盧順等

摘要：為分析鴨胚腎細(xì)胞用于鴨肝炎病毒增殖的可能性，從鴨胚腎細(xì)胞的制備、體外培養(yǎng)、鴨肝炎弱毒在鴨胚腎細(xì)胞中的增殖等方面入手，初步分析了鴨胚腎細(xì)胞體外培養(yǎng)和用于鴨肝炎病毒增殖的可行性。結(jié)果表明，鴨胚腎細(xì)胞能夠體外培養(yǎng)并形成良好的細(xì)胞單層，形態(tài)多為多邊形或梭形；原代鴨胚腎細(xì)胞可以用于增殖鴨肝炎弱毒A66株，毒價（ELD50）達10-4.2/0.2 mL。說明鴨胚腎細(xì)胞適合用于鴨肝炎病毒的增殖，有望用于鴨肝炎病毒疫苗的生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：鴨胚腎細(xì)胞；體外培養(yǎng)；鴨肝炎弱毒

中圖分類號：S852.65；S858.32 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）16-3983-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.038

Proliferation of Attenuated Duck Hepatitis Virus in Duck Embryo Kidney Cells

LU Shun， GAO Qi-shuang，LIU Wu，CHEN Zhi-hua，ZHOU Li，ZHAN Cai-yao，TONG WEI-wen，

TAO Bi-fei，XIA Yu，WANG Lian-fang，HUA Juan

（Wuhan Institute of Animal and Veterinary Science， Wuhan 430208， China）

Abstruct：In this study the possibility of proliferation of duck hepatitis virus in duck embryo kidney cell were analyzed through the preparation of duck embryo kidney cell， cultured in vitro and the proliferation of duck hepatitis virus in the cell. The results showed that duck embryo kidney cell could be cultured in vitro； most of the cells were polygonal or fusiform. Duck embryo kidney cell could be used in proliferation of attenuated duck hepatitis virus A66， and the virus titer could reach 10-4.2/0.2 ml （ELD50）. It indicated that duck embryo kidney cell was suitable for duck hepatitis virus proliferation and might be used to produce vaccines.

Key words：duck embryo kidney cell； in vitro cultivation； attenuated duck hepatitis virus

近年來，鴨病毒性肝炎在中國水禽養(yǎng)殖區(qū)廣泛流行，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的威脅。鴨病毒性肝炎由鴨肝炎病毒（DHV）引起，主要危害3周齡以內(nèi)的雛鴨，病死率可達100%[1]。已報道的鴨肝炎病毒有3個血清型，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。中國已發(fā)現(xiàn)Ⅰ型和Ⅲ型鴨肝炎病毒，其中流行的主要是Ⅰ型[2]。目前尚無治療鴨病毒性肝炎的特效藥物，接種鴨肝炎疫苗是預(yù)防和控制該病的最經(jīng)濟且行之有效的方法。

在國內(nèi)，鴨肝炎疫苗的生產(chǎn)還主要依靠傳統(tǒng)的雞胚培養(yǎng)技術(shù)[3]，使用細(xì)胞生產(chǎn)鴨肝炎病毒疫苗尚處在研究階段，暫時還沒有細(xì)胞源的鴨肝炎病毒疫苗上市銷售。相比雞胚培養(yǎng)技術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)病毒具有周期短、質(zhì)量易控制和抗原純度高等優(yōu)點[4]，因此使用細(xì)胞生產(chǎn)鴨肝炎病毒疫苗是未來的發(fā)展方向。這也使得尋找適合培養(yǎng)鴨肝炎病毒的細(xì)胞成為研究的熱點。目前，已報道用于培養(yǎng)鴨肝炎病毒的細(xì)胞系主要是雞胚或鴨胚成纖維細(xì)胞系，關(guān)于其他細(xì)胞的研究較少。因此，尋找新的適合于鴨肝炎病毒增殖的細(xì)胞，能為鴨肝炎病毒及其疫苗的研究工作提供新的細(xì)胞材料。本研究旨在探索鴨胚腎細(xì)胞用于鴨肝炎病毒增殖的可能性，為鴨肝炎病毒的研究和疫苗生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基及主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（粉劑）和胎牛血清購自GIBCO公司；雙抗（青霉素、鏈霉素混合液，100×）、胰蛋白酶購自Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 毒株、鴨胚和雞胚

鴨肝炎病毒弱毒A66株（疫苗毒株）購自南京天邦生物科技有限公司；12日齡鴨胚（江漢鴨）購自武漢市春江禽業(yè)有限責(zé)任公司；SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制 細(xì)胞培養(yǎng)基配制：DMEM培養(yǎng)基按說明書配制，0.22 μm濾膜過濾除菌，4 ℃保存?zhèn)溆?。臨用前加入15%胎牛血清和1%雙抗配制成工作液。細(xì)胞消化液配制：取胰蛋白酶粉劑，用PBS配制成0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA的細(xì)胞消化液，0.22 μm過濾除菌，分裝于10 mL小瓶，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 鴨胚腎細(xì)胞的制備 取12日齡的鴨胚，在無菌環(huán)境中打開氣室取出胚胎，立即放入盛有無菌PBS（含2%的雙抗）的平皿中，漂洗數(shù)次。將胚胎放入新的平皿中，剪開腹部，取出腎，置于另一無菌平皿中，PBS漂洗2次。用眼科剪將腎組織剪成糜狀，加入2 mL 細(xì)胞消化液于37 ℃消化15 min。加入細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)，離心收集細(xì)胞。細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸，反復(fù)吹打制備成細(xì)胞懸液，分裝于100 mL規(guī)格的細(xì)胞瓶中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)。

1.3.3 鴨胚腎細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 3 d后原代細(xì)胞貼滿細(xì)胞瓶底，棄去培養(yǎng)上清液，更換新的培養(yǎng)液。再次培養(yǎng)3 d后，用細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。將消化好的細(xì)胞用培養(yǎng)基重懸，輕輕吹打使之分散。重懸的細(xì)胞在原細(xì)胞瓶中靜置培養(yǎng)。細(xì)胞長滿瓶底后，再次用消化液消化細(xì)胞，按1∶2的比例（1瓶內(nèi)的細(xì)胞分裝到2個細(xì)胞瓶內(nèi)）進行傳代培養(yǎng)。之后每當(dāng)細(xì)胞長滿單層，即進行傳代。

1.3.4 鴨肝炎弱毒在鴨胚腎細(xì)胞中的增殖 待鴨胚腎細(xì)胞長成單層，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞1次，接種2 mL鴨肝炎病毒液（200 ELD50/mL），置培養(yǎng)箱37 ℃吸附1 h，棄去多余的病毒液，加入37 ℃ 預(yù)溫的細(xì)胞維持液（含1%胎牛血清的DMEM），置37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，逐日鏡檢，觀察細(xì)胞變化。收獲每次接毒的細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，離心收集上清液，棄去沉淀。按照常規(guī)方法進行連續(xù)傳代，觀察細(xì)胞接毒后是否發(fā)生病變。

1.3.5 鴨肝炎病毒毒價的測定 取接毒的細(xì)胞培養(yǎng)物，用Hank′s液10倍倍比稀釋，每個稀釋度經(jīng)尿囊腔接種雞胚4枚，0.2 mL/枚，記錄雞胚死亡情況，按Reed-Muench方法[5]計算雞胚半數(shù)致死量（ELD50 ）。

1.3.6 病毒在鴨胚腎細(xì)胞上的生長曲線 收集接毒后12、24、36、48、60、72 h的細(xì)胞培養(yǎng)物，凍融3次后，按上述方法接種SPF雞胚，測定細(xì)胞培養(yǎng)物的ELD50，根據(jù)病毒滴度繪制生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨胚腎細(xì)胞的生長情況

原代的鴨胚腎細(xì)胞靜置培養(yǎng)到第二天時，可看到大部分細(xì)胞已貼壁生長，從形態(tài)上看主要是多邊形和梭形。對細(xì)胞進行換液后繼續(xù)培養(yǎng)至第六天，細(xì)胞形成單層，排列緊密，具有典型的上皮細(xì)胞特征（圖1）。細(xì)胞傳至第四代時，大部分細(xì)胞逐漸死亡。存活下來的細(xì)胞經(jīng)數(shù)次傳代后，生長速度逐漸變快，傳代后3 d即可形成細(xì)胞單層。

2.2 DHV在鴨胚腎細(xì)胞上致細(xì)胞病變情況

將DHV弱毒接種在鴨胚腎細(xì)胞單層上，傳至第三代時出現(xiàn)細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓、脫落（圖2）。對照組細(xì)胞無明顯病變。

2.3 DHV在鴨胚腎細(xì)胞培養(yǎng)物中的毒價

按Reed-Muench法計算收獲的病毒培養(yǎng)物的毒價（ELD50），結(jié)果前3代病毒培養(yǎng)物的毒價分別為10-3.6/0.2 mL、10-4.2/0.2 mL和10-4.2/0.2 mL。

2.4 DHV在鴨胚腎細(xì)胞中的增殖曲線

鴨胚腎細(xì)胞接毒后，收集不同時間的細(xì)胞培養(yǎng)物，接種SPF級雞胚測定ELD50。結(jié)果顯示接毒36 h后毒價能達到峰值（圖3）。

3 小結(jié)與討論

目前，鴨肝炎病毒的培養(yǎng)主要采用SPF雞胚接種，該方法需要耗用大量的優(yōu)質(zhì)雞胚。SPF雞胚的來源十分有限，不能隨時獲得，質(zhì)量也難以控制[6]，使用受到一定限制。此外，利用雞胚生產(chǎn)鴨肝炎病毒疫苗，在處理廢棄的雞胚殘體時只能采用焚燒或其他無害化的處理方法，對環(huán)境有一定的污染。相比之下，細(xì)胞培養(yǎng)病毒具有周期短、質(zhì)量易控制、抗原性好和環(huán)保等優(yōu)點。為此，本試驗研究了鴨胚腎細(xì)胞用于增殖鴨肝炎病毒的可能性，為開展鴨肝炎病毒的相關(guān)基礎(chǔ)研究提供了參考。

本研究制備了鴨胚腎細(xì)胞，研究了鴨肝炎病毒在該細(xì)胞中的增殖特性。結(jié)果表明，鴨肝炎病毒可以適應(yīng)鴨胚腎細(xì)胞，3次傳代后產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，培養(yǎng)物的病毒滴度可達10-4.2/0.2 mL（ELD50）。用鴨胚腎細(xì)胞增殖鴨肝炎病毒比使用雞胚或鴨胚增殖病毒更便捷、易行，為開展鴨肝炎病毒分子生物學(xué)研究提供了便利。研究中還發(fā)現(xiàn)，原代鴨胚腎細(xì)胞在體外傳3代后，大部分細(xì)胞逐漸死亡，這與許靜等[7]報道的鴨胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)相似。少數(shù)存活的細(xì)胞能逐漸適應(yīng)傳代培養(yǎng)。如能將這些細(xì)胞建立成永生性的細(xì)胞系，則能為鴨肝炎病毒等病原的生物學(xué)研究及其細(xì)胞疫苗的研發(fā)提供細(xì)胞資源。

國內(nèi)外的研究表明，Ⅰ型鴨肝炎病毒能在鴨胚成纖維細(xì)胞、雞胚成纖維細(xì)胞和鴨胚肝細(xì)胞上增殖，且部分毒株經(jīng)傳代適應(yīng)后能引起細(xì)胞病變。吳培福等[8]報道鴨肝炎病毒S株能引起鴨胚肝細(xì)胞病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞萎縮、變圓和細(xì)胞脫落，但不同毒株致細(xì)胞病變的能力有差異，這可能與毒株的毒力以及鴨的品種有關(guān)。張小飛等[9]報道鴨肝炎病毒A66株能在雞胚成纖維細(xì)胞上增殖，且能產(chǎn)生細(xì)胞病變。付玉志等[10]報道鴨肝炎病毒野毒株ZJ-08能在鴨胚成纖維細(xì)胞中增殖，并導(dǎo)致典型的細(xì)胞病變。本試驗中觀察到鴨肝炎病毒在江漢鴨的腎細(xì)胞上能引起病變，但第一代病變不明顯。雞胚半數(shù)致死試驗表明，鴨肝炎病毒在鴨胚腎細(xì)胞上傳代后仍能致死SPF雞胚。本研究證實，鴨肝炎病毒弱毒能在鴨胚腎細(xì)胞中增殖，這為鴨肝炎病毒及其細(xì)胞源疫苗的研究提供了理論基礎(chǔ)。

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[10] 付玉志，張洪輝，李傳峰，等.Ⅰ型鴨肝炎病毒在鴨胚成纖維細(xì)胞系中的增殖特性研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2013，35（2）：110-113.