劉　平，胡志和*，吳子健，薛　璐，王鳳玲

（天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津　300134）

超高壓對木瓜蛋白酶構(gòu)象及酶活力的影響

劉平，胡志和*，吳子健，薛璐，王鳳玲

（天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津300134）

為研究超高壓對木瓜蛋白酶構(gòu)象變化與酶活力的影響，本研究利用紅外光譜法和熒光光譜法對木瓜蛋白酶經(jīng)超高壓處理后的結(jié)構(gòu)變化及特定氨基酸微環(huán)境變化進行了分析。結(jié)果表明：與常壓相比，超高壓處理對木瓜蛋白酶活力均有顯著影響（P＜0.05）。其中，200 MPa、37 ℃、20 min處理時，酶活力在所選處理范圍內(nèi)達到最大，較常壓下的酶活力提高了6.8%；紅外光譜結(jié)果表明：超高壓處理后，木瓜蛋白酶二級結(jié)構(gòu)變化與酶活力變化相關(guān)性較差；熒光光譜結(jié)果顯示：200 MPa、37 ℃處理木瓜蛋白酶20 min，228 nm波長激發(fā)后木瓜蛋白酶的外源性熒光強度達到最低（2 023），熒光強度變化與酶活力變化規(guī)律有良好的相關(guān)性。因此，木瓜蛋白酶活性變化與疏水性氨基酸的暴露程度有關(guān)，暴露程度越小，酶活力越大。

高壓技術(shù)；木瓜蛋白酶；酶活力；空間構(gòu)象；紅外光譜；熒光光譜

木瓜蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶家族中具有廣泛特異性的肽鏈內(nèi)切酶。目前，關(guān)于木瓜蛋白酶的應(yīng)用［1-2］，提?。?-4］以及其他方面［5-11］的研究不少。其活性部位存在于兩個結(jié)構(gòu)域之間的裂縫。其中Cys25和His159分別在活性中心的兩邊，His159咪唑基一部分與Trp177形成疏水性區(qū)域，靠氫鍵與Asn175相連。根據(jù)其二級結(jié)構(gòu)，兩個結(jié)構(gòu)域分別主要由α-螺旋和β-折疊構(gòu)成［12-14］。劉偉等［15］用動態(tài)高壓微射流處理木瓜蛋白酶，熒光光譜分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶中色氨酸殘基暴露出來，形成了較為穩(wěn)定的新分子構(gòu)象。王公軻等［16］研究了乙硫異煙胺與木瓜蛋白酶的分子作用機制，發(fā)現(xiàn)乙硫異煙胺與木瓜蛋白酶的相互作用不僅存在疏水作用，而且有氫鍵作用。張存瀅等［17］研究Hg2+和Cu2+對木瓜蛋白酶活性與構(gòu)象的影響，發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶分子構(gòu)象的有序度與其活性成正相關(guān)。有關(guān)超高壓處理木瓜蛋白酶引發(fā)結(jié)構(gòu)變化與酶活性之間關(guān)系研究鮮有報道。對于木瓜蛋白酶空間結(jié)構(gòu)與酶活性關(guān)系的研究也不多。本實驗采用超高壓技術(shù)處理木瓜蛋白酶，用紅外光譜和熒光光譜分析處理后木瓜蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)變化，探討木瓜蛋白酶空間結(jié)構(gòu)變化與酶活力之間的關(guān)系。為探究通過改變空間結(jié)構(gòu)來提高木瓜蛋白酶活力提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑

木瓜蛋白酶、8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilinolnaphthalenesulfonic acid，ANS）美國Sigma公司；KBr（光譜級）上?；瘜W試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

HPP.L2-800/2.5超高壓設(shè)備天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；DC-2030節(jié)能型智能恒溫槽、Scientz-50N冷凍干燥機寧波新芝生物科技股份有限公司；Nicolet5700傅里葉紅外光譜儀美國尼高力儀器公司；F-4600熒光光度計日立高新技術(shù)公司；VELP漩渦振蕩器德祥科技有限公司；PB-10 pH計德國賽多利斯（北京）有限公司；TU-1810型紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3方法

1.3.1超高壓處理木瓜蛋白酶

將木瓜蛋白酶溶液（質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL，磷酸鹽緩沖液pH值為6.5）真空密封后，進行超高壓處理。選擇保壓時間20 min、溫度37 ℃，壓力分別為0.1、100、200、300、400、500、600 MPa，以常壓（0.1 MPa）條件下的酶溶液作為對照組。

1.3.2木瓜蛋白酶活力的測定［18］

超高壓處理后的木瓜蛋白酶溶液立即進行Folin-酚法檢測，每組3 個平行。酶活力計算如下。

式中：X為樣品的酶活力/（U/g）；A為由標準曲線得出的樣品最終稀釋液的酶活力/（U/mL）；V為溶解樣品所使用的容量瓶的體積/mL；4為反應(yīng)試劑的總體積/mL；n為樣品的稀釋倍數(shù)；m為樣品的質(zhì)量/g；10為反應(yīng)時間/min。

1.3.3木瓜蛋白酶的紅外光譜掃描

取100 mg KBr壓片，采用傅里葉紅外光譜儀掃描，扣除背景后，取2 mg高壓處理后凍干樣品與100 mg KBr混合，壓片，掃描波長范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.4木瓜蛋白酶的熒光光譜掃描

1.3.4.1木瓜蛋白酶的內(nèi)源性熒光光譜

超高壓處理的木瓜蛋白酶緩沖溶液（0.1 mg/mL）分別在295 nm和280 nm波長處激發(fā)，掃描300～400 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。狹縫寬度5 nm。

1.3.4.2木瓜蛋白酶的外源性熒光光譜

取超高壓處理的木瓜蛋白酶緩沖溶液（0.1 mg/mL） 4 mL，加入20 μL的ANS（5.0 mmol/L）。避光反應(yīng)1 h后，228 nm波長激發(fā)，掃描310～420 nm波長范圍的發(fā)射光譜。狹縫寬度5 nm。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用EZ OMNIC軟件分析紅外光譜的變化，實驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.0作圖，SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1超高壓處理對木瓜蛋白酶活性的影響

圖1　37 ℃、20 min不同壓力處理對木瓜蛋白酶活力的影響Fig.1　Effect of different pressure treatments at 37 ℃ for 20 min on papain activity

由圖1可知，壓力對木瓜蛋白酶活力的影響較對照組（0.1 MPa）相比，變化顯著（P＜0.05）。在所選壓力范圍內(nèi)（100～600 MPa）處理，酶活力逐漸增加隨后又降低。酶活力達到最大的壓力處理條件為200 MPa，37 ℃，20 min時，比常壓下提高了6.8%。這可能是因為超高壓改變了木瓜蛋白酶的部分空間構(gòu)象，而這些空間構(gòu)象影響木瓜蛋白酶的活力［19］。所以改變了木瓜蛋白酶的空間構(gòu)象，也間接地影響了酶的活力大小。

2.2超高壓處理引發(fā)木瓜蛋白酶二級結(jié)構(gòu)的變化與酶活力的關(guān)系

圖2　37 ℃、20 min不同壓力處理后木瓜蛋白酶的紅外光譜圖Fig.2　Infrared spectra of papain treated by different pressures at 37 ℃for 20 min

目前，紅外光譜是研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的常用方法之一［20-21］。其中酰氨Ⅰ帶（1 600～1 700 cm-1）是對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化很敏銳的一個譜帶。1 600～1 639 cm-1被認為β-折疊結(jié)構(gòu)，1 661～1 700 cm-1被指認為β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1 651～1 660 cm-1被認為α-螺旋結(jié)構(gòu)；1 640～1 650 cm-1被指認為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)［22］。圖2是不同壓力處理后木瓜蛋白酶的紅外光譜圖；經(jīng)EZ OMNIC軟件去卷積處理紅外圖譜后其二級結(jié)構(gòu)的變化分析見表1。

表1　木瓜蛋白酶二級結(jié)構(gòu)中-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角的峰面積x± 3）Table 1 Peak areas of -helix， -turn and -sheet in secondary structure of papain （x ， 3）

經(jīng)SPSS分析，100～600 MPa處理后，木瓜蛋白酶二級結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊）部分峰面積變化較未處理的二級結(jié)構(gòu)變化顯著（P＜0.05）。其中，α-螺旋峰面積大小呈先增大后減小的趨勢，并在300 MPa時峰面積達到最大值。低于或高于300 MPa，α-螺旋峰面積與酶活力大小成正相關(guān)（圖3）。說明α-螺旋峰面積在一定的壓力范圍內(nèi)與木瓜蛋白酶酶活力有關(guān)。β-轉(zhuǎn)角峰面積先減小后增大，之后隨著壓力的持續(xù)增加趨于平穩(wěn)；β-折疊的峰面積隨壓力的增加出現(xiàn)了波動；但從100～600 MPa整個壓力范圍來分析，β-轉(zhuǎn)角和β-折疊的變化趨勢與酶活力的變化趨勢相關(guān)性較差。由此說明，木瓜蛋白酶經(jīng)過超高壓處理后，雖然不同的二級結(jié)構(gòu)含量發(fā)生一定變化，但與酶活力的變化關(guān)系不大。

圖3　3　α-螺旋、-　β-折疊和-　β-轉(zhuǎn)角的峰面積與酶活力之間的關(guān)系Fig.3　Relationship between papain activity and peak areas of α-helix，β-turn and β-sheet

2.3高壓處理木瓜蛋白酶引發(fā)氨基酸微環(huán)境的變化與酶活力的關(guān)系

2.3.1木瓜蛋白酶的內(nèi)源性熒光光譜分析

2.3.1.1295 nm波長處激發(fā)時木瓜蛋白酶的熒光光譜分析295 nm波長處激發(fā)時木瓜蛋白酶的熒光光譜見圖4。結(jié)合木瓜蛋白酶一級氨基酸序列［14］（表2）分析推測其有可能發(fā)生變化的氨基酸的位置。

圖4　295 nm激發(fā)波長不同高壓條件處理后木瓜蛋白酶的熒光光譜圖Fig.4　Fluorescence spectra of papain treated by different pressures at37 ℃ for 20 min at excitement wavelength of 295 nm

表2　木瓜蛋白酶序列Table 2　Amino acid sequence of papain

圖5　不同高壓條件處理后木瓜蛋白酶熒光強度與酶活力的關(guān)系Fig.5　Relationship between fluorescence intensity and papain activitytreated by different pressures at 37 ℃ for 20 min

由圖4可知，不同壓力（0.1～600 MPa）處理的木瓜蛋白酶，295 nm波長處激發(fā)后，其發(fā)射波長位移變化均在330～332 nm內(nèi)。結(jié)合Burstern提出的色氨酸殘基微環(huán)境的特點［23］分析：即1）λmax=330～332 nm，埋藏在非極性區(qū)域內(nèi)，2）λmax=340～342 nm，固定于蛋白質(zhì)分子表面，且與水的接觸受到限制，3）λmax=350～352 nm，徹底暴露于水中（其中λmax為熒光發(fā)射光譜的峰位），所以處理前后的木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)中色氨酸殘基埋藏在非極性區(qū)域內(nèi)。在200～600 MPa處理后，與對照組（0.1 MPa）相比熒光強度變化顯著（P＜0.05），且熒光強度在逐漸變大。說明色氨酸的暴露程度隨壓力增加而增大。由其一級結(jié)構(gòu)（表2），木瓜蛋白酶內(nèi)部色氨酸共有5 個，分別位于第7、36、69、177和181位。極有可能是上述位置的色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了變化，分析其熒光強度變化與酶活力的關(guān)系（圖5），發(fā)現(xiàn)相關(guān)性較小。

2.3.1.2280 nm波長處激發(fā)時不同壓力處理的木瓜蛋白酶熒光光譜分析

圖6　280 nm激發(fā)波長不同高壓條件處理后木瓜蛋白酶的熒光光譜圖Fig.6　Fluorescence spectra of papain treated by different pressures at37 ℃ for 20 min at excitement wavelength of 280 nm

280 nm波長處激發(fā)時，不同壓力處理的木瓜蛋白酶熒光光譜見圖6。100～600 MPa處理的木瓜蛋白酶熒光強度與對照組（0.1 MPa）相比變化顯著（P＜0.05）。說明隨壓力漸變，木瓜蛋白酶內(nèi)部Trp和Tyr微環(huán)境也處于漸變的狀態(tài)。但隨壓力變化，木瓜蛋白酶熒光強度呈現(xiàn)先升高又降低的反復(fù)性變化，可見隨著壓力不同程度的改變，Trp和Tyr二者或各自暴露，掩埋或同時暴露掩埋，亦或一種暴露另外一種掩埋。但二者所表現(xiàn)出來的總的熒光強度變化沒有呈現(xiàn)良好的規(guī)律性，且其變化與酶活力的相關(guān)性較小（圖5）。根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)分析，在其結(jié)構(gòu)中的212 個氨基酸內(nèi)，共有5 個Trp和18 個Tyr，共占氨基酸總數(shù)的10%，但其表現(xiàn)出來的最大熒光強度比未經(jīng)高壓處理的熒光強度提高122%。

2.3.2木瓜蛋白酶的外源性熒光光譜分析

圖7　228 nm波長激發(fā)不同高壓條件處理后木瓜蛋白酶的熒光光譜圖Fig.7　Fluorescence spectra of papain treated by different pressures at 37 ℃ for 20 min at excitement wavelength of 228 nm

木瓜蛋白酶經(jīng)不同壓力處理后，加入熒光探針ANS［24］，研究高壓對木瓜蛋白酶表面疏水性的影響。選擇228 nm波長處激發(fā)，其熒光光譜見圖7。228 nm波長處激發(fā)，不同超高壓處理的木瓜蛋白酶熒光強度與對照組（0.1 MPa）相比變化顯著（P＜0.05），說明高壓處理后木瓜蛋白酶內(nèi)疏水氨基酸的微環(huán)境發(fā)生了顯著變化。100～600 MPa處理后，其熒光強度呈先下降后增加的趨勢，說明在超高壓處理的過程中，疏水氨基酸有部分掩埋和暴露。在200 MPa時，疏水氨基酸熒光強度最?。? 023），比對照組（0.1 MPa）的熒光強度降低了52%。根據(jù)木瓜蛋白酶一級結(jié)構(gòu)，其中疏水性氨基酸共74 個，占所有氨基酸總數(shù)的34.9%。根據(jù)Lim［25］規(guī)則，在一級結(jié)構(gòu)中的第1～5，12～16，26～30，27～31，28～32，30～34，34～38，68～72，71～75，72～76，130～134，132～136，133～137，134～138，148～152，157～161，160～164和168～172位置極易在空間形成疏水結(jié)構(gòu)。推測不同高壓條件處理后，可能是上述位置的氨基酸微環(huán)境發(fā)生變化。研究其變化與酶活力的關(guān)系（圖5）發(fā)現(xiàn)，疏水性氨基酸的暴露程度與酶活力有很好的相關(guān)性，二者同時在200 MPa時達到極值，酶活力最大為20 411 U/g；熒光強度最小為2 023。因此，疏水氨基酸的暴露程度與酶活力大小有關(guān)。疏水氨基酸殘基的暴露程度越小，酶活力越大。

3　結(jié) 論

高壓會改變木瓜蛋白酶的二三級結(jié)構(gòu)，并影響其酶活力大小。其中，高壓后木瓜蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)呈波動性變化，但其變化與木瓜蛋白酶酶活力大小之間沒有顯著的相關(guān)性。對于木瓜蛋白酶的三級結(jié)構(gòu)，其表面疏水性氨基酸的暴露程度與木瓜蛋白酶酶活力大小具有一定的相關(guān)性，可能高壓處理所改變的疏水氨基酸的空間位置與酶活性中心的構(gòu)象有關(guān)，高壓后疏水氨基酸的暴露程度越小，酶活力越大。

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Effect of Ultra High Pressure Treatment on the Conformation and Enzyme Activity of Papain

LIU Ping， HU Zhihe*， WU Zijian， XUE Lu， WANG Fengling
（Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology， School of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce， Tianjin300134， China）

In order to examine the impact of ultra high pressure （UHP） on the enzyme activity and conformational change of papain， infrared spectroscopy and fluorescence spectroscopy were used to analyze structural and specific amino acid changes in UHP-treated papain. The results showed that compared with untreated sample， UHP treatments at various pressure had a significant effect on papain activity （P ＜ 0.05）. After being treated with 200 MPa， at 37 ℃ for 20 min， the activity of papain reached the maximum level， indicating a 6.8% increase compared with the untreated one. The infrared spectroscopic showed that there was a poor relationship between papain activity and conformation. The fluorescence spectroscopic analysis suggested that the exogenous fluorescence intensity of papain treated with 200 MPa at 37 ℃ for 20 min reached the minimum level （2 023） at an excitation wavelength of 228 nm. There was an excellent correlation between papain activity and fluorescence intensity. Therefore， papain activity was negatively related to the exposure degree of hydrophobic amino acids.

high-pressure technology； papain； enzyme activity； spatial conformation； infrared spectroscopy； fluorescence spectroscopy

Q71

A

1002-6630（2015）23-0023-05

10.7506/spkx1002-6630-201523005

2015-03-18

國家自然科學基金面上項目（31271841）；天津市高等學校創(chuàng)新團隊項目（TD12-5049）

劉平（1987—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：liuping0402@126.com

胡志和（1962—），男，教授，碩士，研究方向為專用功能食品。E-mail：hzhihe@tjcu.edu.cn