史可夫,肖 雄,吳雙雙,李月雙,陳從貴*
(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院,安徽 合肥 230009)
超高壓對肌球蛋白-海藻酸鈉-氯化鈣混合凝膠特性的影響
史可夫,肖雄,吳雙雙,李月雙,陳從貴*
(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院,安徽 合肥230009)
本實驗以含有0.5%海藻酸鈉(sodium alginate,SA)和0.2%氯化鈣(CaCl2)的雞肉肌球蛋白混合體系(M-SA-CaCl2)為研究對象,考察超高壓處理(high pressure processing,HPP)(100~400 MPa)對混合體系凝膠特性(凝膠保水性(water-holding capacity,WHC)和凝膠強度)的影響。通過分析M-SA-CaCl2混合體系表面疏水性、活性巰基含量、流變特性及凝膠微結構的變化,探討混合凝膠特性的變化機制。結果表明: 1)混合凝膠WHC隨著壓力的提高(100~400 MPa)而顯著增加(P<0.05),而凝膠強度隨之顯著降低(P<0.05); 2)HPP能夠增加M-SA-CaCl2混合凝膠體系內部的活性巰基含量,強化混合體系內部疏水作用,減弱SA和CaCl2對肌球蛋白凝膠的增強作用,降低肌球蛋白的熱凝膠能力以及凝膠網絡結構的蛋白質聚集程度,由此導致混合凝膠特性的變化。
超高壓;肌球蛋白;海藻酸鈉;氯化鈣;凝膠特性
肌球蛋白(myosin,M)是原料肉中含量最高的蛋白質,約占肌肉總蛋白質的1/3,占肌原纖維蛋白的50%~55%;其保水性(water-holding capacity,WHC)和硬度直接影響肉制品的多汁性、質構、風味等品質[1]。
利用多糖替代脂肪、非鈉鹽替代鈉鹽,是開發(fā)低脂低鹽肉制品的一條有效途徑。海藻酸鈉(sodium alginate,SA)是一種親水多糖和常用的食品添加劑,具有膳食纖維的生理功能,有助于預防肥胖、高血脂等疾?。籗A用作為肉制品中的脂肪替代物,可增強肉凝膠的WHC,但也會導致肉凝膠硬度的顯著降低[2]。氯化鈣(CaCl2)是常見的鈉鹽替代鹽,對肉蛋白凝膠特性有著重要影響;一定濃度范圍的CaCl2可提高肉蛋白凝膠強度,但也顯著降低了凝膠的WHC值[3-4]??梢?,SA與CaCl2對改善肉制品的凝膠特性似乎存在著互補性,而Montero[5]以及Pérez-Mateos[6]等研究發(fā)現(xiàn),在含有SA的魚糜凝膠中添加一定量的CaCl2,可增強凝膠的刺穿強度,卻導致凝膠WHC值的顯著降低。
超高壓處理(high pressure processing,HPP)作為一種物理加工技術,可在不影響肉制品營養(yǎng)和風味的前提下延長制品貨架期、改善肉制品保水及質構特性等,彌補了傳統(tǒng)熱加工技術的缺陷[7],也有利于改善蛋白的凝膠功能特性,提高凝膠穩(wěn)定性[8]。李勇等[9]提出HPP可以降低鹽的使用量,同時改善肉凝膠制品的持水性和凝膠性;Chen Xing[10]和Ma Fei[11]等利用高壓處理肌肉蛋白-多糖混合凝膠體系,發(fā)現(xiàn)HPP能夠顯著增強混合凝膠WHC。由此可見,HPP能夠改善肉蛋白混合凝膠特性,尤其是可以提高混合凝膠的WHC值。而HPP如何影響M-SA-CaCl2體系凝膠特性,能否改善其凝膠特性,尚未見文獻報道。
本實驗將HPP應用于M-SA-CaCl2混合體系,考察HPP對其凝膠WHC和強度的影響,并通過分析HPP對混合體系表面疏水性、活性巰基、流變特性和凝膠微觀結構變化的影響,探討混合體系凝膠特性變化的機制,為HPP在低鹽低脂肉制品開發(fā)中的應用提供理論參考。
1.1材料與試劑
原料:雞胸肉,購于合肥家樂福購物廣場,冰箱中(約4 ℃)冷藏。
輔料:海藻酸鈉(化學純,質量分數(shù)為1%的SA水溶液黏度為200 mPa·s)國藥集團化學試劑有限公司;無水氯化鈣(分析純,CaCl2質量分數(shù)≥96.0%)西隴化工有限公司。
氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀國藥集團化學試劑有限公司;8-苯胺基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid hydrate,ANS)生工生物工程(上海)股份有限公司;5-5'-二硫代-2-硝基苯甲酸(5,5'-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB)阿拉丁試劑有限公司;以上試劑均為分析純。
1.2儀器與設備
HPP.L2B 600MPa/0.6L超高壓試驗臺天津華泰森淼生物科技有限公司;BD(C)-69冷藏柜青島澳柯瑪股份有限公司;BC/BD-241GS冰柜青島海爾集團公司;GL-21M高速離心機湖南湘儀離心儀器有限公司;DS-1高速組織搗碎機上海越磁電子科技有限公司;FA25高剪切乳化機上海弗魯克流體機械制造有限公司;TA-XT Plus質構儀英國Stable Micro System公司;JSM 6490LV掃描電子顯微鏡、JFC-1600噴金儀日本Jeol公司;HH-2數(shù)顯水浴鍋江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠;HR-3型流變儀美國TA公司;Power wave 全波長掃描酶標儀美國Bio-Tek公司。
1.3方法
1.3.1肌球蛋白提取
剔除雞胸肉中的可見脂肪和結締組織,切碎,稱質量約160 g。參照Chen Xing等[10]的方法,在0~4 ℃條件下提取肌球蛋白;并用0.6 mol/L 氯化鉀磷酸鹽緩沖液(pH 6.5),將提取的肌球蛋白質量濃度標準化到20 mg/mL。
1.3.2M-SA-CaCl2混合凝膠體系制備
向60 g肌球蛋白(20 mg/mL)溶液中加入質量分數(shù)0.5% SA,緩慢攪拌30 min,至完全溶解,在冰箱中(約4 ℃)靜置過夜(約12 h),形成M-SA混合溶液;再向M-SA混合溶液中加入質量分數(shù)0.2% CaCl2,充分攪拌(10 min),在冰箱中靜置4~12 h。
1.3.3HPP條件
參照Chen Xing等[10]的方法。壓力水平設為0.1(未加壓)、100、200、300、400 MPa,保壓時間10 min。樣品在處理前后均置于裝有冰袋的泡沫保溫盒中,低溫(約0 ℃)保存。
1.3.4M-SA-CaCl2混合凝膠制備
將處理后的M-SA-CaCl2樣品倒入小燒杯(Φ 27 mm×35 mm),置于20 ℃水浴鍋中,以2 ℃/min的升溫速率加熱至80 ℃,恒溫30 min,取出小燒杯,冰水浴中冷卻10 min后,放入冰箱中過夜(約12 h),供檢測。
1.3.5凝膠強度測定
利用TA-XT Plus質構儀GMIA程序測定M-SA-CaCl2混合凝膠強度,單位為g。測定參數(shù)為:探頭選用P/0.5,測前速率1.50 mm/s,測中速率1.00 mm/s,測后速率1.00 mm/s,穿刺距離4 mm,觸發(fā)力5 g。檢測重復6 次。
1.3.6WHC測定
參照Zhou Yanzi等[12]的方法。取約5 g凝膠在3 000 r/min條件下離心10 min。實驗重復6 次。
1.3.7流變學性質測定
選用流變儀的振蕩模式,Φ60 mm平板,狹縫0.55 mm,應變2%,頻率0.1 Hz。測定分為升溫和降溫兩個過程,升溫速率2 ℃/min,升溫范圍20~80℃;降溫速率4 ℃/min,降溫范圍80~20 ℃。
1.3.8表面疏水性測定
參照Chen Xing等[10]的方法。將樣品液用0.6 mol/L 氯化鉀磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)稀釋至蛋白質質量濃度為1 mg/mL,取4 mL蛋白稀釋液,加入15 mmol/L的ANS溶液20 μL,振蕩儀中振蕩攪拌5 min;再在室溫(20 ℃)下靜置20 min,然后取0.2 mL反應液,用酶標儀在激發(fā)波長380 nm、發(fā)射波長470 nm條件下測定其熒光強度。檢測重復3 次。
1.3.9表面活性巰基含量測定
參照Chen Xing等[10]的方法。取上述蛋白質質量濃度為1 mg/mL的稀釋液4 mL,加入50 μL 10 mmol/L的DTNB溶液,避光充分反應20 min。以上述4 mL磷酸鹽緩沖液加50 μL 10 mmol/L DTNB作為空白,利用酶標儀在412 nm波長處測定其吸光度A。巰基含量按下式計算。
式中:D為稀釋倍數(shù);ρ蛋白為肌球蛋白質量濃度/(mg/mL)。實驗重復3 次。
1.3.10掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察
將蛋白凝膠樣品置于4%甲醛-2.5%戊二醛混合溶液(1∶1,V/V)中固定2 h,待凝膠樣品固定變硬,將樣品切成10 mm×10 mm×2 mm薄片;用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)漂洗5~10 次;用乙醇(30%、40%、60%、80%、100%)溶液梯度脫水,每次10 min,用冷風除去易揮發(fā)的有機溶劑;真空冷凍干燥15 h;噴金,觀察。
1.4數(shù)據(jù)分析
實驗數(shù)據(jù)利用Excel 2003軟件計算,采用t-檢驗進行單因素顯著性分析,差異顯著性水平為P<0.05;用Origin 8.0軟件作圖。
2.1HPP對M-SA-CaCl2混合凝膠特性的影響
2.1.1HPP對M-SA-CaCl2混合凝膠WHC的影響
圖1 HPP對M-SA-CaaCCll2混合凝膠WHHCC的影響Fig.1 Effect of HPP on WHC of thermal M-SA-CaCl2gel
由圖1可知,與未受壓(0.1 MPa)組相比,壓力為100 MPa時,混合凝膠WHC沒有顯著變化(P>0.05),而當壓力水平為200~400 MPa時WHC顯著升高(P<0.05),且隨著壓力的增加而增加。同時,400 MPa處理可幾乎完全彌補添加SA和CaCl2而導致混合凝膠WHC的下降。
Xiong等[13]發(fā)現(xiàn)SA能顯著提高雞肉鹽溶性蛋白凝膠的保水性,這主要源于肌肉蛋白與SA形成的混合凝膠基質具有高截水能力。添加CaCl2導致M-SA混合凝膠持水性顯著降低,可能是由于Ca2+與SA之間更容易發(fā)生相互作用,形成SA-Ca2+聚合物,阻礙了肌球蛋白與SA的相互作用,進而影響其持水性能,導致混合凝膠WHC顯著低于純肌球蛋白凝膠。
HPP使得蛋白混合凝膠WHC顯著增高,Iwasaki等[14]200 MPa壓力處理雞肉肌原纖維蛋白凝膠以及Chen Xing等[10]100~400 MPa壓力處理肌球蛋白-卡拉膠混合凝膠也發(fā)現(xiàn)了類似結果。蛋白凝膠的持水性與靜電作用、疏水作用、氫鍵作用及微觀結構等密切相關[4]。HPP能夠影響蛋白質-蛋白質、蛋白質-多糖之間的相互作用以及蛋白質構象,間接影響凝膠持水性[15];HPP也會使得蛋白凝膠更加均勻致密,從而提高其持水性[11]。Ma Fei等[4]提出,HPP通過影響靜電效應而破壞二價陽離子和蛋白間的相互作用,并降低了蛋白復合體鹽橋重組概率,進而影響受壓混合凝膠的持水性。
2.1.2HPP對M-SA-CaCl2混合凝膠強度的影響
圖2 HPP對M-SA-CaaCCll2混合凝膠強度的影響Fig.2 Effect of HPP on the strength of M-SA-CaCl2gel
如圖2所示,當壓力水平在0.1~400 MPa范圍變化時,M-SA-CaCl2混合凝膠強度隨著壓力的增加而顯著降低(P<0.05)。同時,HPP可減弱由于添加SA和CaCl2而產生的凝膠強度提高;且壓力越大,減弱效應越明顯。
HPP導致蛋白混合凝膠強度的變化與很多因素有關,蛋白熱凝膠能力、蛋白與多糖之間相互作用力、二硫鍵及其他共價鍵以及凝膠網絡微觀結構的變化都可能會影響蛋白凝膠強度[10]。Ma Fei等[4]高壓處理(100~400 MPa)肌肉鹽溶性蛋白以及Chen Xing等[10]高壓處理(100~400 MPa)肌球蛋白-卡拉膠混合體系,都發(fā)現(xiàn)HPP會減弱蛋白混合凝膠強度,他們認為,在加壓過程中,尤其是當壓力超過200 MPa時,蛋白質的帶電基團和功能基團暴露出來,更容易與鹽離子和多糖發(fā)生相互作用形成聚合物,這種聚合物可能對蛋白質的變性凝膠起到阻礙作用,使得凝膠強度減弱[16]。此外,壓力過大可能會導致蛋白變性過快,使得蛋白質凝膠網絡結構相互交聯(lián)性降低,也會導致凝膠強度減弱[17]。
2.2HPP對混合凝膠體系表面疏水性和活性巰基的影響
與未受壓(0.1 MPa)組相比,100~400 MPa處理組顯著(P<0.05)增大了M-SA-CaCl2混合凝膠體系的表面疏水性,且隨著壓力的增大而逐漸增加(圖3)。同樣,100~400 MPa處理組也顯著(P<0.05)增加了混合體系的活性巰基含量,并且也隨著壓力的增大而增加;但在超過300 MPa時,巰基含量不再顯著增加(P>0.05)(圖4)。
圖3 HPP對M-SA-CaaCCll2混合凝膠表面疏水性的影響Fig.3 Effect of HPP on surface hydrophobicity of M-SA-CaCl2
圖4 HPP對M-SA-CaaCCll2混合凝膠活性巰基含量的影響Fig.4 Effect of HPP on reactive sulfhydryl content of M-SA-CaCl2
Chen Xing等[10]在研究受壓肌球蛋白-卡拉膠混合體系[10]、肌動球蛋白-SA混合體系[18],CAO Yingying等[8]研究兔肉肌球蛋白時都發(fā)現(xiàn)了類似的變化趨勢,HPP能夠引起蛋白質變性展開,使得包埋在蛋白質核心的疏水基團和活性巰基暴露于表面,導致了蛋白質表面疏水性和活性巰基含量的提高。這兩者的變化主要反映了蛋白質三級結構的變化[19]。表面疏水性與蛋白質疏水殘基的分布有關,被認為是肌球蛋白聚集、凝膠的先決條件[20]。巰基基團是蛋白質最重要的功能基團,顯著影響蛋白質的功能特性[21],CAO Yingying等[8]認為,HPP導致活性巰基含量的變化主要是由于肌球蛋白三級結構的改變,而不是S—S鍵的斷裂,因為誘導S—S鍵斷裂需要的能量是213.30 kJ/mol,遠高于HPP在10 000 MPa時所能提供的能量(8.37 kJ/mol)。受壓M-SA-CaCl2混合體系表面疏水性和活性巰基含量的顯著增加,說明HPP導致肌球蛋白三級結構發(fā)生了明顯變化。蛋白質變性展開,使得包埋在其核心部分的疏水基團和活性巰基暴露出來,這種暴露勢必影響M-M、M-SA、M-CaCl2的相互作用,引起混合體系發(fā)生聚集作用增加等一系列變化,導致凝膠特性的變化;疏水相互作用的增強也會減弱水分流動性,進而增強WHC[10]。
2.3HPP處理對混合凝膠體系流變特性的影響
儲能模量(G')是用來描述凝膠網絡結構屬性的重要流變學參數(shù),代表著流體中的彈性部分,反映了凝膠的強度[8]。δ值描述了黏彈性特征,反映了從黏性肌球蛋白溶液向彈性肌球蛋白凝膠的轉變[22]。
圖5 HPP對M-SA-CaaCCll2混合體系升溫過程中G'的影響Fig.5 Effect of HPP on storage modulus (G') of M-SA-CaCl2during heating
圖6 HPP對M-SA-CaaCCll2混合體系升溫過程ttaann δ的影響Fig.6 Effect of HPP on tan δ of M-SA-CaCl2during heating
如圖5所示,在未加熱(20 ℃)時,未受壓處理組M-SA-CaCl2混合體系的G'高于純肌球蛋白,M-SA-CaCl2混合體系的溶膠強度高于純肌球蛋白,SA和CaCl2對肌球蛋白溶液的溶膠增強作用明顯;當200~400 MPa處理時,混合體系的G'低于純肌球蛋白,且300 MPa和400 MPa處理組明顯低于200 MPa處理組。這說明HPP破壞了SA和CaCl2對肌球蛋白的凝膠增強作用,并且300 MPa和400 MPa的破壞作用強于200 MPa。加熱過程中,隨著壓力的增加(100~400 MPa)G'值呈下降趨勢,HPP降低了M-SA-CaCl2混合體系的熱凝膠能力;壓力為300 MPa和400 MPa組的G'和tan δ曲線特征均發(fā)生明顯變化(圖5、6),說明此時肌球蛋白已經發(fā)生變性,與表面疏水性和活性巰基含量的變化結果一致,HPP導致肌球蛋白變性,更多的帶電基團暴露[10],更容易與SA結合發(fā)生相互作用,進而阻礙肌球蛋白之間的聚集和三維網絡結構的形成,降低了G'值,減弱了混合體系熱凝膠能力以及最終形成的凝膠強度。
2.4SEM結果
由圖7A可知,未受壓的純肌球蛋白凝膠呈現(xiàn)出較大的不規(guī)則孔洞,質地松散,不緊密,較為粗糙。這種結構與其他處理組相比,能夠截留更多的水分,具備較高的凝膠持水性以及較弱的凝膠強度[4,10]。如圖7B、7C所示,添加SA和CaCl2形成的凝膠結構較致密,有較多、較大的蛋白凝膠聚集現(xiàn)象,孔徑較小且孔洞數(shù)量減少,而100 MPa處理并未明顯改變這種M-SA-CaCl2混合凝膠結構。Ma Fei等[4]也觀察到了類似現(xiàn)象,并認為蛋白質相分離和更大的肌球蛋白聚集對凝膠持水性和硬度有不利影響,但適當?shù)募∏虻鞍拙奂欣谠黾幽z強度,添加了CaCl2后肌球蛋白分子展開并通過二硫鍵、靜電作用、疏水作用、氫鍵等相互作用導致了更大的蛋白凝膠聚集[23]。凝膠微結構的變化可能與其高持水性和低凝膠強度有關[24]。對于我們的實驗,添加的CaCl2與SA會增強肌球蛋白的凝膠聚集現(xiàn)象,導致混合凝膠強度的增加;而400 MPa處理會減少蛋白凝膠的聚集現(xiàn)象,盡管凝膠內部孔徑變小且孔洞分布更加均勻,但仍導致了混合凝膠強度的降低(圖7D)。
圖7 HPP對M-SA-CaaCCll2混合凝膠微觀結構的影響Fig.7 Effect of HPP on microstructure (SEM image) of M-SA-CaCl2gel
HPP能夠顯著提高M-SA-CaCl2混合凝膠的WHC(P<0.05),彌補了外源添加SA和CaCl2對混合凝膠WHC降低的影響,但是,HPP也會降低M-SA-CaCl2混合凝膠的強度。
HPP通過增加M-SA-CaCl2混合凝膠體系內部的活性巰基含量,增強體系內部疏水作用,減弱SA和CaCl2對肌球蛋白凝膠的增強作用以及肌球蛋白的熱凝膠能力,并減少混合凝膠網絡結構的聚集現(xiàn)象,使得凝膠WHC增強,凝膠強度減弱。如何通過HPP、SA、CaCl2三者調控獲得理想WHC和凝膠強度的肉蛋白混合凝膠制品,值得進一步研究。
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Effect of High Pressure Processing on Properties of Chicken Breast Myosin Gel Containing Sodium Alginate and Calcium Chloride
SHI Kefu, XIAO Xiong, WU Shuangshuang, LI Yueshuang, CHEN Conggui*
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei230009, China)
High pressure processing (HPP) as a non-thermal processing technology has broad prospects in the meat industry. The effects of high pressure levels (100 - 400 MPa) on the properties of chicken breast myosin gel containing 0.5% (m/m) sodium alginate (SA) and 0.2% (m/m) calcium chloride (CaCl2) (M-SA-CaCl2) were investigated. The surface hydrophobicity, reactive sulfhydryl content, rheological properties and gel microstructure of M-SA-CaCl2were analyzed in order to understand the mechanism of the changes in the gel properties. The results showed that the water-holding capacity (WHC)of M-SA-CaCl2was significantly (P < 0.05) increased with elevating pressure while the gel strength was decreased. These changes could result from the significant (P < 0.05) increase in the surface hydrophobicity and reactive sulfhydryl content, weakened thermal gelation ability of M-SA-CaCl2, and reduced protein aggregation within mixed gel after HPP treatment.
high pressure processing; myosin; sodium alginate; calcium chloride; gel properties
TS251.51
A
1002-6630(2015)23-0033-05
10.7506/spkx1002-6630-201523007
2015-02-04
國家自然科學基金面上項目(31271893)
史可夫(1987—),男,碩士研究生,研究方向為肉制品加工。E-mail:shikefu.2008@163.com
陳從貴(1963—),男,教授,碩士,研究方向為肉制品加工及副產物綜合利用。E-mail:ccg1629@163.com