曲威等

摘要：為了獲得脂肪酶產(chǎn)生菌，進(jìn)而獲得高酶活菌株，試驗采集東營勝利油田被廢油長期污染的土壤，通過羅丹明B平板法進(jìn)行菌株分離篩選，并采用橄欖油乳化法測定脂肪酶酶活。經(jīng)16S rRNA鑒定，確定為銅綠假單胞菌屬，命名為Pseudomonas aeruginosa S8。并對該菌株的搖床培養(yǎng)產(chǎn)酶條件進(jìn)行了初步研究，采用單因素試驗和正交試驗對S8菌株產(chǎn)脂肪酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基與條件為葡萄糖8 g/L，酵母粉8 g/L，硫酸銨6 g/L，花生油 20 g/L，起始pH 7.0，接種量9%，溫度30 ℃，發(fā)酵培養(yǎng)時間72 h，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了出發(fā)菌株。

關(guān)鍵詞：脂肪酶；銅綠假單胞菌；篩選；鑒定；優(yōu)化

中圖分類號：TQ925+.6；Q556+.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）16-4002-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.044

Screening of Lipase-Producing Strain in Oil Field and Optimization

of the Lipase Producing Conditions

QU Wei，SHAO Lei，SONG Li-fen，XU Rong-xue

（Yantai Academy of China Agricultural University，Yantai 264670， Shandong. China）

Abstract：In order to obtain lipase-producing strain of the bacteria，thus obtain high activity strains，the strain was screened from long waste-oil-pollutedsoil near Shenglin oil field in Dongying through Rhodamine B plate method and the lipase activity was determined with olive oil emulsification method. A strain S8 producing lipase was screened， which was identified as Pseudomonas aeruginosa by the identification of 16S rRNA. The fermentation conditions of a lipase from S8 were determined by the single-factor experiment and orthogonal design. The result showed that the optimal medium composition for lipase production was as follows： glucose 8 g/L，yeast extract 8 g/L， （NH4）SO4 6 g/L， peanut oil 20 g/L. The optimal fermentation conditions were pH of 7.0， fermentation temperature of 30 ℃， inoculation amount of 9%， and fermentation time of 72 h， which provided foundation for the further study of lipase production fermentation.

Key words： lipase； pseudomonas aeruginosa； screening； identification； optimization

脂肪酶（lipase，EC 3.1.1.3）是一類廣泛存在于微生物和動植物細(xì)胞中的水解酶，能在油水界面催化甘油三酯生成甘油及脂肪酸[1]，因其在非水相條件下催化反應(yīng)可逆，可用于催化醇解、酯化和酯交換反應(yīng)[2]。生物來源的脂肪酶由于反應(yīng)條件緩和，對環(huán)境污染小，成本低，被廣泛應(yīng)用于食品、制革、飼料、洗滌和油脂水解等工業(yè)領(lǐng)域[3，4]，并且在生物柴油的制備、地溝油的回收利用等方面有不可替代的應(yīng)用價值[5]。

在自然界中，脂肪酶主要存在于動物胰臟、植物種子和微生物中，由于微生物種類多、繁殖快，并且所產(chǎn)生的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，比動物脂肪酶酶解作用的pH和溫度范圍更寬[6]，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品，因此微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源。

本研究從山東東營勝利油田附近被廢油長期污染的土壤中成功篩選出一株產(chǎn)脂肪酶效果較好的菌株，經(jīng)過鑒定，確定為銅綠假單胞菌，命名為Pseudomonas aeruginosa S8，并對其產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到該菌產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵條件，以期為脂肪酶的生產(chǎn)提供優(yōu)良酶源。

1 材料與方法

1.1 材料

土樣：采自東營勝利油田被廢油嚴(yán)重污染的土壤，共16份。

富集培養(yǎng)基：酵母粉2 g/L，橄欖油10 g/L，KH2PO4 3 g/L，Na2HPO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.0。

篩選培養(yǎng)基：酵母粉 2 g/L，橄欖油乳化液 20 g/L，（NH4）2SO4 2 g/L，NaCl 0.05 g/L，KH2PO4 0.15 g/L，Na2HPO4 0.35 g/L，瓊脂 2 g/L，羅丹明 B 0.005 g/L（過濾除菌），pH 7.0。

橄欖油與聚乙烯醇（體積分?jǐn)?shù)為2%）以1∶3（體積比）的比例混合，攪動乳化5 min，即成乳白色聚乙烯醇橄欖油乳化液[7]。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨2 g/L，葡萄糖 2 g/L，酵母粉 2 g/L，NaCl 3 g/L，K2HPO4 1 g/L，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨2 g/L，葡萄糖 2 g/L，（NH4）2SO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO4 1 g/L，pH 7.0。

碳源篩選培養(yǎng)基：酵母粉2 g/L，（NH4）2SO4 2 g/L，NaCl 0.05 g/L，KH2PO4 0.15 g/L，Na2HPO4 0.35 g/L，pH 7.0，分別加入蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、麥芽糖作為碳源。

氮源篩選培養(yǎng)基：葡萄糖 2 g/L，NaCl 0.05 g/L，KH2PO4 0.15 g/L，Na2HPO4 0.35 g/L，pH 7.0，分別加入酵母粉、蛋白胨、尿素、（NH4）2SO4、KNO3作為氮源。

1.2 試驗方法

1.2.1 產(chǎn)脂肪酶菌種篩選

1）富集培養(yǎng)。每種土樣稱量5.0 g，加入20 mL無菌水，振蕩制成土壤懸液。取每種土壤懸液各5 mL加入裝有30 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，將三角瓶置于30 ℃搖床振蕩培養(yǎng)3 d。富集3次。

2）初篩培養(yǎng)。將過濾滅菌的羅丹明B加入到已滅菌的初篩培養(yǎng)基中，倒平板。從富集培養(yǎng)的菌液中取1 mL菌液，用去離子水進(jìn)行系列梯度稀釋后涂布在平板中，30 ℃培養(yǎng)3 d后，在350 nm紫外光下觀察，產(chǎn)生脂肪酶的菌株周圍會出現(xiàn)熒光圈，且這種熒光圈越大，脂肪酶活越高。依據(jù)培養(yǎng)平板上形成的熒光圈大小進(jìn)行菌種篩選。

3）復(fù)篩培養(yǎng)。挑取初篩培養(yǎng)基上菌落周圍變色圈大的菌落劃線分純。分離出單菌落后斜面保存，將分純后的菌株轉(zhuǎn)接到裝有30 mL種子培養(yǎng)基的瓶中，30 ℃180 r/min培養(yǎng)24 h，然后以5% 的接種量將菌液加入到50 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃180 r/min培養(yǎng)72 h，離心得到上清液進(jìn)行酶活測定。

1.2.2 酶活的測定 脂肪酶酶活的測定采用經(jīng)典的聚乙烯醇橄欖油乳化液方法[8]。酶活力單位定義：30 ℃條件下，10 min油脂水解反應(yīng)，每分鐘催化脂肪水解產(chǎn)生1 μmol脂肪酸的脂肪酶量定義為一個脂肪酶國際單位（U/mL）。

1.2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定 菌株基因組DNA提取的方法參考文獻(xiàn)[9]。16S rRNA PCR引物序列為F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R：5′- GGTTACCTTGTTACGACTT -3[引物由上生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。PCR擴增體系（50 μL）：2 × PCR Taq M 25 μL；引物F（10 μmol/L）2 μL；引物R （10 μmol/L）2 μL；DNA模板4 μL；ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)體系為：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，并將測得的序列拼接完成后登陸到NCBI BLAST中進(jìn)行同源性比對。

1.2.4 產(chǎn)酶條件參數(shù)優(yōu)化 設(shè)計單因素試驗，分別以培養(yǎng)基中的碳源、氮源、誘導(dǎo)劑和發(fā)酵條件中的溫度、初始pH、接種量、發(fā)酵時間為因素，考察發(fā)酵條件對產(chǎn)酶的影響，選擇對產(chǎn)脂肪酶菌株影響較大的5個因素，對其進(jìn)行5因素4水平的正交試驗（表1），選擇其最優(yōu)的組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

利用富集培養(yǎng)從被廢油長期污染的16份土樣中分離篩選得到87株能在初篩培養(yǎng)基中生長、有羅丹明B反應(yīng)的菌株，挑取變色圈直徑與菌落直徑之比（Hc）大于1的28株菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，通過測定脂肪酶活，最終篩選到胞外脂肪酶活較高的8個菌株（表2），大部分初篩得到的菌株脂肪酶酶活較低，而菌株S8的初始酶活可達(dá)到10.56 U/mL，遠(yuǎn)高于其他菌株，有很好的研究價值。

2.2 產(chǎn)脂肪酶菌S8的分子生物學(xué)鑒定

對菌株S8進(jìn)行16S rRNA分子鑒定，采用通用引物進(jìn)行PCR擴增后，獲得約1.4 kb的片段。將測序得到的序列提交至GenBank獲得登錄號：KM925079，通過BLAST與NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫中已報道序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果顯示菌株S8與銅綠假單胞菌屬（Pseudomonas aeruginosa）親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)到99%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 碳源對菌株S8產(chǎn)脂肪酶的影響 碳源是微生物生長的重要成分，對菌體的代謝產(chǎn)酶有重要影響。將菌株S8在添加濃度為0.2%的不同碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別測定發(fā)酵液脂肪酶酶活（圖2）。由圖2可知，以麥芽糖和葡萄糖為碳源時該菌株產(chǎn)酶能力較高，由于成本問題，選用葡萄糖作為最佳碳源。

2.3.2 氮源對菌株S8產(chǎn)脂肪酶的影響 以葡萄糖為碳源，將菌株S8在添加0.2%的不同氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別測定發(fā)酵液脂肪酶酶活（圖3）。由圖3可知，菌株在5種氮源發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)脂肪酶酶活大小依次為酵母粉>蛋白胨>硫酸銨>尿素>硝酸鉀，表明菌株S8對有機氮的利用優(yōu)于無機氮，對銨態(tài)氮的利用優(yōu)于硝態(tài)氮。因此，菌株S8的最佳有機氮源為酵母粉，無機氮源為硫酸銨。

2.3.3 誘導(dǎo)物對菌株S8產(chǎn)脂肪酶的影響 由于大多數(shù)水解酶類是誘導(dǎo)酶，很多微生物產(chǎn)生的脂肪酶也多屬于誘導(dǎo)酶，因此在上述碳源和氮源的基礎(chǔ)上添加20 g/L的不同種類的油脂作為脂肪酶的誘導(dǎo)劑，以考察油脂是否能有效的促進(jìn)菌株S8產(chǎn)脂肪酶。由圖4可知，20 g/L的橄欖油對菌株產(chǎn)酶最有利，最大酶活可以達(dá)到19.02 U/mL，而花生油的誘導(dǎo)效果僅次于橄欖油，從生產(chǎn)成本以及購買途徑上考慮，選擇花生油作為菌株S8產(chǎn)脂肪酶的誘導(dǎo)物。

2.3.4 發(fā)酵溫度對菌株S8產(chǎn)脂肪酶的影響 培養(yǎng)溫度對發(fā)酵來說是極其重要的，溫度對菌體的生長和脂肪酶的產(chǎn)生的影響是各種因素的綜合表現(xiàn)。調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度分別為20、25、30、35、40 ℃，研究不同發(fā)酵溫度對菌株S8發(fā)酵產(chǎn)酶能力的影響（圖5）。由圖5可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，脂肪酶的酶活增大，當(dāng)溫度達(dá)到30 ℃時，脂肪酶酶活最大，超過30 ℃酶活有所下降。因此，適宜菌株S8產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.3.5 初始pH對菌株S8產(chǎn)脂肪酶的影響 發(fā)酵培養(yǎng)基起始pH對微生物生長有著密切的關(guān)系，用稀鹽酸或稀氫氧化鈉將發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)至不同的pH，發(fā)酵培養(yǎng)后測定脂肪酶酶活，結(jié)果表明，初始pH控制在6.0～7.5較為合適，當(dāng)pH在7.0時效果最佳（圖6）。

2.3.6 接種量對菌株S8產(chǎn)脂肪酶的影響 將發(fā)酵培養(yǎng)基稀釋至107個/mL，按發(fā)酵液體積的4%、6%、8%、10%、12%和14%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵結(jié)束后測定脂肪酶酶活（圖7）。由圖7可知，脂肪酶的酶活以10%接種量為最大，這是因為過高接種量使接種的細(xì)胞數(shù)目增多，發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)相對不足，細(xì)胞的生長受到抑制，影響了脂肪酶的產(chǎn)生。

2.3.7 發(fā)酵時間對菌株S8產(chǎn)脂肪酶的影響 在以葡萄糖為碳源、酵母粉和硫酸銨為氮源、花生油為誘導(dǎo)物、初始pH為7.0、接種量為10%、發(fā)酵溫度為30 ℃的條件下進(jìn)行發(fā)酵，分別于24、48、72、96、120 h取發(fā)酵液測定脂肪酶酶活（圖8）。由圖8可知，發(fā)酵時間為72 h時，脂肪酶酶活最大，可達(dá)到26.2 U/mL。之后發(fā)酵時間再增加，由于菌體密度不斷增大，發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分減少，發(fā)酵代謝產(chǎn)物增多，菌株生長進(jìn)入平穩(wěn)期，不利于脂肪酶的產(chǎn)生，因此，選擇發(fā)酵時間為72 h。

2.4 正交試驗優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取碳源葡萄糖、有機氮源酵母粉、無機氮源硫酸銨、溫度和接種量5個因素，每個因素4個水平進(jìn)行正交試驗，以獲得最有利菌株S8產(chǎn)脂肪酶的發(fā)酵參數(shù)。由正交試驗結(jié)果（表3）可知，不同的試驗因子對菌株S8發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶影響次序為葡萄糖>酵母粉>硫酸銨>接種量>溫度，最佳的發(fā)酵培養(yǎng)條件為葡萄糖8 g/L、酵母粉8 g/L、硫酸銨6 g/L、溫度為30 ℃、接種量為9.0%。

3 小結(jié)與討論

近年來，由于石化能源的儲量逐年減少以及造成的污染日益嚴(yán)重，可再生能源受到人們的關(guān)注，尤其生物柴油以其低排放、可直接用于現(xiàn)有柴油機、無需進(jìn)行結(jié)構(gòu)的改造而備受青睞[10]，目前生產(chǎn)生物柴油的方法很多，但用生物酶催化合成生物柴油具有反應(yīng)條件溫和、醇用量小、后處理簡單、無污染物排放，并且原料油中的FFA能完全轉(zhuǎn)化成甲酯等優(yōu)點[11]。利用脂肪酶生產(chǎn)生物柴油在國內(nèi)還處于初步研究階段，而國外一些國家已經(jīng)形成規(guī)模生產(chǎn)[12，13]。

本研究從東營勝利油田附近的土壤中成功分離出一株脂肪酶產(chǎn)生菌，經(jīng)16S rRNA序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定，確定為銅綠假單胞菌，命名為Pseudomonas aeruginosa S8。利用單因素和正交試驗方法確定了產(chǎn)脂肪酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖8 g/L、 酵母粉8 g/L、硫酸銨6 g/L，以花生油為誘導(dǎo)物；最佳發(fā)酵條件為起始pH 7.0、接種量9%、溫度30 ℃、發(fā)酵時間72 h。通過篩選得到的脂肪酶菌株可作為今后工業(yè)化生產(chǎn)的出發(fā)菌株，并為脂肪酶基因的克隆、工程菌的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

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