列酶切位點(diǎn)不同的原理，對(duì)擴(kuò)增后的保守區(qū)進(jìn)行酶切，用熒光測(cè)序儀對(duì)帶有熒光標(biāo)記的不同長(zhǎng)度的酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)［43］。通過(guò)熒光測(cè)序儀所收集的熒光信息及生成的TRFLP圖譜分析，便可分析得到微生物群落結(jié)構(gòu)的物種種類(lèi)、數(shù)量，確定微生物群落的結(jié)構(gòu)變化［37］。

TRFLP技術(shù)方便快捷，相比DGGE技術(shù)更加靈敏方便。Kiermeier等［44］采用TRFLP和454測(cè)序技術(shù)，確定豬肉在真空和100% CO2保藏條件下微生物菌相隨保藏時(shí)間推移并不相同。Smith等［45］則利用TRFLP在牙鱈表面檢測(cè)到了發(fā)光細(xì)菌的存在。與DGGE技術(shù)相比，TRFLP技術(shù)可以定量檢測(cè)微生物的相對(duì)含量（圖2），可定量監(jiān)測(cè)微生物的變化規(guī)律。

圖2　利用TRFLP峰值數(shù)據(jù)對(duì)不同時(shí)期真空條件和110000%　CCOO2條件保藏的羊肉菌相進(jìn)行典型相關(guān)分析［4444］Fig.2　Canonical analysis of principal coordinates of TRFLP peak data from lamb samples packaged in vacuum and 100% CO2modified atmosphere［44］

3.3基于高通量測(cè)序技術(shù)的微生物鑒定系統(tǒng)（highthroughput sequencing）

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，測(cè)序時(shí)間和成本大幅降低，為微生物種群物種鑒定奠定基礎(chǔ)。以高通量測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的主要測(cè)序平臺(tái)包括Illumina的Hiseq和Miseq平臺(tái)、Roche454平臺(tái)以及Ion Torrent平臺(tái)。Illumina高通量測(cè)序技術(shù)因其測(cè)序通量高、數(shù)據(jù)量大而被廣泛使用，其中測(cè)序耗時(shí)更短的Miseq技術(shù)和測(cè)通量更高的Hiseq技術(shù)被廣泛應(yīng)用于微生物物種鑒定及豐度測(cè)定中。

該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于污水處理等環(huán)境樣本的菌相研究中［46］。盡管還未見(jiàn)生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)中有過(guò)該技術(shù)報(bào)道，但在熟肉［47］等微生物鑒定中已有報(bào)道。Po?ka等［47］在最新的研究中利用高通量測(cè)序技術(shù)，在香腸發(fā)酵過(guò)程中成功鑒定到了多種葡萄球菌及乳酸菌類(lèi)（圖3）。通常采用高通量測(cè)序技術(shù)在生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)中可以鑒定到上百種微生物，這是傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法和DGGE技術(shù)所無(wú)法比擬的，此外，高通量測(cè)序技術(shù)可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行平行測(cè)序，進(jìn)而對(duì)環(huán)境樣本物種分類(lèi)、豐度、種群結(jié)構(gòu)及群落變化等進(jìn)行對(duì)比分析，從而系統(tǒng)地反映樣品中微生物的菌相變化。值得一提的是，該系統(tǒng)需要與構(gòu)建好的基因文庫(kù)進(jìn)行比對(duì)才能確定微生物物種。目前常用的基因文庫(kù)有16S rDNA、18S rDNA以及某些抗性基因的基因文庫(kù)，而其他具有特定功能的基因文庫(kù)種類(lèi)并不豐富，有待進(jìn)一步完善。

圖3　根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果對(duì)香腸中微生物進(jìn)行聚類(lèi)分析［4477］Fig.3　Hierarchical clustering of microbial classified sequences by highthroughput sequencing in Italian salami［47］

3.4實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）

實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time PCR）技術(shù)是利用熒光信號(hào)作為探針以監(jiān)測(cè)模板定量的PCR檢測(cè)技術(shù)。通常采用SYBR Green作為熒光嵌合或TaqMan作為探針，在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的每一個(gè)循環(huán)中，通過(guò)檢測(cè)隨機(jī)擴(kuò)增產(chǎn)物同步積累的熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)特異性擴(kuò)增模板的進(jìn)行定量分析［48］。

由于Real-time PCR能夠靈敏、快速地檢測(cè)出模板量相對(duì)較少的DNA，被廣泛應(yīng)用于微生物的定量分析檢測(cè)和功能基因的檢查［17］。Gattuso等［17］采用Real-time PCR方法，在豬肉保藏期間，檢測(cè)李斯特氏菌的增殖變化，確認(rèn)李斯特氏菌是豬肉腐敗末期的主要微生物之一。Kumar等［49］則利用Real-time PCR技術(shù)，確定腐敗末期的海鮮魚(yú)類(lèi)微生物以假單胞菌、嗜冷菌以及沙雷氏菌為主（圖4）。Real-time PCR技術(shù)通過(guò)定量分析微生物物種DNA數(shù)量，更加直觀地表現(xiàn)了不同微生物在微生物菌群中數(shù)量水平的變化，從而確定優(yōu)勢(shì)菌群。Real-time PCR技術(shù)不僅可以定量確定優(yōu)勢(shì)菌群，還可以檢測(cè)稀有菌的存在。Bjornsdottir-Butler等［32］利用Real-time PCR技術(shù)在保藏的金槍魚(yú)中檢測(cè)到少量存在的摩氏摩根菌，而使用DGGE技術(shù)未檢測(cè)到該菌，證實(shí)了Real-time PCR的靈敏性。

Real-time PCR技術(shù)與其他技術(shù)不同，是對(duì)活菌中RNA進(jìn)行分析的技術(shù)，是鑒定活菌菌相的有效技術(shù)手段。相信該技術(shù)今后在研究生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)物流 過(guò)程中菌相變化的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

圖4　利用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)海鮮食品中沙門(mén)氏菌的數(shù)量變化［4499］Fig.4　Detection of Salmonella in seafood by real-time PCR assay［49］

3.5分子生態(tài)技術(shù)展望

以上4 種分子生態(tài)技術(shù)均為近年在生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)菌相研究中的常用手段。它們均能進(jìn)行微生物的物種鑒定和豐度分析，反映生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)中細(xì)菌和真菌的分布狀態(tài)。在生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)微生物總DNA的提取過(guò)程中，食物DNA混雜于其中，對(duì)微生物的豐度檢測(cè)產(chǎn)生了干擾。為此，通過(guò)建立細(xì)菌16S rDNA文庫(kù)和真菌18S rDNA及ITS文庫(kù)，將樣品總DNA與文庫(kù)進(jìn)行比對(duì)篩選，排除測(cè)序獲得的肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)DNA序列，提高微生物豐度分析的精度。

在食物腐敗過(guò)程中，一些死亡微生物的DNA不能完全降解，采用基于微生物總DNA的研究方法不能區(qū)分食物中活菌與死菌。因此，采用基于DNA的分子生態(tài)技術(shù)并不能反映食物中活菌的分布狀態(tài)。由于死亡微生物的RNA會(huì)快速降解，通過(guò)對(duì)微生物總RNA的分析可以更加可靠地反映出活菌菌相的分布狀態(tài)，這對(duì)研究生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)微生物菌相變化有著重要意義。然而，目前該領(lǐng)域還只局限在對(duì)微生物總DNA水平的研究分析，而基于微生物總RNA的分析技術(shù)鮮見(jiàn)于生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)的菌相研究，這也限制了分子生態(tài)技術(shù)在生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)中微生物菌相研究的發(fā)展。

此外，DNA微陣列（DNA microarray）、自動(dòng)核糖體間隔基因分析（automated ribosomal intergenic spacer analysis，ARISA）、單鏈構(gòu)型多態(tài)性分析（single-strand conformation polymorphism，SSCP）、核糖體DNA擴(kuò)增片段限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）等技術(shù)均為常用的分子生態(tài)技術(shù)。但根據(jù)近年報(bào)道［17-49］，這些技術(shù)尚未在生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)微生物菌相研究中被廣泛應(yīng)用。一些技術(shù)與本文介紹的4 種技術(shù)方法相似（如SSCP與DGGE技術(shù)，ARDRA與TRFLP技術(shù)等），同時(shí)某些技術(shù)隨著分子生態(tài)技術(shù)的發(fā)展而被逐漸取代（如以DNA微陣列為基礎(chǔ)發(fā)展而來(lái)的高通量測(cè)序技術(shù)因具有更高的測(cè)通量，將成為分子生態(tài)研究中的主流技術(shù)之一）。相信隨著該領(lǐng)域研究的不斷深入，更多的分子生態(tài)技術(shù)將被廣泛應(yīng)用。

4　結(jié) 語(yǔ)

本文綜述了生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)物流過(guò)程中常見(jiàn)的微生物物種。其中乳酸菌類(lèi)、肉食桿菌、沙門(mén)氏菌屬、假單胞菌屬、熱殺索絲菌和單增李斯特氏菌等是腐敗過(guò)程中常被報(bào)道的微生物，而一些發(fā)光細(xì)菌和酵母菌、霉菌等真菌也偶爾被發(fā)現(xiàn)。在腐敗初期，乳酸菌類(lèi)、肉食桿菌、假單胞菌屬、熱殺索絲菌等微生物被檢測(cè)到的水平較低，而隨著時(shí)間推移，在腐敗末期這些微生物成為食物腐敗的主要微生物，這表明隨著生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)腐敗的進(jìn)行，微生物種類(lèi)和豐度也在發(fā)生著動(dòng)態(tài)變化。此外，微生物種類(lèi)與物流過(guò)程中保藏方式密切相關(guān)。在真空保藏的條件下常檢測(cè)到明串珠菌屬、棒狀桿菌屬等微生物，而在托盤(pán)包裝中大腸桿菌、不動(dòng)桿菌及梭桿菌等微生物又常被發(fā)現(xiàn)于腐敗的生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦中。生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)在腐敗過(guò)程中的菌相研究經(jīng)歷了由傳統(tǒng)培養(yǎng)方法到分子生態(tài)學(xué)研究的重要轉(zhuǎn)型時(shí)期。本文綜述了近5 a常用于生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)相關(guān)分子生態(tài)技術(shù)，介紹了該領(lǐng)域作為基礎(chǔ)研究手段而被廣泛使用的DGGE技術(shù)、與熒光技術(shù)相結(jié)合的TRFLP技術(shù)、可以檢測(cè)功能基因的Realtime PCR技術(shù)和新一代的高通量測(cè)序技術(shù)。

盡管人們對(duì)生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)中微生物的菌相變化進(jìn)行了很多研究，但對(duì)食品變質(zhì)過(guò)程中與腐敗相關(guān)的功能基因及耐受基因的研究還有待深入。此外，采用基于微生物總DNA的研究策略并不能區(qū)分出活菌與死菌的分布水平。能夠監(jiān)測(cè)活菌的總RNA分析技術(shù)在生鮮家畜肉類(lèi)及水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)的菌相研究中有待推廣使用。

生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)的菌相分析研究為預(yù)防食品變質(zhì)、延長(zhǎng)貨架期等提供重要的理論依據(jù)。作為新一代的研究策略，高通量測(cè)序技術(shù)可以更加全面、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)食品中微生物的菌相變化，特別是微生物高通量測(cè)序平臺(tái)的建立，使得食品微生物菌種鑒定和菌相變化規(guī)律的研究更加自動(dòng)化、精準(zhǔn)化，將成為食品微生物菌相研究的重要研究手段。筆者正在對(duì)生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)中微生物總RNA的分析技術(shù)進(jìn)行探索，結(jié)合高通量測(cè)序、Real-time PCR等分子生態(tài)技術(shù)對(duì)物流過(guò)程中微生物活菌的菌相變化進(jìn)行研究。隨著基于RNA分析技術(shù)的不斷完善以及高通量測(cè)序技術(shù)在該領(lǐng)域的普及，相信生鮮家畜肉類(lèi)和水產(chǎn)魚(yú)蝦類(lèi)的菌相研究會(huì)更加深入，將為食品保鮮技術(shù)的發(fā)展提供理論上的保障。

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Progress in Research on Microbial Flora in Fresh Livestock Meat and Aquatic Fish and Shrimp during Logistics

YANG Chao， CHE You， SONG Cunjiang*
（Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology， Ministry of Education， College of Life Sciences，Nankai University， Tianjin300071， China）

Spoilage of fresh livestock meat and aquatic fish and shrimp is mainly caused by microbial growth during logistics. In recent years， with the rapid development of molecular ecological techniques， many kinds of microbes have been detected in fresh livestock meat and aquatic fish and shrimp， including Carnobacterium spp.， Lactobacillus spp.， Salmonella spp.， Pseudomonas spp.， Leuconostoc spp.， Brochothrix thermosphacta， Listeria monocytogenes， yeasts， molds and so on. This review summarizes common molecular biology techniques that were applied during 2010 to 2015 to microbial flora in fresh livestock meat and aquatic fish and shrimp during logistics. Molecular ecological techniques including denaturing gradient gel electrophoresis， terminal restriction fragment length p olymorphism， high-throughput sequencing and realtime PCR are also described to provide a reference for studying microbial flora in fresh livestock meat and aquatic fish and shrimp during logistics.

fresh livestock meat； aquatic fish and shrimp； spoilage； microbial flora； molecular ecological techniques

TS201.3

A

1002-6630（2015）23-0307-07

10.7506/spkx1002-6630-201523056

2015-02-05

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAD16B04）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31470213；31170030）；天津市重點(diǎn)支撐計(jì)劃項(xiàng)目（13JCZDJC27800；13JCYBJC24900；13TXSYJC40100；14ZCZDSF00009）

楊超（1991—），男，博士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩-mail：ychych3412@163.com

宋存江（1961—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩-mail：songcj@nankai.edu.cn