劉慧梅 顏學(xué)兵

[摘要] 目的 評價(jià)利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)（Xpert MTB/RIF）實(shí)驗(yàn)在結(jié)核病診斷中的檢驗(yàn)效能。 方法 收集2014年10月～2015年5月徐州市傳染病醫(yī)院的237例可疑結(jié)核病患者進(jìn)行結(jié)核菌檢測，將患者分為結(jié)核組和非結(jié)核組，其中結(jié)核組195例，非結(jié)核組42例。兩組患者均行Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)、T-spot實(shí)驗(yàn)、涂片鏡檢法、液體培養(yǎng)以及藥敏實(shí)驗(yàn)，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，比較各項(xiàng)檢測的敏感性和特異性。 結(jié)果 以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)核分枝桿菌敏感性為56.9%，T-spot實(shí)驗(yàn)、痰涂片、液體培養(yǎng)敏感性依次為53.8%、26.7%、43.6%，Xpert MTB/RIF檢測敏感性明顯高于涂片鏡檢（χ2=36.691，P = 0.000）和液體培養(yǎng)（χ2=6.934，P = 0.008），但與T-spot實(shí)驗(yàn)無差別（χ2=0.347，P = 0.541）。以傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)檢測利福平耐藥的敏感性和特異性分別為88.9%和98.5%。 結(jié)論 Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)較傳統(tǒng)的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法具有較好的敏感性和特異性，可作為結(jié)核病診斷的輔助手段。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核；利福平；利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)

[中圖分類號] R521 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）10（a）-0116-04

Application of Xpert MTB/RIF detection test in the diagnosis of tuberculosis

LIU Huimei1，2 YAN Xuebing3

1.Department of Medicine， Xuzhou Medical College， Jiangsu Province， Xuzhou 221000， China； 2.Department of Tuberculosis， Xuzhou Infectious Diseases Hospital， Jiangsu Province， Xuzhou 221000， China； 3.Department of Infectious Diseases， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College 221000， China

[Abstract] Objective To analyze the application value of Tuberculosis and rifampin resistance detection of Xpert MTB/RIF test. Methods From October 2014 to May 2015， 237 patients suspected tuberculosis in Xuzhou Infectious Diseases Hospital were selected， and they were divided into tuberculosis group （195 cases） and non-tuberculosis group（42 cases）. sputum samples of patients in two groups were collected to do liquid culture， smear， T-spot test， smear observed of lens and Xpert MTB/RIF test， clinical diagnosis was as the gold standard， sensitivity and specificity of every methods were ompared. Results The sensitivity of Xpert MTB/RIF， T-spot test， smear， liquid culture on testing Mycobacteria tuberculosis were 56.9%， 53.8%， 26.7%， 43.6% by clinical diagnosis as gold standard. The sensitivity of Xpert MTB/RIF was higher than smear （χ2=36.691，P = 0.000） and liquid culture （χ2=6.934， P = 0.008）， but there was no difference with T-spot test （χ2=0.347， P = 0.541）. According to the result of drug susceptibility test， the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF on testing rifampin resistance were 88.9% and 98.5%. Conclusion Comparing with traditional methods， Xpert MTB/RIF test has higher sensitivity and specificity and rifampin resistance. It can be applied as the auxiliary means for tuberculosis diagnosis.

[Key words] Tuberculosis； Rifampin； Xpert MTB/RIF

結(jié)核病的有效控制關(guān)鍵在于對結(jié)核患者的快速檢測及治療。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法存在諸多不足，如抗酸菌涂片鏡檢方法操作簡便、快速、特異、經(jīng)濟(jì)，但靈敏性較低[1-2]；固體培養(yǎng)法價(jià)格較低廉，敏感性較涂片鏡檢法高，但耗時(shí)達(dá)數(shù)周；液體培養(yǎng)法雖然可以提高敏感度、縮短報(bào)告時(shí)間，但經(jīng)濟(jì)成本非常高[3-4]。因此尋找一種可以快速診斷結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室方法顯得非常重要[5]。近年來，利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)（Xpert MTB/RIF）實(shí)驗(yàn)逐漸受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。該檢測方法國內(nèi)臨床應(yīng)用剛剛起步，缺乏對其診斷性能的報(bào)道。本研究旨在對Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)與T-spot實(shí)驗(yàn)等檢測方法在結(jié)核病診斷中的臨床價(jià)值進(jìn)行對比研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年10月～2015年5月徐州市傳染病醫(yī)院結(jié)核科收治的237例患者，分為結(jié)核組和非結(jié)核組，分別為195例和42例，診斷均符合中華結(jié)核病診治指南診斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)核組包括：肺結(jié)核組160例，男77例，女83例，年齡5～78歲；肺外結(jié)核組35例，男22例，女13例，年齡3～72歲，主要包括結(jié)核性腹膜炎10例、結(jié)核性腦膜炎3例、骨結(jié)核3例、淋巴結(jié)核6例、腸結(jié)核7例、腎結(jié)核3例、女性生殖系統(tǒng)結(jié)核3例。非結(jié)核組42例，主要是肺炎、肺癌等患者，男26例，女16例，年齡22～83歲。

1.2 方法

囑咐患者清晨嗽口后用力咳出深部濃痰，一式3份，一份用于結(jié)核分枝桿菌（MTB）培養(yǎng)，一份用于痰涂片檢查，一份用于XpertMTB/RIF檢測。標(biāo)本收集的注意事項(xiàng)：①痰液標(biāo)本收集以清晨為最佳，因?yàn)樵摃r(shí)間段患者痰量多，含菌量多；②在醫(yī)生或護(hù)士指導(dǎo)下取樣，不得私自取樣；③囑咐患者漱口3遍以上，以除去淺表固有細(xì)菌。如果患者昏迷或無力咳嗽，不宜收集樣本，醫(yī)護(hù)人員應(yīng)該協(xié)助患者采取合適體位，叩背以使痰液松動，再用吸痰器吸引，在吸痰器吸管中段搜集痰液，按吸痰法將痰液吸入集痰器內(nèi)。

1.3 結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)（T-spot）、液體培養(yǎng)、Xpert MTB/RIF及藥敏實(shí)驗(yàn)

T-spot實(shí)驗(yàn)：采集肝素抗凝外周血5 mL，分離外周單個核細(xì)胞（PBMC）放入包被γ-INF抗體的微孔板，加入結(jié)核特異性抗原早期分泌靶向抗原（early secreting antigen target 6，ESAT-6）和培養(yǎng)濾過蛋白（culture filtrate protein 10，CFP-10）作為刺激原，溫箱培養(yǎng)24 h后，洗去抗原致敏效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，加入生物素標(biāo)記的二抗，再經(jīng)酶聯(lián)顯色，在細(xì)胞因子分泌的地方形成斑點(diǎn)，通過記錄斑點(diǎn)讀數(shù)檢測結(jié)核特異抗原致敏效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果判定：當(dāng)空白對照孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)為0～5個時(shí)，任一實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)減去空白孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個，結(jié)果為陽性；如果空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)>6個時(shí)，任一實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)≥空白孔斑點(diǎn)數(shù)的2倍，結(jié)果同樣表明陽性結(jié)果；如果上述標(biāo)準(zhǔn)不符合且陽性質(zhì)控對照孔正常時(shí)，檢測結(jié)果為陰性。

液體培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)：在Ⅱ級生物安全操作柜中接種環(huán)刮取菌落，涂抹至羅氏培養(yǎng)基斜面，旋緊螺旋蓋，在渦旋振蕩器上振蕩10～20 s，制成均勻的菌液。靜置10 min后，用吸管接種約0.1 mL至中性羅氏培養(yǎng)及斜面上。傳代后的培養(yǎng)基放置在36℃培養(yǎng)，每周觀察菌落生長情況，于肉眼可見菌落出現(xiàn)后1～2周進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。制備菌液：在磨菌瓶中加入1～2滴10%吐溫-80℃水溶液，用無菌吸管尖端刮取2～3周新鮮菌落，置于磨菌瓶中。旋緊瓶蓋，在渦旋振蕩器上振蕩10～20 s。靜置5 min，小心打開瓶蓋，加入約2 mL滅菌生理鹽水，靜置片刻，使菌液中的大塊物質(zhì)沉淀。用無菌吸管吸取上部的菌液，約1 mL，轉(zhuǎn)移到另一無菌試管中，與標(biāo)準(zhǔn)買時(shí)比濁管比濁。逐漸滴加滅菌生理鹽水，直至菌液濁與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁芤恢?，即得? mg/mL的菌液。接種：在無菌帶有螺旋蓋的試管中以無菌手法加入2mL滅菌生理鹽水備用，每株待測菌準(zhǔn)備2管。菌液靜置，帶顆?；蚓鷫K沉淀。用22 SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)2滿環(huán)1 mg/mL的菌液，平移至2 mL滅菌生理鹽水中，即稀釋成1×10-2 mg/mL菌液。用同樣方法再進(jìn)行100倍稀釋，即成1×10-4 mg/mL菌液。用22 SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)分別取1滿環(huán)1×10-2 mg/mL和1×10-4 mg/mL的菌液，用劃線法均勻接種菌量為1×10-4 mg和1×10-6 mg。接種后的培養(yǎng)基直立放置于恒溫培養(yǎng)內(nèi)，36℃培養(yǎng)，培養(yǎng)4周后報(bào)告結(jié)果。

標(biāo)本符合以下特點(diǎn)可直接用于藥敏試驗(yàn)：①出現(xiàn)肉眼可見菌落后1～2周的新鮮菌落；②沒有其他污染菌共存；③涂片確認(rèn)為抗酸菌。

Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)：以1：2的比例，往痰液標(biāo)本中加入處理液，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩15～30 s，室溫靜置15 min，使痰標(biāo)本充分液化。再將混合液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)盒中，將反應(yīng)試劑盒放入Gene Xpert儀器（美國Cepheid公司生產(chǎn)）中，按說明書進(jìn)行檢測，約2 h即可讀取結(jié)果。結(jié)果判斷：依照探針的循環(huán)閾值（Ct值），當(dāng)內(nèi)對照探針Ct值≤38時(shí)為陽性，反之則為無效，提示標(biāo)本的DNA提取不合格或含有PCR抑制物。5個探針中至少2個探針Ct值≤38即為檢測到MTB，可進(jìn)一步按照Ct值對MTB進(jìn)行半定量。Ct值<16為高含量，Ct值為16～22為中等含量，Ct值為22～28為低含量，Ct值>28為極低含量。檢測利福平耐藥的基礎(chǔ)在于MTB特異性分子信標(biāo)早期Ct值和晚期Ct值之差。即△Ct值。系統(tǒng)設(shè)置的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為△Ct>3.5提示對利福平耐藥，△Ct<3.5提示對利福平敏感。由于終止循環(huán)數(shù)為38個循環(huán)，因此當(dāng)早期探針Ct值>34.5或晚期探針Ct值>38時(shí)，利福平耐藥結(jié)果為不確定。目前研究表明95%的利福平耐藥菌株在rpoB基因81 bp區(qū)域（RRDR）存在基因突變。

1.4 結(jié)果判定

1.4.1 痰涂片結(jié)果判定 按照中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會制訂的實(shí)驗(yàn)室檢查規(guī)程進(jìn)行[6-7]。①抗酸桿菌陰性（-）：連續(xù)觀察300個不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌。②報(bào)告抗酸桿菌菌素：1～8條/300個視野。③抗酸桿菌陽性（+）：每100個視野發(fā)現(xiàn)3～9條抗酸桿菌。④抗酸桿菌陽性（++）：每10個視野發(fā)現(xiàn)1～9條抗酸桿菌。⑤抗酸桿菌陽性（+++）：每個視野發(fā)現(xiàn)1～9條抗酸桿菌。⑥抗酸桿菌陽性（++++）：每個視野發(fā)現(xiàn)平均10條抗酸桿菌。

1.4.2 藥敏結(jié)果判定 （-）：無菌落生長；報(bào)告實(shí)際菌落數(shù)：<50個菌落；（+）：50～100個菌落；（++）：100～200個菌落；（+++）：大部分融合（200～500個菌落）；（++++）：融合（>500個菌落）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。Kappa>0.4，表示兩種實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)一致性結(jié)果較好；Kappa<0.4，表示檢驗(yàn)結(jié)果一致性較差。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)與其他結(jié)核檢測方法的結(jié)果比較

結(jié)核組患者Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)檢測敏感性顯著高于液體培養(yǎng)（χ2=36.691，P = 0.000）和痰涂片（χ2=6.934，P = 0.008），與T-spot比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.347，P = 0.541）。非結(jié)核組4種方法特異性均較高且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.346、0.346、1.012， P = 0.557、0.557、0.314）。基于入組情況將患者分為肺結(jié)核、肺外結(jié)核進(jìn)行分析，4種檢測方法均表明肺結(jié)核組結(jié)核分枝桿菌檢測敏感性（Xpert MTB/RIF、T-spot痰涂片、液體培養(yǎng)）明顯高于肺外結(jié)核組（χ2=8.915、5.880、7.142、7.457，P = 0.003、0.015、0.008、0.006）。見表1。

表1 結(jié)核敏感性及非結(jié)核特異性比較[n（%）]

注：與本組Xpert MIB/RIF比較，*P < 0.01；與肺結(jié)核組比較，△P < 0.05，△P < 0.05；敏感性（結(jié)核組）=結(jié)核組陽性例數(shù)/結(jié)核組總例數(shù)×100%；特異性（非結(jié)核組）=非結(jié)核組陰性例數(shù)/非結(jié)核組總例數(shù)×100%

2.2 Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)與其他幾種檢測結(jié)果一致性的比較

Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)與T-spot實(shí)驗(yàn)檢出結(jié)果符合率為86.9%，一致性Kappa=0.737，一致性結(jié)果較好；Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)與痰涂片檢出結(jié)果符合率為61.2%，一致性Kappa=0.200，一致性結(jié)果較差；Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)與液體培養(yǎng)檢測結(jié)果符合率為78.5%，一致性Kappa=0.563，一致性結(jié)果較好。見表2。

表2 Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)與痰涂片和液體培養(yǎng)檢測結(jié)果一致性的比較（例，n=237）

2.3利福平耐藥檢測結(jié)果

在237例可疑結(jié)核患者中，液體培養(yǎng)陽性有85例，9例Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)檢測失敗，共76例可進(jìn)行利福平耐藥檢測效能分析。傳統(tǒng)比例法藥敏實(shí)驗(yàn)檢測出耐藥菌9株，耐藥率為11.8%（9/76）。比例法耐藥的的患者標(biāo)本中，XpertX系統(tǒng)檢測出8株為耐藥菌，敏感性為88.9%，比例法藥敏實(shí)驗(yàn)檢測敏感菌67例中，有1例Xpert系統(tǒng)檢測出為耐藥菌，特異性為98.5%（66/67）。見表3。

表3 利福平耐藥檢測結(jié)果（例，n=76）

3 討論

我國是世界上22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核病患者數(shù)量約500萬例，居世界第二位，每年新增患者130萬，死亡病例約13萬例[8-11]。《2011年中國衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)年鑒》資料顯示，在甲乙類法定報(bào)告?zhèn)魅静≈?，我國現(xiàn)階段結(jié)核病發(fā)病率為74.27/10萬，僅次于病毒性肝炎，位居第二，其死亡率為0.22/10萬，僅次于艾滋病，亦位居第二，而且發(fā)病人群以青壯年為主[12]。結(jié)核病的疫情控制與結(jié)核病的早期發(fā)現(xiàn)、合理規(guī)范治療、管理密切相關(guān)。盡管結(jié)核病的診斷水平有了很大提高，但傳統(tǒng)的結(jié)核病診斷方法依舊存在很多不足之處，嚴(yán)重影響結(jié)核病的診斷工作開展。Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)是針對結(jié)核分枝桿菌rpoB基因利福平耐藥決定區(qū)設(shè)計(jì)引物、探針，檢測其是否發(fā)生突變[13-14]，2 h內(nèi)即可診斷患者是否感染結(jié)核分枝桿菌以及耐藥性情況[15-16]。本次研究旨在比較Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)與其他3種檢測方法檢測結(jié)核分枝桿菌的效能，并以藥敏實(shí)驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，分析其檢測利福平耐藥的應(yīng)用價(jià)值。

本研究采用可疑結(jié)核患者血液、痰標(biāo)本分別進(jìn)行T-spot實(shí)驗(yàn)、Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)、涂片鏡檢、液體培養(yǎng)以及傳統(tǒng)比例法藥敏實(shí)驗(yàn)檢測患者是否感染結(jié)核分枝桿菌及其對利福平耐藥情況。結(jié)果顯示，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)核分枝桿菌敏感性為56.9%，與國內(nèi)趙冰等[17]研究結(jié)果基本一致。Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)核分枝桿菌敏感性略高于T-spot實(shí)驗(yàn)，明顯高于痰涂片鏡檢、液體培養(yǎng)。一致性檢驗(yàn)結(jié)果表明，Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)與液體培養(yǎng)、T-spot實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果一致性較好。

研究表明將Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)檢測利福平耐藥情況應(yīng)用于耐藥高危人群（耐藥率>20%）中開展，檢測結(jié)果更具有價(jià)值[17]。以比例法藥敏實(shí)驗(yàn)作為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)檢測利福平耐藥的敏感性為88.9%，特異性為98.5%，與既往的研究[18-19]結(jié)果基本一致。但敏感性低于Boehme等[20]研究結(jié)果。由于本次研究中76例培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，耐藥率僅為11.8%，目標(biāo)人群利福平耐藥率較低，敏感性過低可能是由于利福平耐藥患者過少所致。因此世界衛(wèi)生組織建議如果在利福平耐藥率較低人群中應(yīng)用Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)檢測利福平耐藥情況，檢測結(jié)果為耐藥，樣本仍需采用藥敏實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證Xpert檢測結(jié)果。

綜上所述，Xpert MTB/RIF實(shí)驗(yàn)操作簡單、檢測快速、敏感性高并且對實(shí)驗(yàn)室要求較低，因此可以很好的輔助臨床醫(yī)生及時(shí)診斷目標(biāo)疾病，具有一定的使用前景。

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（收稿日期：2015-06-03 本文編輯：任 念）